CN108913774A - 一种c-KIT体细胞突变基因检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种c‑KIT体细胞突变基因检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括用于检测c‑KIT体细胞基因突变引物和探针，具体为用于检测c‑KIT基因11号外显子的引物和探针，引物序列如SEQ ID NO：1‑6所示，探针序列如SEQ ID NO：7‑8所示；用于检测c‑KIT基因9号外显子的引物和探针，引物序列如SEQ ID NO：9‑10所示，探针序列如SEQ ID NO：11所示；用于检测c‑KIT基因13号外显子的引物和探针，引物序列如SEQ ID NO：12‑14所示，探针序列如SEQ ID NO：15所示；用于检测c‑KIT基因17号外显子的引物和探针，引物序列如SEQ ID NO：16‑19所示，探针序列如SEQ ID NO：20所示。本发明的检测试剂盒及检测方法检测位点数远比同类产品多、位点齐全、检测灵敏度高、特异性强、准确度高，成本低，可满足临床GIST靶向用药c‑KIT突变检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中核酸体外扩增检测，尤其涉及一种c-KIT体细胞突变基因检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
胃肠道间质瘤(GIST)是消化道最常见的间叶性肿瘤，也是肿瘤生物靶向治疗中的典范。绝大部分的GIST均表达c-KIT基因编码的Kit蛋白(CD117)，c-KIT基因位于人染色体4q12-13，属于原癌基因，其产物是Ⅲ型酪氨酸激酶，在分子层面上大部分的GIST均存在c-KIT基因突变，从而导致kit蛋白的活化不需要配体参与就能刺激肿瘤细胞的持续增殖和抗凋亡信号的失控。
伊马替尼(格列卫)是一种酪氨酸激酶抑制剂，经FDA批准可用于治疗转移性和手术难于切除病例的治疗以及部分高度侵袭危险性病例的术后预防性化疗。体外和体内实验已证明伊马替尼对GIST的疗效与有无基因突变及突变位点和类型密切相关，因此对GIST相关基因c-KIT突变检测具有很重要的意义。
GIST中c-KIT基因突变率约为90％，其突变形式呈多样性，其中位于11号外显子的变异最常见约占70-80％，位于9号外显子Ala502-Tyr503区段的6碱基重复突变约占10％，位于13号外显子的突变约占1％，而位于17号外显子的耐药突变约占1％，临床研究表明GIST中c-KIT基因的突变情况与格列卫分子靶向治疗的疗效相关，存在11号外显子突变的患者疗效最好，存在9号外显子及13号外显子突变的患者疗效次之，而野生型GIST的疗效最差。另外对于9号外显子突变的患者提高用药剂量可显著提高疗效，对于存在有17号外显子突变的患者对格列卫使用耐受，疗效不显著。因此检测c-KIT基因突变对于指导GIST患者的合理用药具有重要的参考价值。
目前，c-KIT基因突变的检测主要有Sanger测序法、高分辨率溶解曲线(HRM)法及ARMS-PCR法。其中Sanger测序法作为金标准准确度高，但其灵敏度低，耗时长，难以用于临床的检测；HRM法检测对仪器性能有更高的要求，且灵敏度也不高。此外也有几家公司应用荧光PCR法检测c-KIT突变，但检测位点仅限于1-2个，原因在于检测试剂中增加了阻断探针或者锁核酸修饰，检测成本高，检测位点数远少于临床所需检测数目，因此临床应用受限。
发明内容
为了克服现有技术的上述不足，本发明提出了一种c-KIT体细胞突变基因检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒和检测方法能检测共包含c-KIT基因11个突变位点，检测成本低，检测灵敏度可达到1％。
为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的第一个目的在于提出了一种用于检测c-KIT体细胞基因突变引物和探针，包括用于检测所述c-KIT基因11号外显子突变的引物和探针、用于检测所述c-KIT基因9号外显子突变的引物和探针、用于检测所述c-KIT基因13号外显子突变的引物和探针、用于检测所述c-KIT基因17号外显子突变的引物和探针；所述用于检测c-kit Exon11W557G突变的引物对为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5，检测探针为SEQ ID NO:7；所述用于检测c-kitExon11V559D突变的引物对为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5，检测探针为SEQ ID NO:7；所述用于检测c-kit Exon11V560D突变的引物对为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5，检测探针为SEQ IDNO:7；所述用于检测c-kit Exon11L576P突变的引物对为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6，检测探针为SEQ ID NO:8；所述用于检测c-kit Exon11W557K558del突变的引物对为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5，检测探针为SEQ ID NO:7；所述用于检测c-kit Exon9Y503F504insAY突变的引物对为SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10，检测探针为SEQ ID NO:11；所述用于检测c-kitExon13K642E突变的引物对为SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14，检测探针为SEQ ID NO:15；所述c-kit Exon13V654A突变检测引物对SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，检测探针SEQ ID NO:15；所述用于检测c-kit Exon17D816V突变的引物对为SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19，检测探针为SEQ ID NO:20；所述用于检测c-kitExon17N822K突变的引物对为SEQ ID NO:17、SEQID NO:19，检测探针为SEQ ID NO:20；所述用于检测c-kit Exon17N822K突变的引物对为SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19，检测探针为SEQ ID NO:20。
进一步地，所述探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
本发明的第二个目的在于提出一种c-KIT体细胞突变基因检测试剂盒，所述试剂盒包括PCR缓冲液、权利要求1所述的用于检测c-KIT体细胞基因突变引物和探针、DNA聚合酶、内参基因和外控基因。
进一步地，所述内参基因包括c-KIT内参特异性引物SEQ ID NO:21-22和c-KIT内参检测探针SEQ ID NO:23。
进一步地，所述外控基因包括c-KIT外控特异性引物SEQ ID NO:24-25和c-KIT外控检测探针SEQ ID NO:26。
进一步地，所述PCR缓冲液由Tris-KCl(pH8.0)、MgCl2(250mM)和dNTP(100mM)组成。
本发明的第三个目的在于提出一种利用上述试剂盒检测c-KIT体细胞突变基因的方法，包括如下步骤：
(1)配制三组PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品，每组PCR反应液包括反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ、反应液Ⅳ、反应液Ⅴ、反应液Ⅵ；所述反应液Ⅰ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO:1-3和SEQ ID NO:5、探针SEQ ID NO:7、内参混合物SEQ ID NO:21-23；所述反应液Ⅱ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6、探针SEQ ID NO:8、内参混合物SEQ ID NO:21-23；所述反应液Ⅲ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO:9-10、探针SEQ ID NO:11、内参混合物SEQ ID NO:21-23；所述反应液Ⅳ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO:12-14、探针SEQ ID NO:15、内参混合物SEQ ID NO:21-23；所述反应液Ⅴ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ IDNO:16-19、探针SEQ ID NO:20、内参混合物SEQ ID NO:21-23；所述反应液Ⅵ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、外控混合物SEQ ID NO:24-26；所述阳性质控品包含c-KIT基因11号外显子W557G、V559D、V560D、L576P、W557K558del突变质粒，9号外显子Y503F504insAY突变质粒，13号外显子K642E、V654A突变质粒，17号外显子D816V、N822K突变质粒；所述阴性质控品为18兆以上无核酸酶水；
(2)提取纯化待测样本DNA，并对提取的DNA进行浓度及纯度测定；
(3)将步骤(2)中已知浓度的DNA样本用TE稀释成2～20ng/μl；
(4)分别向第一组反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ、反应液Ⅳ、反应液Ⅴ、反应液Ⅵ中各加入2μl步骤(3)中已稀释备用的样本DNA作为模板；分别向第二组反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ、反应液Ⅳ、反应液Ⅴ、反应液Ⅵ中各加入2μl阳性质控品作为阳性对照；分别向第三组反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ、反应液Ⅳ、反应液Ⅴ、反应液Ⅵ中各加入2μl阴性质控品作为阴性对照；离心后上机扩增；
(5)设置PCR程序，实时荧光PCR检测；
(6)检测结果分析。
进一步地，所述步骤(1)中PCR反应液中每一种引物的终浓度均为100-400nm，每一种探针的终浓度均为100-400nm。
进一步地，所述步骤(5)中PCR扩增反应条件为：52℃30min，(95℃15s，60℃40s)×45cycles，60℃捕捉荧光信号。
进一步地，所述步骤(5)中荧光检测通道选择FAM、VIC检测通道，其中突变和外控通道选择FAM通道，内参选择VIC通道。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明的技术方案通过设计特异性高的引物及荧光探针，再配置成使用方便、检测结果可靠的试剂盒，设计出科学合理的PCR反应体系，使得本发明具有操作简单、检测速度快、检测敏感性高及特异性好等优点，特别适合在临床检验工作中普及应用。
(2)本发明的试剂盒设置了阴性对照和阳性对照，能分别有效地避免因污染造成的假阳性结果和评价本次扩增试剂质量是否达标；外控反应液能准确反映待测模板质量，防止因模板量不足或抑制剂过强引起的假阴性结果，也能监测因模板量过高可能造成的假阳性，同时在突变检测反应液中均添加了内参引物探针，通过内参的扩增能有效避免假阴性出现，最终确保试剂盒检测结果准确无误。
(3)本发明的检测试剂盒及检测方法检测位点数远比同类产品多、位点齐全、检测灵敏度高、特异性强、成本低，可满足临床GIST靶向用药c-KIT突变检测。
附图说明
图1为实施例2中20170515样本扩增曲线。
图2为实施例2中20170517样本扩增曲线。
图3为实施例2中20180109样本扩增曲线。
图4为实施例2中20180213-1样本扩增曲线。
图5为实施例2中20180213-2样本扩增曲线。
具体实施方式
展示以下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。所用基因序列的来源为NCBI(美国国立生物技术信息中心)。
实施例1：
本发明提出了一种用于检测c-KIT体细胞基因突变引物和探针，包括用于检测所述c-KIT基因11号外显子突变的引物和探针、用于检测所述c-KIT基因9号外显子突变的引物和探针、用于检测所述c-KIT基因13号外显子突变的引物和探针、用于检测所述c-KIT基因17号外显子突变的引物和探针；所述用于检测c-kit Exon11W557G突变的引物对为SEQID NO:1、SEQ ID NO:5，检测探针为SEQ ID NO:7；所述用于检测c-kit Exon11V559D突变的引物对为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5，检测探针为SEQ ID NO:7；所述用于检测c-kitExon11V560D突变的引物对为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5，检测探针为SEQ ID NO:7；所述用于检测c-kit Exon11L576P突变的引物对为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6，检测探针为SEQ IDNO:8；所述用于检测c-kit Exon11W557K558del突变的引物对为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5，检测探针为SEQ ID NO:7；所述用于检测c-kit Exon9Y503F504insAY突变的引物对为SEQID NO:9、SEQ ID NO:10，检测探针为SEQ ID NO:11；所述用于检测c-kit Exon13K642E突变的引物对为SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14，检测探针为SEQ ID NO:15；所述c-kitExon13V654A突变检测引物对SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，检测探针SEQ ID NO:15；所述用于检测c-kit Exon17D816V突变的引物对为SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19，检测探针为SEQ ID NO:20；所述用于检测c-kit Exon17N822K突变的引物对为SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:19，检测探针为SEQ ID NO:20；所述用于检测c-kit Exon17N822K突变的引物对为SEQID NO:18、SEQ ID NO:19，检测探针为SEQ ID NO:20。其中检测探针均为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有非荧光淬灭基团，本实施例中的检测探针如下：
①c-KIT Exon11检测探针SEQ ID NO:7
5`-FAM-aggagataaatggaaacaa-MGB-3`
②c-KIT Exon11检测探针SEQ ID NO:8
5`-FAM-caggctgagttttggtc-MGB-3`
③c-KIT Exon9检测探针SEQ ID NO:11
5`-FAM-taaaggtaacaacaaaggtatatt-MGB-3`
④c-KIT Exon13检测探针SEQ ID NO:15
5`-FAM-atctacttggagcctgcaccattggag-BHQ1-3`
⑤c-KIT Exon17检测探针SEQ ID NO20：
5`-FAM-tacccattctctgcttgacagtcctgc-BHQ1-3`
⑥c-KIT内参检测探针SEQ ID NO23：
5`-VIC-agacttaatagtccgcgtgggcgacg-BHQ1-3`
⑦c-KIT外控检测探针SEQ ID NO26：
5`-FAM-agacttaatagtccgcgtgggcgacg-BHQ1-3`
本发明还提出一种c-KIT体细胞突变基因检测试剂，所述试剂包含上述的用于检测c-KIT体细胞基因突变引物和探针。
一种c-KIT体细胞突变基因检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液、上述的用于检测c-KIT体细胞基因突变引物和探针、DNA聚合酶、内参基因和外控基因。其中内参基因包括c-KIT内参特异性引物SEQ ID NO:21-22和c-KIT内参检测探针SEQ ID NO:23。外控基因包括c-KIT外控特异性引物SEQ ID NO:24-25和c-KIT外控检测探针SEQ ID NO:26。PCR缓冲液由Tris-KCl(pH8.0)、MgCl2(250mM)和dNTP(100mM)组成。DNA聚合酶采用热启动Taq酶，每个反应用量为1U。具体的本试剂盒包括6种反应液和2种质控品，分别为反应液Ⅰ，反应液Ⅱ，反应液Ⅲ，反应液Ⅳ，反应液Ⅴ，反应液Ⅵ，阳性质控品，阴性质控品。每种反应液都包含有PCR缓冲液、对应的引物和探针、DNA聚合酶。反应液Ⅰ包含但不限于检测c-kit Exon11W557G、V559D、V560D，W557K558del突变，包含突变检测引物探针混合物SEQ ID NO：1-3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7、内参混合物SEQ ID NO：21-23。反应液Ⅱ包含但不限于检测c-kitExon11L576P突变，包含突变检测引物探针混合物SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8，内参混合物SEQ ID NO：21-23。反应液Ⅲ包含但不限于检测c-kit Exon9Y503F504insAY突变，包含突变检测引物探针混合物SEQ ID NO：9-11，内参混合物SEQ ID NO：21-23。反应液Ⅳ包含但不限于检测c-kit Exon13K642E、V654A突变，包含突变检测引物探针混合物SEQID NO：12-15，内参混合物SEQ ID NO：21-23。反应液Ⅴ包含但不限于检测c-kitExon17D816V、N822K突变，包含突变检测引物探针混合物SEQ ID NO：16-20，内参引物探针混合物SEQ ID NO：21-23。反应液Ⅵ包含c-kit外控扩增引物及检测探针，包含c-kit外控引物探针混合物SEQ ID NO：24-26。阳性质控品包含上述c-kit涉及的11种突变质粒混合物。阴性质控品为18兆以上无核酸酶水。
利用上述试剂盒检测c-KIT体细胞突变基因的方法，包括如下步骤：
(1)配制三组PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品，每组PCR反应液包括反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ、反应液Ⅳ、反应液Ⅴ、反应液Ⅵ；所述反应液Ⅰ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO：1-3和SEQ ID NO：5、探针SEQ ID NO：7、内参混合物SEQ ID NO：21-23；所述反应液Ⅱ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6、探针SEQ ID NO：8、内参混合物SEQ ID NO：21-23；所述反应液Ⅲ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO：9-10、探针SEQ ID NO：11、内参混合物SEQ ID NO：21-23；所述反应液Ⅳ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO：12-14、探针SEQ ID NO：15、内参混合物SEQ ID NO：21-23；所述反应液Ⅴ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ IDNO：16-19、探针SEQ ID NO：20、内参混合物SEQ ID NO：21-23；所述反应液Ⅵ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、外控混合物SEQ ID NO：24-26；所述阳性质控品包含c-KIT基因11号外显子W557G、V559D、V560D、L576P、W557K558del突变质粒，9号外显子Y503F504insAY突变质粒，13号外显子K642E、V654A突变质粒，17号外显子D816V、N822K突变质粒，本发明的突变质粒是将突变序列插入到PUC57载体上形成的，每一个突变类型都有一个对应的PUC57质粒；所述阴性质控品为18兆以上无核酸酶水；上述PCR反应液中，每一种引物在PCR反应液中的终浓度均为100-400nm，每一种探针在PCR反应液中的终浓度均为100-400nm。
(2)提取纯化待测样本DNA，并对提取的DNA进行浓度及纯度测定；
所述待测样本可以为新鲜血液或FFPE肿瘤组织，新鲜血液(EDTA抗凝管必须在4小时以内离心取血浆，streck管必须在24小时以内离心取血浆)离心获取血浆，采用QIAampCirculating Nucleic Acid Kit纯化血浆游离DNA；FFPE肿瘤组织采用GeneRead DNA FFPEKit或天根FFPE组织提取试剂盒提取肿瘤组织DNA。用nanodrop2000对提取的DNA进行浓度及纯度测定，260/280在1.7-2.1之间
(3)将步骤(2)中已知浓度的DNA样本用TE稀释成5ng/μl备用；
(4)分别向第一组反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ、反应液Ⅳ、反应液Ⅴ、反应液Ⅵ中各加入2μl步骤(3)中已稀释备用的样本DNA作为模板；分别向第二组反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ、反应液Ⅳ、反应液Ⅴ、反应液Ⅵ中各加入2μl阳性质控品作为阳性对照；分别向第三组反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ、反应液Ⅳ、反应液Ⅴ、反应液Ⅵ中各加入2μl阴性质控品作为阴性对照；全部离心后上机扩增。
①所述反应液Ⅰ总体积为23μL，各组分浓度或含量如下：
反应液Ⅰ：
反应液Ⅰ中突变检测引物SEQ ID NO：1(10μM)0.5μl，SEQ ID NO：2(10μM)0.5μl，SEQ ID NO：3(10μM)0.5μl，SEQ ID NO：5(10μM)0.5μl，突变检测探针SEQ ID NO：7(10μM)0.5μl，内参引物SEQ ID NO：21(10μM)0.125μl，SEQ ID NO：22(10μM)0.125μl，内参探针SEQID NO：23(10μM)0.25μl。
②所述反应液Ⅱ总体积为23μL，各组分浓度或含量如下：
反应液Ⅱ：
反应液Ⅱ中突变检测引物SEQ ID NO：4(10μM)0.5μl，SEQ ID NO：6(10μM)0.5μl，突变检测探针SEQ ID NO：8(10μM)0.5μl，内参引物SEQ IDNO：21(10μM)0.1875μl，SEQ IDNO：22(10μM)0.1875μl，内参探针SEQ ID NO：23(10μM)0.25μl。
③所述反应液Ⅲ总体积为23μL，各组分浓度或含量如下：
反应液Ⅲ：
反应液Ⅲ中突变检测引物SEQ ID NO：9(10μM)0.5μl，SEQ ID NO：10(10μM)0.5μl，突变检测探针SEQ ID NO：11(10μM)0.5μl，内参引物SEQ ID NO：21(10μM)0.125μl，SEQ IDNO：22(10μM)0.125μl，内参探针SEQ ID NO：23(10μM)0.25μl。
④所述反应液Ⅳ总体积为23μL，各组分浓度或含量如下：
反应液Ⅳ：
反应液Ⅳ中突变检测引物SEQ ID NO：12(10μM)0.5μl，SEQ ID NO：13(10μM)0.5μl，SEQ ID NO：14(10μM)0.5μl，突变检测探针SEQ ID NO：15(10μM)0.5μl，内参引物SEQ IDNO：21(10μM)0.1875μl，SEQ ID NO：22(10μM)0.1875μl，内参探针SEQ ID NO：23(10μM)0.25μl。
⑤所述反应液Ⅳ总体积为23μL，各组分浓度或含量如下：
反应液Ⅴ：
反应液Ⅴ中突变检测引物SEQ ID NO：16(10μM)0.5μl，SEQ ID NO：17(10μM)0.5μl，SEQ ID NO：18(10μM)0.5μl，SEQ ID NO：19(10μM)0.5μl，突变检测探针SEQ ID NO：20(10μM)0.5μl，内参引物SEQ ID NO：21(10μM)0.1875μl，SEQ ID NO：22(10μM)0.1875μl，内参探针SEQ ID NO：23(10μM)0.25μl。
⑥所述反应液Ⅳ总体积为23μL，各组分浓度或含量如下：
反应液Ⅵ：
反应液Ⅵ中外控引物SEQ ID NO：24(10μM)0.5μl，SEQ ID NO：25(10μM)0.5μl，外控检测探针SEQ ID NO：26(10μM)0.5μl。
(5)设置PCR程序，实时荧光PCR检测
荧光检测通道选择FAM，VIC/HEX检测通道，其中突变和外控通道选择FAM通道，内参选择VIC通道。
PCR程序为：52℃30min，(95℃15s，60℃40s)×45cycles，60℃同时收集2种荧光信号。
(6)检测结果分析
①阴性质控品：FAM通道、VIC通道无扩增曲线，或者扩增曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长期，Ct值≥40。
②阳性质控品：FAM通道Ct值≤34，VIC通道Ct值＜38，扩增曲线有明显指数增长期。
③外控反应液：FAM通道Ct值27≤Ct≤34，样本DNA加入量适中；FAM通道Ct值＞34，样本基因组DNA提取质量较差，只有突变DNA含量较高的样本可以检测出突变，突变DNA含量较低的样本建议重新提取样本，增加基因组DNA加入量；FAM通道Ct值＜27，样本加入量过高，建议稀释后重新检测。
④样本突变类型判定标准
表1
实施例2：利用实施例1的试剂盒进行临床样本c-KIT体细胞突变基因检测
1、选取临床上已知结果的5个GIST FFPE样本。
2、采用Qiagen GeneRead DNAFFPE Kit提取上述5个临床样本DNA。
3、运用nanodrop2000测定上述5个样本DNA浓度及纯度，结果如下：
表2
| 样本号 | 突变类型 | 浓度(ng/μl) | 260/280 |
| 20170515 | W557K558del | 84.5 | 1.96 |
| 20170517 | D816V | 75.0 | 1.82 |
| 20180109 | K642E | 42.6 | 1.72 |
| 20180213-1 | 野生型 | 92.2 | 1.80 |
| 20180213-2 | Y503F504insAY | 55.4 | 1.75 |
4、将步骤3中已知浓度的DNA样本用TE稀释成5ng/μL备用
表3
| 样本号 | 样本浓度(ng/μl) | 样本体积(μl) | TE体积(μl) | 终浓度(ng/μl) |
| 20170515 | 84.5 | 5 | 79.5 | 5 |
| 20170517 | 75.0 | 5 | 70 | 5 |
| 20180109 | 42.6 | 5 | 37.6 | 5 |
| 20180213-1 | 92.2 | 5 | 87.2 | 5 |
| 20180213-2 | 55.4 | 5 | 50.4 | 5 |
5、从-20℃冰箱拿出7组已制备分装好的PCR反应液，放室温完全融化，短暂离心，每个样本对应1组PCR反应液，每个反应孔加2μl上述待检样本DNA；阳性质控对应1组PCR反应液，每个反应孔中加2μl阳性质控品；阴性质控对应1组PCR反应液，每个反应孔中加2μl阴性质控品。
6、全部离心后上机扩增
热循环条件：52℃30min，95℃10min，(95℃15s，60℃40s)×45cycles，60℃同时收集2种荧光信号。
7、扩增结果分析
扩增结果显示：
①阴性质控品FAM、VIC通道均没有扩增曲线
②阳性质控品FAM通道Ct值均小于28，VIC通道Ct值均小于38
③外控反应液FAM通道Ct值均在27≤Ct≤34之间
因此，样本质控均合格，可根据突变类型判定标准对样本突变有无及突变类型进行判定。
由发明的突变检测试剂盒检测的5例GIST FFPE临床样本，在质控及样本量均符合试剂盒规定条件下，得到检测结果如下：
①如图1所示，20170515样本在反应液Ⅰ中有突变扩增曲线，Ct＝32.75，表明存在c-kit Exon11W557G、V559D、V560D，W557K558del中的某个位点突变，而该样本已知结果为W557K558del，说明本试剂盒突变检测结果与真实结果一致。
②如图2所示，20170517样本在反应液Ⅴ中有突变扩增曲线，Ct＝34.81，表明存在c-kit Exon17D816V、N822K中的某个位点突变，而该样本已知结果为D816V突变，说明本试剂盒突变检测结果与真实结果一致。
③如图3所示，20180109样本在反应液Ⅳ中有突变扩增曲线，Ct＝33.76，表明存在c-kit Exon13K642E，V654A中的某个位点突变，而该样本已知结果为K642E突变，说明本试剂盒突变检测结果与真实结果一致。
④如图4所示，20180213-1样本在5种反应液中均无突变扩增曲线，表明该样本不存在本试剂盒能检测到的11种突变，而该样本已知结果为野生型，说明本试剂盒检测结果与真实结果一致。
⑤如图5所示，20180213-2样本在反应液Ⅲ中有突变扩增曲线，Ct＝33.92，表明存在c-kit Exon9Y503F504insAY突变，而该样本已知结果为Y503F504insAY突变，说明本试剂盒突变检测结果与真实结果一致。
序列表
<110> 良培基因生物科技（武汉）有限公司
<120> 一种c-KIT体细胞突变基因检测试剂盒及其检测方法
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaacccatgt atgaagtaaa gg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atgtatgaag taaagtggaa gga 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgaagtacag tggaaggttt a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtttacatag acccaataca atc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggaagttgtg ttgggtctat gtaa 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaagtcactg ttatgtgtac ccaa 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aggagataaa tggaaacaa 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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caagacttct gcctatgcct at 22
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agcctaaaca tccccttaaa ttg 23
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taaaggtaac aacaaaggta tatt 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agccctcatg tctgaactag 20
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ccttggtaat cacatgaata tttc 24
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caataaaagg cagcttggac ac 22
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atctacttgg agcctgcacc attggag 27
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgattttggt ctagccagac t 21
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ccagagacat caagaatgaa tctatg 26
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cagagacatc aaaaatgatt ctaaa 25
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<212> DNA
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ggatcagtgc ataacagcct aat 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
agacttaata gtccgcgtgg gcgacg 26
Claims (10)
1.一种用于检测c-KIT体细胞基因突变引物和探针，其特征在于，包括用于检测所述c-KIT基因11号外显子突变的引物和探针、用于检测所述c-KIT基因9号外显子突变的引物和探针、用于检测所述c-KIT基因13号外显子突变的引物和探针、用于检测所述c-KIT基因17号外显子突变的引物和探针；所述用于检测c-kit Exon11W557G突变的引物对为SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:5，检测探针为SEQ ID NO:7；所述用于检测c-kit Exon11V559D突变的引物对为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5，检测探针为SEQ ID NO:7；所述用于检测c-kitExon11V560D突变的引物对为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5，检测探针为SEQ ID NO:7；所述用于检测c-kit Exon11L576P突变的引物对为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6，检测探针为SEQ IDNO:8；所述用于检测c-kit Exon11W557K558del突变的引物对为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5，检测探针为SEQ ID NO:7；所述用于检测c-kit Exon9Y503F504insAY突变的引物对为SEQID NO:9、SEQ ID NO:10，检测探针为SEQ ID NO:11；所述用于检测c-kit Exon13K642E突变的引物对为SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14，检测探针为SEQ ID NO:15；所述c-kitExon13V654A突变检测引物对SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，检测探针SEQ ID NO:15；所述用于检测c-kit Exon17D816V突变的引物对为SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19，检测探针为SEQ ID NO:20；所述用于检测c-kit Exon17N822K突变的引物对为SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:19，检测探针为SEQ ID NO:20；所述用于检测c-kit Exon17N822K突变的引物对为SEQID NO:18、SEQ ID NO:19，检测探针为SEQ ID NO:20。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测c-KIT体细胞基因突变引物和探针，其特征在于，所述探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
3.一种c-KIT体细胞突变基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR缓冲液、权利要求1所述的用于检测c-KIT体细胞基因突变引物和探针、DNA聚合酶、内参基因和外控基因。
4.根据权利要求3所述的一种c-KIT体细胞突变基因检测试剂盒，其特征在于，所述内参基因包括c-KIT内参特异性引物SEQ ID NO:21-22和c-KIT内参检测探针SEQ ID NO:23。
5.根据权利要求3所述的一种c-KIT体细胞突变基因检测试剂盒，其特征在于，所述外控基因包括c-KIT外控特异性引物SEQ ID NO:24-25和c-KIT外控检测探针SEQ ID NO:26。
6.根据权利要求3所述的一种c-KIT体细胞突变基因检测试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液由Tris-KCl(pH8.0)、MgCl2(250mM)和dNTP(100mM)组成。
7.一种利用权利要求3-6所述任一项所述试剂盒检测c-KIT体细胞突变基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制三组PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品，每组PCR反应液包括反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ、反应液Ⅳ、反应液Ⅴ、反应液Ⅵ；所述反应液Ⅰ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO:1-3和SEQ ID NO:5、探针SEQ ID NO:7、内参混合物SEQ ID NO:21-23；所述反应液Ⅱ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6、探针SEQ ID NO:8、内参混合物SEQ ID NO:21-23；所述反应液Ⅲ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO:9-10、探针SEQ ID NO:11、内参混合物SEQ ID NO:21-23；所述反应液Ⅳ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO:12-14、探针SEQ ID NO:15、内参混合物SEQ ID NO:21-23；所述反应液Ⅴ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO:16-19、探针SEQ ID NO:20、内参混合物SEQ ID NO:21-23；所述反应液Ⅵ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、外控混合物SEQ ID NO:24-26；所述阳性质控品包含c-KIT基因11号外显子W557G、V559D、V560D、L576P、W557K558del突变质粒，9号外显子Y503F504insAY突变质粒，13号外显子K642E、V654A突变质粒，17号外显子D816V、N822K突变质粒；所述阴性质控品为18兆以上无核酸酶水；
(2)提取纯化待测样本DNA，并对提取的DNA进行浓度及纯度测定；
(3)将步骤(2)中已知浓度的DNA样本用TE稀释成2～20ng/μl；
(4)分别向第一组反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ、反应液Ⅳ、反应液Ⅴ、反应液Ⅵ中各加入2μl步骤(3)中已稀释备用的样本DNA作为模板；分别向第二组反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ、反应液Ⅳ、反应液Ⅴ、反应液Ⅵ中各加入2μl阳性质控品作为阳性对照；分别向第三组反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ、反应液Ⅳ、反应液Ⅴ、反应液Ⅵ中各加入2μl阴性质控品作为阴性对照；离心后上机扩增；
(5)设置PCR程序，实时荧光PCR检测；
(6)检测结果分析。
8.根据权利要求7所述的一种检测c-KIT体细胞突变基因的方法，其特征在于，所述步骤(1)中PCR反应液中每一种引物的终浓度均为100-400nm，每一种探针的终浓度均为100-400nm。
9.根据权利要求7所述的一种检测c-KIT体细胞突变基因的方法，其特征在于，所述步骤(5)中PCR扩增反应条件为：52℃30min，(95℃15s，60℃40s)×45cycles，60℃捕捉荧光信号。
10.根据权利要求7所述的一种检测c-KIT体细胞突变基因的方法，其特征在于，所述步骤(5)中荧光检测通道选择FAM、VIC检测通道，其中突变和外控通道选择FAM通道，内参选择VIC通道。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109402250A (zh) * | 2018-12-11 | 2019-03-01 | 良培基因生物科技（武汉）有限公司 | 一种用于scid遗传病筛查的引物、检测试剂盒及检测方法 |
| CN114058701A (zh) * | 2021-10-27 | 2022-02-18 | 上海科亦生物科技有限公司 | 一种C-kit和PDGFR突变检测试剂盒 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007059154A2 (en) * | 2005-11-14 | 2007-05-24 | Bayer Healthcare Llc | Treatment of cancers with acquired resistance to kit inhibitors |
| CN104328184A (zh) * | 2014-10-30 | 2015-02-04 | 武汉百泰基因工程有限公司 | 一种用于检测C-kit基因突变的引物、探针、锁核酸探针、试剂盒及检测方法 |
| CN107723362A (zh) * | 2016-08-11 | 2018-02-23 | 北京雅康博生物科技有限公司 | 用于检测c‑kit基因1675‑1681位突变的引物、探针及试剂盒 |
-
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007059154A2 (en) * | 2005-11-14 | 2007-05-24 | Bayer Healthcare Llc | Treatment of cancers with acquired resistance to kit inhibitors |
| CN104328184A (zh) * | 2014-10-30 | 2015-02-04 | 武汉百泰基因工程有限公司 | 一种用于检测C-kit基因突变的引物、探针、锁核酸探针、试剂盒及检测方法 |
| CN107723362A (zh) * | 2016-08-11 | 2018-02-23 | 北京雅康博生物科技有限公司 | 用于检测c‑kit基因1675‑1681位突变的引物、探针及试剂盒 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| HILLIER,L.W.等: "Homo sapiens chromosome 4, GRCh38.p12 Primary Assembly", 《GENBANK》 * |
| LEONIDAS MAVROEIDIS等: "Comprehensive molecular screening by next generation sequencing reveals a distinctive mutational profile of KIT/PDGFRA genes and novel genomic alterations: results from a 20-year cohort of patients with GIST from north-western Greece", 《ESMO OPEN》 * |
| 吴晶晶等: "胃大、小胃肠道间质瘤临床病理特征及c-Kit基因突变的比较", 《临床与实验病理学杂志》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109402250A (zh) * | 2018-12-11 | 2019-03-01 | 良培基因生物科技（武汉）有限公司 | 一种用于scid遗传病筛查的引物、检测试剂盒及检测方法 |
| CN114058701A (zh) * | 2021-10-27 | 2022-02-18 | 上海科亦生物科技有限公司 | 一种C-kit和PDGFR突变检测试剂盒 |
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