CN109207562A - 单细胞线粒体拷贝数检测方法 - Google Patents

单细胞线粒体拷贝数检测方法 Download PDF

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张玫翔
姚桂东
马雪山
徐家伟
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

单细胞线粒体拷贝数检测方法，包括以下步骤：（1）、引物和探针设计：针对线粒体DNA11778位点G>A突变设计一对产物长度约1000bp的引物（序列1和序列2）用于标准品制作，一对Taqman探针（序列3‑6）用于检测；（2）、单细胞裂解和检测：利用配制的裂解液处理样本后直接行Taqman定量检测；（3）、数据分析：Ct值标准曲线法计算线粒体拷贝数；本发明总体操作步骤简单，对操作人员的技术水平要求低，而且数据分析方法简单，只要具有基本的Excel知识即可分析，解决了临床上对于单细胞线粒体拷贝数检测的目的，适用于临床推广。

Description

单细胞线粒体拷贝数检测方法
技术领域
本发明涉及一种单细胞线粒体拷贝数检测方法。
背景技术
线粒体是真核细胞产生能量的重要细胞器，它含有自己的基因组，拥有相对独立的DNA复制、转录和翻译系统，是半自主性的细胞系，负责细胞能量代谢和自由基生成。线粒体含有自己的DNA，哺乳动物线粒体DNA（MitochondrialDNA，mtDNA）是一个全长为16569bp左右的双链闭环分子，它含有37个基因和1个非编码控制区域，这个区域就是D环，具有控制mtDNA转录和翻译的调节序列，每个细胞中只有一组核基因组，但可以具有上百个线粒体，每个线粒体中又含有1-15个不等的mtDNA分子。细胞氧化呼吸链的正常运转需要一定数目结构完整和功能健全的线粒体，而线粒体又依赖于每个mtDNA分子结构的完整性和一定的数目。因此mtDNA的拷贝数对于细胞的作用意义重大，快速灵敏地检测mtDNA拷贝数的方法对于基础研究和临床应用都十分重要。
线粒体相关的遗传疾病多由于mtDNA的突变，而突变主要以单碱基突变为主。例如Leber遗传性视神经病（LeberHereditary Optic Neuropathy，LHON）、乳酸酸中毒及卒中样发作综合征（Mitochondrial Encephalomyopathy, Lacticadidosis, And Stroke-likeepisodes, MELAS），慢性进行性眼外肌瘫痪（CPEO）、Keams-Sayre综合征（KSS）等，此类疾病具有明显的剂量效应，即突变比例与疾病的症状和表现程度相关。通常情况下，一个细胞质中的几千个mtDNA分子在某一个特定位点上都为同一序列，此细胞可以称为同质，但如果同一个细胞几千个mtDNA分子中某一位点同时存在正常基因和突变基因，就称为杂质。当突变的mtDNA数目超过一定比例时，就会出现临床症状。因此在单细胞和胚胎水平检测突变mtDNA的比例对于疾病临床表现的预测显得尤为重要。
目前已报道的对于mtDNA的定量技术存在以下不足之处：(1)需要提取DNA；(2)检测技术多针对体细胞和血样，检测精度低，检测需要大量的样本；(3)采用模型拟合的方法进行定量，影响因素很多，不同模型，不同实验流程产生的结果不一致；(4)对chrM的测量单位的定义不确定；(5)目前的应用于胚胎、卵子以及单个细胞时结果不稳定，且只能检测线粒体的拷贝数而不能检测比例。
发明内容
本发明为了解决现有技术中的不足之处，提供一种操作简单、检测周期短、对操作人员技术水平要求低的单细胞线粒体拷贝数检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：单细胞线粒体拷贝数检测方法，包括以下步骤：
（1）、探针和引物设计：针对线粒体DNA11778位点设计相应的引物，首先在线粒体DNA11778位点上下游序列设计一对产物约为1000bp的引物作为用于标准品制作的引物（序列1和序列2）；针对线粒体DNA11778位点G>A突变，设计一对Taqman探针，包括不带突变VIC探针（序列3）、携带突变的FAM探针（序列4）以及探针所需的引物（序列5和序列6），
引物序列如下：
序列1：CAACAACCTATTTAGCTGTTCCCC；
序列2：GTAAGGCGAGGTTAGCGAGG；
序列3：CACAGTCGCATCATA（荧光基团为VIC，猝灭基团为MGB的Taqman探针）；
序列4：ACTCACAGTCACATCA（荧光基团为FAM，猝灭基团为MGB的Taqman探针）；
序列5：GCTTACATCCTCATTACTATTCTGCCTA；
序列6：GAGTAGAGTTTGAAGTCCTTGAGAGAG；
（2）、双标准品建立：正常人的血液标本和患者的血液标本提取DNA后测定浓度，建立浓度25-50ng/mL的模板DNA，利用引物序列1和引物序列2进行普通PCR扩增，反应体系如下：2´Hot Start Master Mix 25mL，引物序列1（10mM）1mL，引物序列2（10mM）1mL，模板DNA (总量50-100ng) 2mL，水21mL，总体积50mL；反应在ABThermalCycler上进行，反应程序如下：95°C2min→95°C30sec→63°C30sec→72°C1min，以上反应程序反复进行30个循环，接着为72°C10min，最后4°C保存；
PCR产物跑胶检测条带均一性，制作1.5%琼脂糖凝胶，以1：1000的比例加入GelRed，跑胶后可见971bp单一条带，割胶回收，提取DNA，根据DNA浓度和片段长度代入公式计算拷贝数：
拷贝数(拷贝/ uL)= [DNA浓度ng/mL] × 6.0221409×1023
[片段长度bp] × 650 × 109
通过加水稀释DNA，分别建立正常和患者109拷贝/ mL至 102拷贝/mL共16个标准品；
（3）、Taqman双标准曲线建立:准备上述的16个样本，以及不同比例混合的患者和正常人的DNA，采用Taqman方法进行标准曲线的建立和比例校准；
Taqman反应体系如下：2´Taqman Universal Master Mix (With UGI) 5mL，引物序列3（10mM）0.2mL，引物序列4（10mM）0.2mL，标准品DNA 1mL，水3.2mL，总体系10mL，反应在LifeQuantStudio 12K Flex荧光定量PCR系统上进行，反应程序如下：首先是扩增过程：95°C2min→95°C 30sec→63°C 30sec→72°C 1min，以上反应程序进行30个循环；然后72°C10min，接着进行熔解曲线过程，检测产物特异性；
结果表明，各个反应管均出现特异性扩增，VIC和FAM两种荧光能够准确指示样本线粒体DNA11778位点所含的碱基是G（VIC）还是A（FAM），所测结果呈现梯度分布，与标准品制作时所设定的梯度一致；
正常对照VIC：y = -3.480x + 35.84，R² = 0.940 式（1）；
患者突变FAM：y = -3.498x + 36.04，R² = 0.998 式（2）；
（4）、单细胞裂解：首先配制单细胞专用裂解液，配制方法如下：
单细胞专用裂解液10mL：包含KCL 0.0373g (分子量=74.55，终浓度50mM)、MgCl20.0019g (或0.02mL 1M MgCl2，分子量=95.21，终浓度1.5mM)、0.1mL 1M Tris-HCl (Tris分子量=121.14，终浓度10mM) 、明胶 0.001g （明胶无固定分子量，终浓度0.1mg/ml）、0.064mL 70% NP-40（终浓度0.45%）、0.045mL Tween 20（终浓度0.45%）、新鲜蛋白酶K1.2mg (终浓度0.12mg/mL)，随后补充纯水至10mL；
将单细胞、卵裂球、胚胎样本放入2mL单细胞专用裂解液中，震荡离心，55℃裂解2小时（或55℃过夜），95℃15min使裂解液失活，裂解完成后以14000转离心5min，取上清可直接用于Taqman体系进行检测，获得Ct值；
（5）、单细胞线粒体拷贝数计算；
对于仅含有正常序列的样本，根据式（1），代入VIC的Ct值y，计算一个反应体系中的正常序列的拷贝数；
对于携带突变的样本，根据式（1）和式（2），代入VIC和FAM的Ct值y，计算正常序列和突变序列的拷贝数，进而通过以下公式计算比例：突变比例=突变序列拷贝数/(正常序列拷贝数+突变序列拷贝数)。
采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：本发明方法操作简单、检测周期短、对操作人员技术水平要求低；线粒体拷贝数的检测主要依赖于三种途径：一种是二代测序技术，一种是基于SYBRgreen的荧光定量PCR，另一种是基于Taqman探针的荧光定量PCR技术。二代测序技术操作流程繁琐，耗时长达两周，技术水平要求高，需要进行专业的数据分析，不利于临床推广，基于SYBRgreen的荧光定量PCR技术需要设置参考值，因此至少需要3个反应体系才能完成，而且单碱基差异极易导致引物错配，因此获得的Ct值极不准确，不能作为单细胞的检测方法；Taqman探针在检测单碱基差异的过程中具有独特优势，Taqman探针的特异性强，在仅有一个碱基错配的情况下也不能结合，具有不同颜色荧光的Taqman探针（VIC和FAM）可以同时检测两段序列，配合单细胞专用裂解液，将DNA提取的过程简化为2.5h的裂解过程，裂解完成的样本可直接用于Taqman检测，整个过程不超过6h，可以在检测当天获得结果；本发明总体操作步骤简单，对操作人员的技术水平要求低，而且数据分析方法简单，只要具有基本的Excel知识即可分析，解决了临床上对于单细胞线粒体拷贝数检测的目的，适用于临床推广。
附图说明
图1是利用Taqman方法建立的标准曲线；
图2是利用本发明进行胚胎样本检测结果；
图3是利用本发明进行单细胞样本检测结果；
图例说明：图3中TE为滋养层细胞的英文trophetoderm cell缩写，CC为人卵丘颗粒细胞的英文Culumus Cell缩写。
具体实施方式
本发明的单细胞线粒体拷贝数检测方法，包括以下步骤：
（1）、探针和引物设计：针对线粒体DNA11778位点设计相应的引物,首先在线粒体DNA11778位点上下游序列设计一对产物约为1000bp的引物作为用于标准品制作的引物（序列1和序列2）；针对线粒体DNA11778位点G>A突变，设计一对Taqman探针，包括不带突变VIC探针（序列3）、携带突变的FAM探针（序列4）以及探针所需的引物（序列5和序列6），
引物序列如下：
序列1：CAACAACCTATTTAGCTGTTCCCC；
序列2：GTAAGGCGAGGTTAGCGAGG；
序列3：CACAGTCGCATCATA（荧光基团为VIC，猝灭基团为MGB的Taqman探针）；
序列4：ACTCACAGTCACATCA（荧光基团为FAM，猝灭基团为MGB的Taqman探针）；
序列5：GCTTACATCCTCATTACTATTCTGCCTA；
序列6：GAGTAGAGTTTGAAGTCCTTGAGAGAG；
（2）、双标准品建立：正常人的血液标本和患者的血液标本提取DNA后测定浓度，建立浓度25-50ng/mL的DNA样本建立模板DNA，利用引物序列1和引物序列2进行普通PCR扩增，反应体系如下：2´Hot Start Master Mix 25mL，引物序列1（10mM）1mL，引物序列2（10mM） 1mL，模板DNA (总量50-100ng) 2mL，水21mL，总体积50mL；反应在ABThermalCycler上进行，反应程序如下：95°C 2min→95°C 30sec→63°C 30sec→72°C 1min，以上反应程序反复进行30个循环，接着为72°C 10min，最后4°C保存；
PCR产物跑胶检测条带均一性，制作1.5%琼脂糖凝胶，以1：1000的比例加入GelRed，跑胶后可见971bp单一条带，割胶回收，提取DNA，根据DNA浓度和片段长度代入公式计算拷贝数：
拷贝数(拷贝/ uL)= [DNA浓度ng/mL] × 6.0221409×1023
[片段长度bp] × 650 × 109
通过加水稀释DNA，分别建立正常和患者109拷贝/mL至 102拷贝/mL共16个标准品；
（3）、Taqman双标准曲线建立:
准备上述的16个样本，以及不同比例混合的患者和正常人的DNA，采用Taqman方法进行标准曲线的建立和比例校准；
Taqman反应体系如下：2´Taqman Universal Master Mix (With UGI) 5mL，引物序列3（10mM）0.2mL，引物序列4（10mM）0.2mL，标准品DNA 1mL，水3.2mL，总体系10mL，反应在LifeQuantStudio 12K Flex荧光定量PCR系统上进行，反应程序如下：首先是扩增过程：95°C2min→95°C 30sec→63°C 30sec→72°C 1min，以上反应程序进行30个循环；然后72°C10min，接着进行熔解曲线过程，检测产物特异性；
结果表明，各个反应管均出现特异性扩增，VIC和FAM两种荧光能够准确指示样本线粒体DNA11778位点所含的碱基是G（VIC）还是A（FAM），所测结果呈现梯度分布，与标准品制作时所设定的梯度一致；
正常对照VIC：y = -3.480x + 35.84，R² = 0.940 式（1）；
患者突变FAM：y = -3.498x + 36.04，R² = 0.998 式（2）；
（4）、单细胞裂解：首先配制单细胞专用裂解液，配制方法如下：
单细胞专用裂解液10mL：包含KCL 0.0373g (分子量=74.55，终浓度50mM)、MgCl20.0019g (或0.02mL 1M MgCl2，分子量=95.21，终浓度1.5mM)、0.1mL 1M Tris-HCl (Tris分子量=121.14，终浓度10mM) 、明胶 0.001g （明胶无固定分子量，终浓度0.1mg/ml）、0.064mL 70% NP-40（终浓度0.45%）、0.045mL Tween 20（终浓度0.45%）、新鲜蛋白酶K1.2mg (终浓度0.12mg/mL)，随后补充纯水至10mL；
将单细胞、卵裂球、胚胎样本放入2mL单细胞专用裂解液中，震荡离心，55℃裂解2小时（或55℃过夜），95℃15min使裂解液失活，裂解完成后以14000转离心5min，取上清可直接用于Taqman体系进行检测，获得Ct值；
（5）、单细胞线粒体拷贝数计算；
对于仅含有正常序列的样本，根据式（1），代入VIC的Ct值y，计算一个反应体系中的正常序列的拷贝数；
对于携带突变的样本，根据式（1）和式（2），代入VIC和FAM的Ct值y，计算正常序列和突变序列的拷贝数，进而通过以下公式计算比例：突变比例=突变序列拷贝数/(正常序列拷贝数+突变序列拷贝数)。
本实施例并非对本发明的形状、材料、结构等作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (1)

1.单细胞线粒体拷贝数检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）、探针和引物设计：针对线粒体DNA11778位点设计相应的引物，首先在线粒体DNA11778位点上下游序列设计一对产物约为1000bp的引物作为用于标准品制作的引物（序列1和序列2）；针对线粒体DNA11778位点G>A突变，设计一对Taqman探针，包括不带突变VIC探针（序列3）、携带突变的FAM探针（序列4）以及探针所需的引物（序列5和序列6），
引物序列如下：
序列1：CAACAACCTATTTAGCTGTTCCCC；
序列2：GTAAGGCGAGGTTAGCGAGG；
序列3：CACAGTCGCATCATA（荧光基团为VIC，猝灭基团为MGB的Taqman探针）；
序列4：ACTCACAGTCACATCA（荧光基团为FAM，猝灭基团为MGB的Taqman探针）；
序列5：GCTTACATCCTCATTACTATTCTGCCTA；
序列6：GAGTAGAGTTTGAAGTCCTTGAGAGAG；
（2）、双标准品建立：正常人的血液标本和患者的血液标本提取DNA后测定浓度，建立浓度25-50ng/mL的模板DNA，利用引物序列1和引物序列2进行普通PCR扩增，反应体系如下：2´Hot Start Master Mix 25mL，引物序列1（10mM）1mL，引物序列2（10mM）1mL，模板DNA (总量50-100ng) 2mL，水21mL，总体积50mL；反应在ABThermalCycler上进行，反应程序如下：95°C2min→95°C30sec→63°C30sec→72°C1min，以上反应程序反复进行30个循环，接着为72°C10min，最后4°C保存；
PCR产物跑胶检测条带均一性，制作1.5%琼脂糖凝胶，以1：1000的比例加入GelRed，跑胶后可见971bp单一条带，割胶回收，提取DNA，根据DNA浓度和片段长度代入公式计算拷贝数：
拷贝数(拷贝/ uL)= [DNA浓度ng/mL] × 6.0221409×1023
[片段长度bp] × 650 × 109
通过加水稀释DNA，分别建立正常和患者109拷贝/ mL至 102拷贝/mL共16个标准品；
（3）、Taqman双标准曲线建立:准备上述的16个样本，以及不同比例混合的患者和正常人的DNA，采用Taqman方法进行标准曲线的建立和比例校准；
Taqman反应体系如下：2´Taqman Universal Master Mix (With UGI) 5mL，引物序列3（10mM）0.2mL，引物序列4（10mM）0.2mL，标准品DNA 1mL，水3.2mL，总体系10mL，反应在LifeQuantStudio 12K Flex荧光定量PCR系统上进行，反应程序如下：首先是扩增过程：95°C2min→95°C 30sec→63°C 30sec→72°C 1min，以上反应程序进行30个循环；然后72°C10min，接着进行熔解曲线过程，检测产物特异性；
结果表明，各个反应管均出现特异性扩增，VIC和FAM两种荧光能够准确指示样本线粒体DNA11778位点所含的碱基是G（VIC）还是A（FAM），所测结果呈现梯度分布，与标准品制作时所设定的梯度一致；
正常对照VIC：y = -3.480x + 35.84，R² = 0.940 式（1）；
患者突变FAM：y = -3.498x + 36.04，R² = 0.998 式（2）；
（4）、单细胞裂解：首先配制单细胞专用裂解液，配制方法如下：
单细胞专用裂解液10mL：包含KCL 0.0373g (分子量=74.55，终浓度50mM)、MgCl20.0019g (或0.02mL 1M MgCl2，分子量=95.21，终浓度1.5mM)、0.1mL 1M Tris-HCl (Tris分子量=121.14，终浓度10mM) 、明胶 0.001g （明胶无固定分子量，终浓度0.1mg/ml）、0.064mL 70% NP-40（终浓度0.45%）、0.045mL Tween 20（终浓度0.45%）、新鲜蛋白酶K1.2mg (终浓度0.12mg/mL)，随后补充纯水至10mL；
将单细胞、卵裂球、胚胎样本放入2mL单细胞专用裂解液中，震荡离心，55℃裂解2小时（或55℃过夜），95℃15min使裂解液失活，裂解完成后以14000转离心5min，取上清可直接用于Taqman体系进行检测，获得Ct值；
（5）、单细胞线粒体拷贝数计算；
对于仅含有正常序列的样本，根据式（1），代入VIC的Ct值y，计算一个反应体系中的正常序列的拷贝数；
对于携带突变的样本，根据式（1）和式（2），代入VIC和FAM的Ct值y，计算正常序列和突变序列的拷贝数，进而通过以下公式计算比例：突变比例=突变序列拷贝数/(正常序列拷贝数+突变序列拷贝数)。
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