CN106701905A - 一种用于急性髓细胞白血病预后分层的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供能够快速地检测多基因/多位点突变的、一种用于急性髓细胞白血病预后分层的试剂盒。本发明能够全面的检测到突变位点，且检测的灵敏度高，在一天内就可以完成从样本制备到出具报告的整个实验流程，检测结果快速准确，覆盖度高，同时可有效的对AML的预后分析提供快速的指导。

Description

一种用于急性髓细胞白血病预后分层的试剂盒
技术领域
本发明涉及可用于急性髓细胞白血病预后分层的试剂盒，属于分子检测技术领域。
背景技术
急性髓细胞白血病(Acute Myelocytic Leukemia,简称AML)是一种具有显著异质性的血液恶性克隆性疾病。即使AML患者预后良好，也仍有40％的患者复发，5年以上长期生存率不足50％，该类患者同时具有c-kit突变复发率高达70％，一旦复发，预后极差，异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)也不能改善其预后。因此，尽早识别高危复发人群，采用包括造血干细胞移植在内的手段对这些患者进行抢先治疗，有可能改善预后。细胞遗传学改变很大程度上影响了患者的治疗和预后，随着科技的不断进步，越来越多的预后相关因素被确认：(1)基因突变；(2)细胞遗传学诊断；(3)临床表现，包括年龄、WBC以及临床表现等；(4)治疗后微小残留病灶(MRD)的下降速度等。其中，基因突变是影响预后的关键因素之一。
基因突变中最常见的是CEBPA、FLT3-ITD和NMP1的基因突变，其发生率分别约为15％、35％和20％[非专利文献1～4]。由于在AML病例中普遍存在多基因多突变共存的现象，因而系统地检测多基因/多位点的突变更有助于AML的预后分层，也有助于确定治疗方案和预测病人对治疗的反应。
此外，临床检验往往要求在短时间内(例如一个工作日)完成从样品制备到出具报告的整个检验流程。
因此，需要能够快速地、准确地检测多基因/多位点突变的、用于急性髓细胞白血病预后分层的试剂盒及检测方法。
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种能够快速地检测多基因/多位点突变的、用于急性髓细胞白血病预后分层的试剂盒及检测方法。
即，本发明包括：
1.一种用于急性髓细胞白血病预后分层的试剂盒，其包括用于检测FLT3基因的ITD区或其片段的引物组1、用于检测NPM1基因或其片段的引物组2、以及用于检测CEBPA基因或其片段的引物组3；
所述每个引物组均包括上游引物和下游引物，且所述上游引物和下游引物中的至少一个是经过荧光分子标记的。
2.根据项1所述的试剂盒，其中，所述荧光分子选自FAM、HEX、TET、VIC、Cy3、Cy5和ROX7。
3.根据项1或2所述的试剂盒，其中，对于用于检测大小相近的基因或其片段的各引物组，采用不同的荧光分子进行标记。
4.根据项1～3中任一项所述的试剂盒，其中，
所述引物组1由核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物组成；
所述引物组2由核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物组成；和
所述引物组3是下述引物组31～34：
引物组31，其由核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的下游引物组成；
引物组32，其由核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的下游引物组成；
引物组33，其由核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示的下游引物组成；和
引物组34，其由核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示的下游引物组成。
5.根据项1所述的试剂盒，其中，该试剂盒还包括选自用于提取基因组DNA的试剂或装置、用于PCR扩增反应的试剂或装置、用于提取总RNA的试剂或装置、用于反转录的试剂或装置、以及用于多重荧光毛细管凝胶电泳的试剂或装置中的一种或多种。
6.根据项1所述的试剂盒，其中，该试剂盒以从人全血或骨髓中提取的基因组DNA作为操作对象。
7.一种同时检测受试者的FLT3基因的ITD区、NPM1基因和CEBPA基因的基因突变的方法，其使用项1～6中任一项所述的试剂盒，其包括：
A.以所述引物组1作为引物，以来自受试者的样本的基因组DNA作为模板，扩增样本的FLT3基因的ITD区或其片段，得到扩增产物A；
B.以所述引物组2作为引物，以来自受试者的样本的基因组DNA作为模板，扩增样本的NPM1基因或其片段，得到扩增产物B；
C.以所述引物组3作为引物，以由来自受试者的样本的总RNA反转录得到的cDNA作为模板，扩增样本的CEBPA基因或其片段，得到扩增产物C；
D.将上述扩增产物A、扩增产物B和扩增产物C混合，得到混合试样，并对该混合试样进行多重荧光毛细管凝胶电泳。
8.根据项7所述的方法，其还包括：基于所述多重荧光毛细管凝胶电泳的结果，比较所述FLT3基因的ITD区或其片段、NPM1基因或其片段和CEBPA基因或其片段中的一个或多个的扩增产物的大小与相应的野生型基因或其片段的大小，如两者一致，则判定为受试者的基因未发生突变，如两者不一致，则判定为受试者的该基因发生了突变。
9.根据项7所述的方法，其中，所述野生型FLT3基因的ITD区的大小为365bp，所述野生型NPM1基因片段的大小为283bp，所述野生型CEBPA基因的片段有四个，其大小分别为309bp、345bp、444bp和416bp；且当所述扩增产物的大小与相应的野生型基因的片段的大小相差±1bp以下时，认定为两者一致。
10.根据项7～9中任一项所述的方法，其中，所述样本为全血或骨髓。
发明效果
根据本发明，可以同时检测对AML预后分层的具有明显临床指导意义的多基因多突变，在一个工作日之内就可以完成从样本制备到出具报告的整个检测流程，检测结果快速、准确，可以有效地对AML的预后分层提供快速的指导。
与现有技术相比，本发明的优势之一在于快速。传统上，采用一代测序完成AML预后分层的检测至少需要3天的时间；采用二代测序完成AML预后分层的检测至少需要一周的时间；而采用本发明的方法完成AML预后分层的检测则只需要不到1天的时间即可完成，这对于临床检验而言极为重要。此外，本发明的另一优势在于准确，具体体现在：本发明检测出的预后结果跟实际临床医生反馈的结果是一致的。
附图说明
图1为采用实施例的方法对一名男性AML患者进行检测的结果。
图2为采用实施例的方法对一名女性AML患者进行检测的结果。
发明的具体实施方式
在一个方面中，本发明提供一种用于急性髓细胞白血病预后分层的试剂盒(本发明的试剂盒)，其包括用于检测FLT3基因的ITD区或其片段的引物组1、用于检测NPM1基因或其片段的引物组2、以及用于检测CEBPA基因或其片段的引物组3；
所述每个引物组均包括上游引物和下游引物，且所述上游引物和下游引物中的至少一个是经过荧光分子标记的。
在这里，“用于检测”是指：用于将指定基因或其片段从包含该基因或其片段的受试者来源的样本中通过PCR扩增出来，并对扩增产物赋予能够用于多重荧光毛细管凝胶电泳测定的荧光标记。
在本说明中，所述“受试者”是已经罹患急性髓细胞白血病的人，优选是已经罹患急性髓细胞白血病且接受了临床治疗、需要进行预后评估的人。
对核苷酸序列进行荧光分子标记可以采用本领域技术人员已知的方法来进行，所述荧光分子通常被标记在所述上游引物和/或下游引物的5'端或3'端。作为所述荧光分子，可以列举出FAM、HEX、TET、VIC、Cy3、Cy5和ROX7等，但不限于此。
毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)又称高效毛细管电泳(highperformance capillary electrophoresis，HPCE)，是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。毛细管电泳的分离模式有很多种，其中毛细管凝胶电泳是将凝胶转移到毛细管中作为支撑物进行分离的区带电泳。凝胶是一种固态的分散的体系，具有多孔性，类似于分子筛的作用，被分离物在通过装入毛细管内的凝胶力，按照各自分子的体积大小逐一分离，分子体积大的首先被分离出来，适用于生物大分子的分析。毛细管凝胶电泳可以识别一个碱基差异的寡核苷酸，可用于分离DNA片段。荧光毛细管凝胶电泳通过检测来自核苷酸序列上标记的荧光分子的荧光信号，从而区分不同大小的核苷酸序列。在本说明书中，多重荧光毛细管凝胶电泳是指同时检测来自多种荧光分子的荧光毛细管凝胶电泳。
在本发明中，优选对于用于检测大小相近的基因或其片段的各引物组，采用不同的荧光分子进行标记。由此，可以通过荧光毛细管凝胶电泳更显著地区分各基因及其片段。这里，“大小相近”是指相差±30bp以内。
人类FLT3基因的ITD区、NPM1基因和CEBPA基因的核苷酸序列是已知的，针对已知核苷酸序列的基因设计其扩增引物是本领域技术人员熟知的，例如可以按照例如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克(Sambrook.J.)等著，黄培堂等译，第3版，2005)的教导来进行设计，或者利用计算机软件(例如Premier公司开发的Primer Premier 6.0)来进行设计。
PCR(聚合酶链式反应)扩增是本领域技术人员熟知的，其一般通过一定的PCR反应程序(温度循环)来实现。所述PCR反应程序一般变性、退火、延伸等步骤。
在一个优选的实施方式中，所述引物组1由核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物组成；所述引物组2由核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物组成；且
所述引物组3是下述引物组31～34：
引物组31，其由核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的下游引物组成；
引物组32，其由核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的下游引物组成；
引物组33，其由核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示的下游引物组成；和
引物组34，其由核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示的下游引物组成。
本发明人发现，在使用上述SEQ ID NO：1～12所示的引物进行PCR扩增的情况下，所得各扩增产物在多重荧光毛细管凝胶电泳测定中均显示出“高品质”的峰。这里，“高品质”是指：每个目的扩增峰都单一，没有杂峰出现。
优选地，本发明的试剂盒中除了包含上述引物组1～3以外，还可以包含用于提取基因组DNA的、用于PCR扩增反应的、用于提取总RNA的、用于反转录的、以及用于多重荧光毛细管凝胶电泳的试剂或装置中的一种或多种。
优选地，本发明的试剂盒可同时检测受试者中的FLT3基因的ITD区、NPM1基因和CEBPA基因的基因突变。在使用本发明的试剂盒同时检测受试者的FLT3基因的ITD区、NPM1基因和CEBPA基因的基因突变的情况下，可以如下进行:
步骤A：以所述引物组1作为引物，以来自受试者的样本的基因组DNA作为模板，扩增样本的FLT3基因的ITD区或其片段，得到扩增产物A。
步骤B：以所述引物组2作为引物，以来自受试者的样本的基因组DNA作为模板，扩增样本的NPM1基因或其片段，得到扩增产物B。
步骤C：以所述引物组3作为引物，以来自受试者的样本的总RNA反转录得到的cDNA作为模板，扩增样本的CEBPA基因或其片段，得到扩增产物C。
所述步骤A、步骤B和步骤C可以以任意顺序进行或同时进行。
这里，对于来自受试者的样本没有特殊限制，可以是例如来自受试者的任何组织或细胞，优选全血或骨髓。
从来自受试者的样本获得基因组DNA可以采用本领域技术人员公知的方法，例如可以使用商品化的试剂盒来进行。此外，从来自受试者的样本获得总RNA、以及将所述总RNA反转录获得cDNA可以采用本领域技术人员公知的方法，例如可以使用商品化的试剂盒来进行。
然后，进行步骤D：将上述扩增产物A、扩增产物B和扩增产物C混合，得到混合试样，并对该混合试样进行多重荧光毛细管凝胶电泳。
基于所述多重荧光毛细管凝胶电泳的结果，比较所述FLT3基因的ITD区或其片段、NPM1基因或其片段和CEBPA基因或其片段中的一个或多个(优选全部)的扩增产物的大小与相应的野生型基因或其片段的大小，如两者一致，则判定为受试者的基因未发生突变，如两者不一致，则判定为受试者的该基因发生了突变。其中，所述野生型FLT3基因的ITD区的大小为365bp，所述野生型NPM1基因片段的大小为283bp，所述野生型CEBPA基因的片段有四个，其大小分别为309bp、345bp、444bp和416bp。当所述扩增产物的大小与相应的野生型基因或其片段的大小相差±1bp以下时，认定为两者一致；当所述扩增产物的大小与相应的野生型基因或其片段的大小相差大于±1bp时，认定为两者不一致。
上述所述FLT3基因的ITD区、NPM1基因和CEBPA基因的突变情况与急性髓细胞白血病患者的预后的关系见下表：
因此，本发明的试剂盒可以用于急性髓细胞白血病预后分层，即，在判定结果为FLT3-ITD未发生突变而NMP1或CEBPA至少一者发生了突变的情况下，可以判定该患者的预后好；在判定结果为FLT3-ITD发生突变而NMP1或CEBPA至少一者发生了突变的情况下，可以判定该患者的预后中等；在判定结果为FLT3-ITD发生突变而NMP1和CEBPA均未发生突变的情况下，可以判定该患者的预后差。
实施例
以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中所用实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1荧光标记的引物的合成
以下荧光标记引物由上海捷瑞公司合成。
表中，F或FS表示上游引物，R或RS表示下游引物。
实施例2 PCR及多重荧光毛细管凝胶电泳检测
1)提取血液中的总RNA
a.取200μL血液，加入1mL Trizol(Invitrogen公司)，剧烈震荡混匀，室温放置10分钟；
b.向a中加入200μL氯仿，剧烈混匀；室温放置5分钟；
c.12000rpm，4℃离心15分钟；
d.将上清吸到另一个新的1.5mL离心管中；
e.向d中加入等倍体积的异丙醇，室温放置30分钟；
f.12000rpm，4℃离心15分钟；弃上清；
g.用500μL 75％的乙醇洗涤沉淀，洗涤两遍；
h.用20μLddH2O(无RNA酶)溶解沉淀；
i.电泳检测提取RNA的完整性，并用Qubit或者Nanodrop测定RNA的浓度。
2)反转录得到cDNA
a.取1μg提取的RNA，65℃10分钟后，立即置于冰上5分钟；
b.向a中加入1μL随机引物，同时加入以下反应成分：
c.42℃反应1小时；
d.反应结束后，65℃10分钟使酶失活。得到的cDNA用于后续PCR反应。
3)利用2)中的cDNA做模板，使用4对引物通过多重PCR扩增CEBPA基因的完整表达框
4)反应体系：
PCR反应条件：94℃预变性5分钟，(95℃变性11分钟，55℃退火30秒，72℃延伸30秒)30个循环，72℃终延伸5分钟。
5)提取血液因组DNA，具体步骤如下：
a.向200μL血液中加入600μLDNA提取液；
b.加蛋白酶K至终浓度为100μg/mL，50-56℃消化2小时；
c.加入300μLTris-饱和酚，反转数次，充分混匀。10000rpm，15分钟，4℃离心，吸取上清；
d.重复上一步骤；
e.加入200μL氯仿，反转数次，充分混匀。10000rpm4℃离心15分钟，吸取上清；
f.加入与上清等体积的异丙醇(或2倍体积的无水乙醇)，反转数次，充分混匀。室温下放置30分钟；
g.12000rpm，4℃离心15分钟，弃上清；
h.用75％乙醇漂洗沉淀1-2次，晾干；
i.加入50-100μL TE/H2O溶解(根据起始样品量可以调整最终溶解体积)。
6)利用5)中的基因组DNA为模板，使用两重PCR扩增FLT3-ITD和NMP1基因
7)反应体系：
PCR反应条件：94℃预变性5分钟，(95℃变性1分钟，55℃退火30秒，72℃延伸30秒)，30cycles，72℃终延伸5分钟。
8)将3)和7)中的PCR产物混合进行多重毛细管电泳检测。
根据基因突变判读结果，判读方法：野生型NPM1基因片段的大小为283bp；野生型FLT3基因的片段大小为365bp；野生型CEPBA基因的片段有四个，其片段大小分别为345bp，309bp，444bp和416bp。根据峰对应的片段的大小来判断待检测基因中是否发生插入或者缺失突变。
9)对AML的预后进行指导。
对于一个男性AML患者，检测结果如图1所示。可知：NPM1基因的扩增产物的片段大小为283bp，表明该检测基因未发生突变；CEBPA基因的4个扩增片段的大小分别为345bp、309bp、444bp和416bp，均为野生型，表明CEBPA检测基因未发生突变；FLT3基因扩增产物的大小为383bp，表明该基因发生了18bp的插入突变。该样本只有FLT3发生了插入突变，而CEBPA和NPM1基因均未发生突变，表明该男性AML样本的预后较差。
对于一个女性AML患者，检测结果如图2所示。可知：NPM1基因的扩增产物的大小为287bp，表明该检测基因发生了4bp的插入突变；CEBPA基因的4个扩增片段的大小分别为345bp、309bp、444bp和416bp，均为野生型大小片段，表明CEBPA检测基因未发生突变；FLT3基因的ITD区的扩增产物的大小为365bp，为野生型，表明该样本的FLT3未发生改变。该样本只有NPM1发生了插入突变，而CEBPA和FLT3基因均未发生突变，表明该女性AML样本的预后较好。
还需要说明的是，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，在本说明书中作为某一技术方案的构成部分所描述的任一技术特征或技术特征的组合同样也可以适用于其它技术方案；并且，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，作为不同技术方案的构成部分所描述的技术特征之间也可以以任意方式进行组合，来构成其它技术方案。本发明也包含在上述情况下通过组合而得到的技术方案，并且这些技术方案相当于记载在本说明书中。
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域技术人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
工业实用性
根据本发明，提供一种能够快速地检测多基因/多位点突变的、用于急性髓细胞白血病预后分层的试剂盒及检测方法。

Claims (9)

1.一种用于急性髓细胞白血病预后分层的试剂盒，其包括用于检测FLT3基因的ITD区或其片段的引物组1、用于检测NPM1基因或其片段的引物组2、以及用于检测CEBPA基因或其片段的引物组3；
所述每个引物组均包括上游引物和下游引物，且所述上游引物和下游引物中的至少一个是经过荧光分子标记的。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述荧光分子选自FAM、HEX、TET、VIC、Cy3、Cy5和ROX7。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，对于用于检测大小相近的基因或其片段的各引物组，采用不同的荧光分子进行标记。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，
所述引物组1由核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物组成；
所述引物组2由核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物组成；和
所述引物组3是下述引物组31～34：
引物组31，其由核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的下游引物组成；
引物组32，其由核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的下游引物组成；
引物组33，其由核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示的下游引物组成；和
引物组34，其由核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示的下游引物组成。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，该试剂盒中还包括用于提取基因组DNA的试剂或装置。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，该试剂盒中还包括用于提取总RNA的试剂或装置。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，该试剂盒中还包括用于反转录的试剂或装置。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，该试剂盒中还包括用于多重荧光毛细管凝胶电泳的试剂或装置。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，该试剂盒以从人全血或骨髓中提取的基因组DNA作为操作对象。
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