CN107988320A

CN107988320A - 一种分子标签接头及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107988320A
Application number: CN201711102730.2A
Authority: CN
Inventors: 亢卉; 施巍炜; 秦公炜; 柳文进; 童欢; 程磊; 王凯
Original assignee: To Medical Science And Technology (shanghai) Co Ltd
Current assignee: To Medical Science And Technology (shanghai) Co Ltd
Priority date: 2017-11-10
Filing date: 2017-11-10
Publication date: 2018-05-04

Abstract

本发明公开了一种分子标签接头及其制备方法和应用。本发明首先保护一种核酸分子(分子标签接头)(又称核酸分子甲)，如序列表的序列5或序列表的序列6或序列表的序列7或序列表的序列8所示。本发明还保护一种核酸分子混合物(又称核酸分子甲混合物)，由序列表的序列5所示核酸分子、序列表的序列6所示核酸分子、序列表的序列7所示核酸分子和序列表的序列8所示核酸分子组成。本发明对于检测超低频基因变异具有重大的应用推广价值。超低频基因变异通常为外周血总DNA中的ctDNA，因此应用本发明可以更有效的辅助诊断或指导用药。

Description

一种分子标签接头及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因检测领域，涉及一种分子标签接头及其制备方法和应用，具体涉及在超低频基因变异检测中的应用。

背景技术

二代测序(Next-generation sequencing，NGS)，也称为高通量测序，能一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，可同步获得特定样本中数以十亿计的DNA碱基序列信息，是发现已知和未知基因变异的高效手段。

由于DNA的氧化损伤或脱氨基损伤、PCR扩增中DNA聚合酶引入的突变(每个碱基出现错误的概率在10^-6～10^-4之间)，尤其是在第一轮扩增引入错误，以及测序仪器读取碱基时引入的错误，测序得到的每个碱基出现错误的概率在10^-3～10^-2之间，即每1000个碱基就会出现1至10个错误碱基。因此，低于该频率的基因变异将无法准确检测。

肿瘤内异质性(intratumor heterogeneity)被认为是肿瘤发生发展内在的驱动力，尤其与肿瘤复发、耐药密切相关的亚克隆突变(subclonal mutations)的存在，这些基因变异在样本中占的比例低于1％，常规的测序方法是无法精准检测这些超低频基因变异。类似的，在肠道菌群、法医、古生物、进化、毒理学等基因组研究中同样面临这个问题。

目前，已经有针对超低频基因变异检测的建库测序方法，主要是在原始双链DNA分子模板两端引入分子标签序列unique identifiers(UIDs)，即molecular barcodes，但在实际应用中还是存在诸多局限性。第一种方法被称为Duplex Sequencing，是在Y型接头引入UID，数据分析时通过single-strand consensus sequences(SSCSs)和duplexconsensus sequences(DCSs)来矫正建库测序过程中引入的变异，这种方法不可避免接头的自我连接，建库效率低。第二种方法被称为SIP-HAVA-seq，基于Duplex Sequencing方法，合成10种UIDs通过退火形成发卡型接头，这种方法虽然降低了接头的自我连接，但是极大的降低了UIDs的种类，不利于数据矫正。

因此，仍需要对现有的超低频基因变异检测的建库测序方法进行改进，以提高对超低频基因变异检测的灵敏度。

发明内容

本发明的目的是提供一种分子标签接头及其制备方法和应用。

本发明首先保护一种核酸分子(分子标签接头)(又称核酸分子甲)，如序列表的序列5或序列表的序列6或序列表的序列7或序列表的序列8所示。所述核酸分子为单条核酸，自身形成具有一个粘末端的茎环结构。

本发明还保护一种核酸分子混合物(又称核酸分子甲混合物)，为混合物甲-Ⅰ或混合物甲-Ⅱ；

混合物甲-Ⅰ由序列表的序列5所示核酸分子、序列表的序列6所示核酸分子、序列表的序列7所示核酸分子和序列表的序列8所示核酸分子组成；

混合物甲-Ⅱ由如下四种核酸分子中的任意两种或任意三种组成：序列表的序列5所示核酸分子、序列表的序列6所示核酸分子、序列表的序列7所示核酸分子和序列表的序列8所示核酸分子。

所述核酸分子为单条核酸，自身形成具有一个粘末端的茎环结构。

本发明还保护一种核酸分子(接头引物)(又称核酸分子乙)，如序列表的序列1或序列表的序列2或序列表的序列3或序列表的序列4所示。所述核酸分子为单条核酸，自身形成部分双链结构。

本发明还保护一种核酸分子混合物(又称核酸分子乙混合物)，为混合物乙-Ⅰ或混合物乙-Ⅱ；

所述混合物乙-Ⅰ由序列表的序列1所示核酸分子、序列表的序列2所示核酸分子、序列表的序列3所示核酸分子和序列表的序列4所示核酸分子组成；

所述混合物乙-Ⅱ由如下四种核酸分子中的任意两种或任意三种组成：序列表的序列1所示核酸分子、序列表的序列2所示核酸分子、序列表的序列3所示核酸分子和序列表的序列4所示核酸分子。

所述核酸分子为单条核酸，自身形成部分双链结构。

本发明还保护一种制备核酸分子甲的方法，依次包括如下步骤：

(1)取核酸分子乙，进行退火，得到退火后的接头；

(2)将退火后的接头进行延伸，得到延伸后的接头；

(3)用限制性内切酶HpyCH4III酶切延伸后的接头，得到剪切后的接头，即为核酸分子甲；

所述核酸分子乙如序列表的序列1所示时，所述核酸分子甲如序列表的序列5所示；所述核酸分子乙如序列表的序列2所示时，所述核酸分子甲如序列表的序列6所示；所述核酸分子乙如序列表的序列3所示时，所述核酸分子甲如序列表的序列7所示；所述核酸分子乙如序列表的序列4所示时，所述核酸分子甲如序列表的序列8所示。

(1)取核酸分子乙，进行退火，得到退火后的接头；所述核酸分子乙的5’末端标记生物素；

(2)将退火后的接头进行延伸，得到延伸后的接头；

(3)用限制性内切酶HpyCH4III酶切延伸后的接头，然后用Dynabeads MyOneStreptavidin T1进行纯化，去除与Dynabeads MyOne Streptavidin T1结合的核酸分子，得到剪切后的接头，即为核酸分子甲；

本发明还保护一种制备核酸分子甲混合物的方法，依次包括如下步骤：

(1)分别将核酸分子乙-1、核酸分子乙-2、核酸分子乙-3和核酸分子乙-4进行如下操作：将核酸分子乙溶解于1×Low TE buffer，使其浓度为100μM，得到接头引物溶液；将40.00μL接头引物溶液和10.00μL 5×T4DNA ligase buffer混合，然后按如下步骤进行退火反应；95℃5分钟，72℃5分钟，60℃5分钟，50℃3分钟，40℃3分钟，30℃3分钟，20℃3分钟，10℃3分钟，4℃保存；完成退火反应后，将四种核酸分子乙相应的体系合并，得到200μL体系；

(2)将步骤(1)得到的200μL体系、27.90μL 10×NEBuffer 2、27.90μL 10mM dNTP、11.60μL 5U/μL Klenowexo-和11.60μL Nuclease-Free Water混匀，37℃孵育1小时；然后使用QIAquick Nucleotide Removal Kit进行核酸纯化，采用1×Low TE buffer进行洗脱，得到200μL的产物溶液；

(3)将步骤(2)得到的200μL产物溶液、50.00μL 10×NEB Cutsmart Buffer、235.00μL Nuclease-Free Water和15.00μL 5U/μL限制性内切酶HpyCH4III混匀，37℃孵育16小时；然后使用QIAquick Nucleotide Removal Kit进行核酸纯化，采用1×Low TEbuffer进行洗脱，得到30μL产物溶液；

(4)取100μL震荡均匀的Dynabeads MyOne Streptavidin T1，放置磁力架静置，弃除上清；然后加入200μL结合缓冲液，放置磁力架静置，弃除上清；然后加入200μL结合缓冲液，放置磁力架静置，弃除上清；然后加入200μL结合缓冲液和步骤(3)制备的30μL产物溶液，室温旋转混匀20min，然后收集上清液；然后将所述上清液用3M醋酸水溶液调pH值至7.5，然后使用QIAquick Nucleotide Removal Kit进行核酸纯化，采用1×Low TE buffer洗脱，得到50μL产物溶液，即为含有核酸分子甲混合物的溶液。

所述核酸分子乙-1如序列表的序列1所示，5’末端标记生物素；所述核酸分子乙-2如序列表的序列2所示，5’末端标记生物素；所述核酸分子乙-3如序列表的序列3所示，5’末端标记生物素；所述核酸分子乙-4如序列表的序列4所示，5’末端标记生物素。

所述核酸分子甲混合物为混合物甲-Ⅰ。

本发明还保护所述核酸分子甲或所述核酸分子甲混合物在检测超低频基因变异中的应用。

本发明还保护所述核酸分子甲或所述核酸分子甲混合物作为分子标签接头在用于制备检测超低频基因变异的试剂盒中的应用。

本发明还保护一种用于检测超低频基因变异的试剂盒，包括所述核酸分子甲或所述核酸分子甲混合物。所述试剂盒还包括引物S1、引物S2、引物S3和引物S4。所述试剂盒还包括USER酶和限制性内切酶HpyCH4III。所述引物S1如序列表的序列9所示。所述引物S2如序列表的序列10所示。所述引物S3如序列表的序列11所示。所述引物S4如序列表的序列12所示。

核酸分子甲中，NNNNNNNNNNNN为由12个随机核苷酸组成的分子标签序列。

核酸分子甲中，“NNNNNNNNNNNN”中，不存在4个以上连续相同的核苷酸。

核酸分子乙中，NNNNNNNNNNNN为由12个随机核苷酸组成的分子标签序列。

核酸分子乙中，“NNNNNNNNNNNN”中，不存在4个以上连续相同的核苷酸。

本发明提供了一种新型分子标签接头及其制备方法。本发明提供的新型分子标签接头，在发卡型接头上引入随机分子标签序列(UIDs)，降低接头的自我连接，提高建库效率；同时，增加分子标签的种类，有利于数据矫正。进一步，本发明将分子标签接头应用于超低频基因变异检测，通过SSCSs和DCSs矫正建库测序过程中引入的变异，极大的提高检测灵敏度。

本发明的主要优点在于：(1)提供的分子标签接头是发卡型接头，降低了接头的自我连接，提高建库效率；(2)提供的分子标签接头是通过接头引物合成、退火、延伸、酶切、纯化所得，接头引物中分子标签的随机合成以及DNA聚合酶的延伸保证了接头分子标签的随机性、多样性，有利于数据纠错矫正；(3)提供的一类分子标签接头，包含四种间隔序列，间隔序列有利于识别分子标签序列。同时，四种间隔序列有利于提高测序有效数据的产量。

本发明对于检测超低频基因变异具有重大的应用推广价值。超低频基因变异通常为外周血总DNA中的ctDNA，因此应用本发明可以更有效的辅助诊断或指导用药。

附图说明

图1为以分子标签接头1为例，用接头引物1制备分子标签接头1的流程示意图。

图2为接头引物的结构示意图。

图3为分子标签接头的结构示意图。

图4为分子标签接头1至分子标签接头4的结构示意图。

图5为标签接头混合物溶液的质检结果。

图6为应用分子标签接头进行超低频基因变异检测的流程示意图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。接头引物为单条核酸，自身形成部分双链结构。QIAquick Nucleotide Removal Kit，按照说明书进行操作，用于纯化大于17nt的寡核苷酸和40bp-10kb的DNA片段。AgencourtAMPure XP核酸纯化试剂盒(Beckman公司，货号A63881)，按说明书操作。

1×Low TE buffer：Thermo Fisher Scientific公司，货号12090-015。

5×T4DNA ligase buffer：Thermo Fisher Scientific公司，货号46300-018。

10×NEBuffer 2：NEB公司，货号B7002S。

Klenowexo-：Enzymatics公司，货号P7010-LC-L。

10×NEB Cutsmart Buffer：NEB公司，货号B7204S。

Dynabeads MyOne Streptavidin T1：Thermo Fisher Scientific公司，货号65602。

NEB FFPE DNA Repair Buffer：NEB公司，货号M6630S。

NEB FFPE DNA Repair Mix：NEB公司，货号M6630S。

KAPA End Repair&A-Tailing Buffer和KAPA End Repair&A-Tailing Enzyme：Kapa公司，货号KK8504。

连接酶和连接缓冲液：Kapa公司，货号KK8504。

2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix：Kapa公司，货号KK2801。

USER酶：NEB公司，货号M5505S。

Human Cot-1DNA：ThermoFish公司，货号15279011。

Blocking Oligos：IDT公司，货号1016190。

xGen 2×Hybridization Buffer：IDT公司，货号1072280。

xGen Hybridization Buffer Enhancer：IDT公司，货号1072280。

2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix：Kapa公司，货号KK8504。

实施例1、分子标签接头的制备

以分子标签接头1为例，用接头引物1制备分子标签接头1的流程示意图见图1。

接头引物的结构示意图见图2。

分子标签接头的结构示意图见图3。

分子标签接头1至分子标签接头4的结构示意图见图4。

一、接头引物合成

接头引物的核苷酸序列如下：

接头引物1(序列表的序列1)：

接头引物2(序列表的序列2)：

接头引物3(序列表的序列3)：

接头引物4(序列表的序列4)：

接头引物中，NNNNNNNNNNNN为由12个随机核苷酸组成的分子标签序列。

接头引物中，“NNNNNNNNNNNN”中，不存在4个以上连续相同的核苷酸。

接头引物中，下划线标注限制性内切酶HpyCH4III的识别序列。

接头引物中，方框标注的两个区段反向互补、形成茎环结构的双链区，它们之间的区段(不含方框标注区)形成茎环结构的单链环状区。

制备以上4种接头引物(4种接头引物的5’末端均标记生物素)。

二、接头引物退火

接头引物1进行退火，得到退火后的接头1。接头引物2进行退火，得到退火后的接头2。接头引物3进行退火，得到退火后的接头3。接头引物4进行退火，得到退火后的接头4；将四种退火后的接头等比例混合，得到退火后接头的混合物(annealed adaptor Mix)。

具体步骤：将步骤一制备的接头引物(接头引物1、接头引物2、接头引物3或接头引物4)溶解于1×Low TE buffer，使其浓度为100μM，得到接头引物溶液；按照表1制备反应体系，混匀后按照反应程序进行反应；将四种接头引物反应后的50μL体系合并，得到200μL体系。

表1

组分	体积(μL)
		接头引物溶液	40.00
5×T4DNA ligase buffer	10.00
		总计	50.00

反应程序：95℃5分钟，72℃5分钟，60℃5分钟，50℃3分钟，40℃3分钟，30℃3分钟，20℃3分钟，10℃3分钟，4℃保存。

三、接头延伸

将退火后的接头进行延伸，得到延伸后的接头(extended adaptors)。将退火后接头的混合物进行延伸，得到延伸后接头的混合物。

具体步骤：取1.5mL的EP管，按照表2制备反应体系，混匀后放置于PCR仪上，37℃孵育1小时；然后使用QIAquick Nucleotide Removal Kit进行核酸纯化，采用1×Low TEbuffer进行洗脱，得到200μL的产物溶液。

表2

组分	体积(μL)
		步骤二得到的200μL体系(含annealed adaptor Mix)	200.00
10×NEBuffer 2	27.90
		10mM dNTP	27.90
Klenowexo-(5U/μL)	11.60
		Nuclease-Free Water	11.60
总计	279.00

四、接头酶切

用限制性内切酶HpyCH4III酶切延伸后的接头，得到剪切后的接头(cutadaptors)。用限制性内切酶HpyCH4III酶切延伸后接头的混合物，得到剪切后接头的混合物。

具体步骤：取1.5mL的EP管，按照表3制备反应体系(按照从上至下的顺序加入组分)，混匀后放置于PCR仪上(热盖温度设置为47℃)，37℃孵育16小时；然后使用QIAquickNucleotide Removal Kit进行核酸纯化，采用1×Low TE buffer进行洗脱，得到30μL产物溶液。

表3

组分	体积(μL)
		步骤二得到的产物溶液(含extended adaptors)	200.00
10×NEB Cutsmart Buffer	50.00
		Nuclease-Free Water	235.00
限制性内切酶HpyCH4III(5U/μL)	15.00
		总计	500.00

五、接头纯化

用限制性内切酶HpyCH4III处理延伸后的接头以后，充分酶切的产物即为剪切后的接头(不再具有生物素标记)，被切除的小片段上带有生物素标记，未充分酶切的产物上具有生物素标记。Dynabeads MyOne Streptavidin T1可以结合生物素。因此，借助Dynabeads MyOne Streptavidin T1可以去除产物中的剪切后的接头以外的核酸片段。

1、取100μL震荡均匀的Dynabeads MyOne Streptavidin T1，放置磁力架静置，弃除上清。

2、完成步骤1后，加入200μL结合缓冲液，放置磁力架静置，弃除上清。

结合缓冲液(pH7.5)：1M NaCl、10mM Tris-HCl、1mM EDTA、0.01％(体积百分含量)Tween 20，余量为水。

3、完成步骤2后，加入200μL结合缓冲液，放置磁力架静置，弃除上清。

4、完成步骤3后，加入200μL结合缓冲液，加入步骤四制备的30μL产物溶液，室温旋转混匀20min，然后收集上清液。

5、取步骤4得到的上清液，用3M醋酸水溶液调pH值至7.5，然后使用QIAquickNucleotide Removal Kit进行核酸纯化，采用1×Low TE buffer洗脱，得到50μL产物溶液。

6、取步骤5得到的产物溶液，使用2100HS DNA芯片进行QC并测定浓度。结果见图5，显示单峰，片段单一，峰型正常。

7、取步骤5得到的产物溶液，用1×Low TE buffer调整至核酸浓度为15μM，得到含有分子标签接头的混合物的溶液，简称标签接头混合物溶液。

经测序，标签接头混合物溶液中具有如下四种分子标签接头：

分子标签接头1(序列表的序列5)：

分子标签接头2(序列表的序列6)：

分子标签接头3(序列表的序列7)：

分子标签接头4(序列表的序列8)：

分子标签接头中，NNNNNNNNNNNN为由12个随机核苷酸组成的分子标签序列。

分子标签接头中，“NNNNNNNNNNNN”中，不存在4个以上连续相同的核苷酸。

实施例2、应用分子标签接头进行超低频基因变异检测

流程示意图见图6。

一、文库构建

1、制备DNA样本，DNA样本由背景DNA和标准品DNA组成。

标准品DNA购自Horizon，涉及四个基因(EGFR基因、KRAS基因、NRAS基因和PIK3CA基因)的8种突变形式，具体见表4。

表4

染色体	基因	Entrez ID	突变类型	HGVS	氨基酸改变
						7p12	EGFR	1956	SNV	c.2573T>G	L858R
7p12	EGFR	1956	Deletion	c.2236_2250del15	ΔE746-A750
						7p12	EGFR	1956	SNV	c.2369C>T	T790M
7p12	EGFR	1956	Insertion	c.2300_2308dupCCAGCGTGG	V769-D770insASV
						12p12.1	KRAS	3845	SNV	c.35G>A	G12D
1p13.2	NRAS	4893	SNV	c.181C>A	Q61K
						1p13.2	NRAS	4893	SNV	c.175G>A	A59T
3q26.3	PIK3CA	5290	SNV	c.1633G>A	E545K

步骤1制备的DNA样本为实际应用中的DNA样本的模拟样本。实际应用中，进行超低频基因变异检测的对象为待测者的ctDNA，但用于检测的DNA样本通常为外周血血浆的总DNA，其中ctDNA的含量很低(相应的ctDNA中存在的靶基因变异为超低频基因变异)，很难实现高检出率。

2、取步骤1得到的DNA样本(DNA含量为30ng)，加入1×Low TE buffer至体积为53.5μL，然后加入6.5μL NEB FFPE DNA Repair Buffer和2μL NEB FFPE DNA Repair Mix，混匀后20℃孵育15min。

3、完成步骤2后，取整个反应后体系，采用Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒进行核酸纯化(洗脱液采用25μL 1×Low TE buffer)，收集核酸溶液(上清液)。

4、取步骤3得到的全部核酸溶液，与3.5μL KAPA End Repair&A-Tailing Buffer以及1.5μL KAPA End Repair&A-Tailing Enzyme混匀，先20℃孵育30min，再65℃孵育30min。

5、完成步骤4后，取整个反应后体系，加入2.5μL Nuclease-Free Water、15μL连接缓冲液、2.5μL实施例1制备的标签接头混合物溶液以及5μL连接酶，20℃孵育15min。

6、完成步骤5后，取整个反应后体系，采用Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒进行核酸纯化(洗脱液采用20μL 1×Low TE buffer)，收集核酸溶液(上清液)。

7、取步骤6得到的全部核酸溶液，加入25μL 2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix、2.5μL USER酶以及2.5μL Library Amplification Primer Mix，然后进行PCR扩增。

Library Amplification Primer Mix为引物混合液，含有两种引物(引物S1和引物S2)，浓度均为0.2μM。

引物S1(序列表的序列9)：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACG*A-3’；

引物S2(序列表的序列10)：

5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT*C-3’；

其中，引物序列中的“*”是指前后两个核苷酸中间的连接键具有硫代磷酸酯修饰。

PCR扩增的程序见表5。

表5

8、完成步骤7后，取整个反应后体系，采用AgencourtAMPure XP核酸纯化试剂盒进行核酸纯化(洗脱液采用10μL 1×Low TE buffer)，收集核酸溶液(上清液)，即为文库溶液。

经质检，10μL文库溶液中核酸含量为250ng-500ng，安捷伦2100胶图显示为单峰，无引物二聚体。

二、文库捕获

1、将5μg Human Cot-1DNA、2μL Blocking Oligos与10μl步骤一制备的文库溶液混合，然后置于真空浓缩仪中抽干，得到干粉。

2、文库与捕获探针杂交

按照表6配制反应体系，然后加入步骤1得到的干粉，涡旋混匀后室温孵育10min，然后95℃变性10min，然后转移至65℃的PCR仪(热盖温度设为75℃)中，加入4μl捕获探针组溶液，涡旋混匀后低速离心，然后65℃孵育4h。

捕获探针组溶液中含有用于捕获EGFR基因的全部外显子区域的捕获探针组、用于捕获KRAS基因的全部外显子区域的捕获探针组、用于捕获NRAS基因的全部外显子区域的捕获探针组和用于捕获PIK3CA基因的全部外显子区域的捕获探针组，每个捕获探针末端均具有生物素标记。

实际应用中，根据需要，可加入针对多种肿瘤相关基因的多种市售或定制的捕获探针组。

表6

3、完成步骤2后，取整个体系(17微升)，与链霉亲和素磁珠结合(实施例中具体使用Invitrogen公司的M-270Streptavidin beads，按照说明书要求进行操作，包括如下步骤：磁珠准备、共孵育、xGen Wash Buffer洗涤以去除未结合的核酸)，然后用18μl Nuclease-Free Water重悬磁珠，得到19μL磁珠悬液。

4、捕获后PCR

按表7制备反应体系，涡旋混匀后低速离心至管底，然后放置于定量PCR仪中进行PCR扩增，当看到扩增曲线达到平台期后即可停止。

表7

组分	体积(μL)
		2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix	25.00
引物S3(10μM)	2.50
		引物S4(10μM)	2.50
步骤3制备的磁珠悬液	19.00
		SYBR Green(1:800)	1.00
总计	50.00

引物S3(序列表的序列11)：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3’

引物S4(序列表的序列12)：

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATYYYYYYYYGTGACTGGAGTT*C-3’

其中，引物序列中的“*”是指前后两个核苷酸中间的连接键具有硫代磷酸酯修饰。其中，“YYYYYYYY”代表Index序列，实际应用中用于引入样本Index。

每个循环的反应程序如下：98℃45s，98℃15s，60℃30s，72℃30s。

5、PCR后纯化

完成步骤4后，取整个体系，放置磁力架静置，收集上清液，采用AgencourtAMPureXP核酸纯化试剂盒进行核酸纯化(洗脱液采用22μL 1×Low TE buffer)，收集核酸溶液(上清液)，即为捕获文库溶液。

捕获文库溶液进行质检：使用dsDNA HS Assay Kit检测核酸的浓度，使用LabChip GXII Touch检测捕获文库片段大小，均按照说明书要求进行操作。经质检，捕获文库溶液满足如下标准：浓度不低于0.5ng/μL,片段分布为单一峰，无引物二聚体。

三、上机测序以及数据分析

1、取步骤二得到的捕获文库溶液，进行二代测序，得到原始数据。

2、原始数据的预处理

依次进行如下步骤：原始数据进行格式转换；去掉分子标签接头，将分子标签序列添加到序列ID位置中去；比对到参考基因组。

3、重建测序扩增前的DNA分子

在步骤2的基础上，通过第一步添加到序列ID位置中的分子标签序列对测序序列(reads)进行聚类，具有相同分子标签序列的reads被认为来源于同一个起始DNA模板，被归为一个家簇(family)，仅保留同一分子标签的所有reads中都一致的突变信息，而对于同一famliy内部的reads特有的突变作为背景噪音进行去除，得到单链共有序列(single-strand consensus sequences,SSCs)。利用DNA的双链特性进行SSCs的数据纠错校正，从而还原成一条DNA分子，即双链共有序列(duplex consensus sequences,DCSs)。

4、基于重建后的分子进行突变分析

在步骤3的基础上，采用SNV、Indel、CNV、Fusion和Long-indel对突变类型进行分析和注释。

5、突变的过滤

在步骤4的基础上，对突变进行过滤(参数包括support reads的个数和方向，聚类时reads的个数等)。

进行15次重复试验。由于DNA样本中含有8个已知突变，15次重复试验检测的突变数量为120个，采用本发明的方法共检测到114个突变，检出率为95％。

采用Y型分子标签对上述DNA样本进行检测，进行15次重复试验。检测到84个突变，检出率为70％。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 至本医疗科技（上海）有限公司

<120> 一种分子标签接头及其制备方法和应用

<130> GNCYX171817

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 89

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(23)

<223> n is a, c, g or t

<400> 1

tcttctacag tnnnnnnnnn nnnagatcgg aagagcacac gtctgaactc cagtcuacac 60

tctttcccta cacgacgctc ttccgatct 89

<210> 2

<211> 90

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(24)

<223> n is a, c, g or t

<400> 2

tcttctacag tcnnnnnnnn nnnnagatcg gaagagcaca cgtctgaact ccagtcuaca 60

ctctttccct acacgacgct cttccgatct 90

<210> 3

<211> 91

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(25)

<223> n is a, c, g or t

<400> 3

tcttctacag tcannnnnnn nnnnnagatc ggaagagcac acgtctgaac tccagtcuac 60

actctttccc tacacgacgc tcttccgatc t 91

<210> 4

<211> 92

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(26)

<223> n is a, c, g or t

<400> 4

tcttctacag tcagnnnnnn nnnnnnagat cggaagagca cacgtctgaa ctccagtcua 60

cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat ct 92

<210> 5

<211> 95

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(14)

<223> n is a, c, g or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (81)..(92)

<223> n is a, c, g or t

<400> 5

gtnnnnnnnn nnnnagatcg gaagagcaca cgtctgaact ccagtcuaca ctctttccct 60

acacgacgct cttccgatct nnnnnnnnnn nnact 95

<210> 6

<211> 97

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(15)

<223> n is a, c, g or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (82)..(93)

<223> n is a, c, g or t

<400> 6

gtcnnnnnnn nnnnnagatc ggaagagcac acgtctgaac tccagtcuac actctttccc 60

tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nnngact 97

<210> 7

<211> 99

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(16)

<223> n is a, c, g or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (83)..(94)

<223> n is a, c, g or t

<400> 7

gtcannnnnn nnnnnnagat cggaagagca cacgtctgaa ctccagtcua cactctttcc 60

ctacacgacg ctcttccgat ctnnnnnnnn nnnntgact 99

<210> 8

<211> 101

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(17)

<223> n is a, c, g or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (84)..(95)

<223> n is a, c, g or t

<400> 8

gtcagnnnnn nnnnnnnaga tcggaagagc acacgtctga actccagtcu acactctttc 60

cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnn nnnnnctgac t 101

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acga 44

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atc 33

<210> 11

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

caagcagaag acggcatacg agatyyyyyy yygtgactgg agttc 45

Claims

1.一种核酸分子，如序列表的序列5或序列表的序列6或序列表的序列7或序列表的序列8所示。

2.一种核酸分子混合物，为混合物甲-Ⅰ或混合物甲-Ⅱ；

3.一种核酸分子，如序列表的序列1或序列表的序列2或序列表的序列3或序列表的序列4所示。

4.一种核酸分子混合物，为混合物乙-Ⅰ或混合物乙-Ⅱ；

5.一种制备核酸分子甲的方法，依次包括如下步骤：

(1)取核酸分子乙，进行退火，得到退火后的接头；所述核酸分子乙如序列表的序列1或序列表的序列2或序列表的序列3或序列表的序列4所示；

(2)将退火后的接头进行延伸，得到延伸后的接头；

6.一种制备核酸分子甲的方法，依次包括如下步骤：

(1)取核酸分子乙，进行退火，得到退火后的接头；所述核酸分子乙如序列表的序列1或序列表的序列2或序列表的序列3或序列表的序列4所示，其5’末端标记生物素；

(2)将退火后的接头进行延伸，得到延伸后的接头；

7.一种制备核酸分子甲混合物的方法，依次包括如下步骤：

(2)将步骤(1)得到的200μL体系、27.90μL 10×NEBuffer 2、27.90μL10mM dNTP、11.60μL 5U/μL Klenowexo-和11.60μL Nuclease-Free Water混匀，37℃孵育1小时；然后使用QIAquick Nucleotide Removal Kit进行核酸纯化，采用1×Low TE buffer进行洗脱，得到200μL的产物溶液；

(3)将步骤(2)得到的200μL产物溶液、50.00μL 10×NEB Cutsmart Buffer、235.00μLNuclease-Free Water和15.00μL 5U/μL限制性内切酶HpyCH4III混匀，37℃孵育16小时；然后使用QIAquick Nucleotide Removal Kit进行核酸纯化，采用1×Low TE buffer进行洗脱，得到30μL产物溶液；

(4)取100μL震荡均匀的Dynabeads MyOne Streptavidin T1，放置磁力架静置，弃除上清；然后加入200μL结合缓冲液，放置磁力架静置，弃除上清；然后加入200μL结合缓冲液，放置磁力架静置，弃除上清；然后加入200μL结合缓冲液和步骤(3)制备的30μL产物溶液，室温旋转混匀20min，然后收集上清液；然后将所述上清液用3M醋酸水溶液调pH值至7.5，然后使用QIAquick Nucleotide Removal Kit进行核酸纯化，采用1×Low TE buffer洗脱，得到50μL产物溶液，即为含有核酸分子甲混合物的溶液；

所述核酸分子乙-1如序列表的序列1所示，5’末端标记生物素；所述核酸分子乙-2如序列表的序列2所示，5’末端标记生物素；所述核酸分子乙-3如序列表的序列3所示，5’末端标记生物素；所述核酸分子乙-4如序列表的序列4所示，5’末端标记生物素；

所述核酸分子甲混合物为权利要求2所述的混合物甲-Ⅰ。

8.权利要求1所述核酸分子或权利要求2所述核酸分子混合物作为分子标签接头在检测超低频基因变异中的应用。

9.权利要求1所述核酸分子或权利要求2所述核酸分子混合物作为分子标签接头在用于制备检测超低频基因变异的试剂盒中的应用。

10.一种用于检测超低频基因变异的试剂盒，包括权利要求1所述核酸分子或权利要求2所述核酸分子混合物。