CN105586422A - 一种检测tert基因启动子突变的试剂盒、其检测方法及应用 - Google Patents

一种检测tert基因启动子突变的试剂盒、其检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于临床医学基因检测技术，具体涉及一种检测TERT基因启动子突变的试剂盒、其检测方法及应用，所述试剂盒包含针对TERT基因的荧光标记探针。本发明设计仅需一对探针和一对引物，所发现为特异性C228T型突变，约占膀胱癌TERT突变的99％；且检测方法试剂简单，价格低廉，而且反应体系中仅含有最基本的引物和探针，影响因素少；本发明方法检测精准，操作简单，为临床医学上快速检测膀胱癌奠定了基础。

Description

一种检测TERT基因启动子突变的试剂盒、其检测方法及应用
技术领域
本发明属于临床医学基因检测技术，具体涉及一种检测TERT基因启动子突变的试剂盒、其检测方法及应用。
背景技术
膀胱尿路上皮癌是泌尿道的最常见的恶性肿瘤。癌发病率水平在全国32个肿瘤登记处的合计为6.69/10万，占全部恶性肿瘤新发病例的2.52％。按性别统计，膀胱癌男、女性发病率分别为10.10/10万和3.20/10万，男性是女性的3.16倍。膀胱癌死亡率水平在全国32个肿瘤登记中为2.53/10万，占全部恶性肿瘤死亡总数的1.47％。此癌多数组织学表现为分化良好的乳头状病变。尿细胞学在诊断高级别肿瘤中有较高的灵敏度和特异性，但是在检测高分化低级别肿瘤时表现较差，其灵敏度和特异性较低，尤其以伴有非肿瘤性病变，如感染时为甚。目前常用的方法是尿液细胞学检查。虽说尿细胞学在高级别肿瘤检测中具有合理的灵敏度和特异性，但是其检测低级别肿瘤常有困难，其灵敏度和特异性均较低。目前应用的尿基肿瘤标记物，包括食品和药物管理局(FDA)批准的Immunocy，核基质蛋白22，和荧光原位杂交(FISH)具有较高的灵敏度和特异性。但是各项检查性能不一致，价格高昂，受标本因素影响较大，妨碍了其广泛的临床使用。
端粒反转录酶(TERT)激活性突变导致端粒酶的表达增加，是尿路上皮癌的最常见的突变，出现于80％的膀胱癌中，而且与癌的分化水平无关。现在已经被认定为膀胱癌的驱动突变，其突变的检测为膀胱癌的诊断提供了较好的目标基因。
TERT启动子突变发生于致癌过程早期，结合膀胱癌的外生性倾向，使细胞极易于脱落于尿液中，为TERT突变经尿液脱落细胞诊断膀胱癌成为可能。TERT突变的检测不但可用于临床诊断和筛查，而且极为适合复发监测。
现有的无创筛查和监测膀胱癌尿基标记物，包括食品和药物管理局(FDA)批准的试验Immunocy，核基质蛋白22(NMP22)，UroVysion原位荧光杂交具有70％的总灵敏度和高达89％的特异性。但是各项检查性能不一致，价格相对昂贵，妨碍了其广泛的临床使用。
端粒酶逆转录酶的启动子(TERT)基因激活性突变在导致端粒酶的表达增加，是膀胱癌的致癌驱动因子。TERT启动子突变被发现于80％的膀胱性尿路上皮癌，并且与肿瘤分级分期无关，是一个理想的诊断和监测指标。
CN104805206A公开了检测TERT基因突变的试剂盒及其检测方法，试剂盒含有针对TERT基因突变位点的LNA锁核酸修饰的特异探针，该特异探针能够与野生型DNA结合，能检出含0.01％TERT基因突变DNA的样本、最低检出限为2-5拷贝。但是该试剂盒反应体系复杂，影响因素多，每一因子均可对反应结果和解读产生影响，难以解读；貌似可以探知几乎所有突变，然C228T以外的突变在总突变中所占权重约为1％，并且混合的多重PCR不能明确病人为何种突变，尚需要测序来确定具体突变，如果用单纯PCR，则需要做多次PCR反应，工作量大。
发明内容
本发明应用实时PCR融解技术,检测TERT基因启动子突变.本发明设计仅需一对探针和一对引物，所发现为特异性C228T型突变，约占膀胱癌TERT突变的98％；且检测方法试剂简单，价格低廉，而且反应体系中仅含有最基本的引物和探针，影响因素少；本发明方法检测精准，操作简单，为临床医学上快速检测膀胱癌奠定了基础。
第一方面，本发明提供了一种检测TERT基因启动子突变的试剂盒，所述试剂盒包含针对TERT基因的荧光标记探针。
本发明，当检测TERT基因启动子存在突变时，突变特异性探针与基因组DNA特异性结合，而野生型DNA则因为有单点的不配对，而形成“泡”，从而显示较低的熔点。
优选地，所述荧光标记探针包括供体探针和受体探针。
优选地，所述供体探针的核苷酸序列包含如SEQIDNO.1所示的片段，所述受体探针的核苷酸序列包含如SEQIDNO.2所示的片段；
所述探针的核苷酸序列如下：
供体探针：5’-CGTCCCGACCCCTCCCGGGTC-Flc-3’(SEQIDNO.1)；
受体探针：5’-Lc640-GCCCAGCCCCTTCCGGGCCCT-Phos-3’(SEQIDNO.2)。
优选地，所述试剂盒还包括检测TERT的特异性引物。
优选地，所述特异性引物的核苷酸序列包含如SEQIDNO.3-4所示的片段；
所述特异性引物的核苷酸序列如下：
上游引物：5’-cccttcaccttccagctc-3’(SEQIDNO.3)；
下游引物：5’-agcgctgcctgaaactgg-3’(SEQIDNO.4)。
优选地，所述试剂盒所述试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTPs、OneTaqDNA聚合酶。
本发明中，所有试剂包括特异性引物，荧光探针，及PCR缓冲液，dNTPs(除酶之外)均已混合，作为“主液”，不需要单独配制，极大地方便用户操作。
所述PCR缓冲液的浓度为1×缓冲液。
优选地，所述dNTPs的浓度为dNTPs的浓度为0.05-1μM，例如可以是0.05μM、0.06μM、0.08μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM或1μM，优选为0.1-0.8μM，进一步优选为0.2μM。
优选地，所述OneTaqDNA聚合酶的浓度为0.5-8U/mg，例如可以是0.5U/mg、0.6U/mg、0.7U/mg、0.8U/mg、1U/mg、1.2U/mg、1.5U/mg、2U/mg、2.5U/mg、3U/mg、3.5U/mg、4U/mg、4.5U/mg、5U/mg、5.5U/mg、6U/mg、6.5U/mg、7U/mg、7.5U/mg或8U/mg，优选为1-5U/mg，进一步优选为1.5U/mg。
第二方面，本发明提供一种利用如第一方面所述的检测TERT基因启动子突变的试剂盒在非疾病诊断中检测TERT基因启动子突变的方法，包括以下步骤：
(1)从待测样品中提取模板DNA5-20ng，利用SEQIDNO.3-4的特异性引物对模板DNA进行实时PCR扩增；
(2)将步骤(1)扩增后的片段加入SEQIDNO.1-2的荧光探针进行加温熔解；
(3)通过得到的PCR产物的熔解曲线来判断TERT基因的突变情况。
优选地，步骤(1)所述的模板来自于尿液细胞沉淀物和/或膀胱组织。
优选地，步骤(1)所述的扩增条件为：
(a)95℃预变性4min，1循环；
(b)94℃变性20s、62℃退火20s、68℃延伸40s，45个循环；
(c)37℃延伸30s，1循环。
优选地，步骤(2)所述的加温熔解的条件为：95℃1min，62℃30s，45℃30s，40℃2min，再以0.1℃/秒的速度升高至70℃。
优选地，步骤(3)所述判断TERT基因的突变情况为：
当预测熔点±2.5℃范围内出现单一熔融曲线峰，则待测样本为单一扩增子；
当预测熔点±2.5℃范围内出现峰值，则待测样本为包含一个突变的细胞群。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的检测TERT基因启动子突变的试剂盒，或如第二方面所述的方法用于检测C228T位点突变的应用。
本发明中，所述C228T位点的突变占其他所有膀胱癌TERT突变的99％。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
(1)本发明设计仅需一对探针和一对引物，所发现为特异性C228T型突变，约占膀胱癌TERT突变的99％；
(2)本发明方法试剂简单，价格低廉，而且反应体系中仅含有最基本的引物和探针，影响因素少；
(3)本发明方法检测精准，操作简单，为临床医学上快速检测膀胱癌奠定了基础。
附图说明
图1为本发明试剂盒检测原理图；
图2为本发明试剂盒检测结果图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1：检测TERT基因启动子突变
检测TERT基因启动子突变的试剂盒在非疾病诊断中检测TERT基因启动子突变的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样品的尿液，离心提取尿液细胞，提取细胞全DNA，利用SEQIDNO.3-4的特异性引物对模板DNA进行实时PCR扩增；
上游引物：5’-cccttcaccttccagctc-3’(SEQIDNO.3)；
下游引物：5’-agcgctgcctgaaactgg-3’(SEQIDNO.4)；
(2)将步骤(1)扩增后的片段加入SEQIDNO.1-2的荧光探针进行加温熔解；
所述供体探针的核苷酸序列如下：
供体探针：5’-CGTCCCGACCCCTCCCGGGTC-Flc-3’(SEQIDNO.1)；
受体探针：5’-Lc640-GCCCAGCCCCTTCCGGGCCCT-Phos-3’(SEQIDNO.2)；
(3)通过得到的PCR产物的熔解曲线来判断TERT基因的突变情况。
PCR扩增反应体系如下：1×PCR缓冲液、0.2μM的dNTPs、1.5U/mg的oneTaqDNA聚合酶、10ng的DNA模板、特异性引物、供体探针和受体探针；
PCR反应条件如下：
加温熔解反应条件如下：
检测原理如图1所示，从图1说明当检测TERT基因启动子存在突变时，突变特异性探针与基因组DNA特异性结合，而野生型DNA则因为有单点的不配对，而形成“泡”，从而显示较低的熔点。本试剂盒由特异性DNA引物和荧光标记的激发探针与被激发探针构成，被激发探针3’磷酸化以防止其延伸，在PCR反应过程中，如无目标点突变，则探针与DNA100％互补，从而表现为一定的温度融解。
检测结果如图2所示，从图2可以看出，如果目的基因TERT无点突变存在，则在探针与DNA之间出现单个非互补硷基，融解温度下降。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种检测TERT基因启动子突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含针对TERT基因的荧光标记探针。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光标记探针包括供体探针和受体探针；
优选地，所述供体探针的核苷酸序列包含如SEQIDNO.1所示的片段，所述受体探针的核苷酸序列包含如SEQIDNO.2所示的片段。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测TERT的特异性引物；
优选地，所述特异性引物的核苷酸序列包含如SEQIDNO.3-4所示的片段。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTPs、OneTaqDNA聚合酶。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述dNTPs的浓度为0.05-1μM，优选为0.1-0.8μM，进一步优选为0.2μM；
优选地，所述OneTaqDNA聚合酶的浓度为0.5-8U/mg，优选为1-5U/mg，进一步优选为1.5U/mg。
6.一种利用如权利要求1-5中任一项所述的检测TERT基因启动子突变的试剂盒在非疾病诊断中检测TERT基因启动子突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从待测样品中提取模板DNA5-20ng，利用SEQIDNO.3-4的特异性引物对模板DNA进行实时PCR扩增；
(2)将步骤(1)扩增后的片段加入SEQIDNO.1-2的荧光探针进行加温熔解；
(3)通过得到的PCR产物的熔解曲线来判断TERT基因的突变情况。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的模板来自于尿液细胞沉淀物和/或膀胱组织。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的扩增条件为：
(a)95℃预变性4min，1循环；
(b)94℃变性20s、62℃退火20s、68℃延伸40s，45个循环；
(c)37℃延伸30s，1循环；
优选地，步骤(2)所述的加温熔解的条件为：95℃1min，62℃30s，45℃30s，40℃2min，再以0.1℃/秒的速度升高至70℃。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述判断TERT基因的突变情况为：
当预测熔点±2.5℃范围内出现单一熔融曲线峰，则待测样本为单一扩增子；
当预测熔点±2.5℃范围内出现峰值，则待测样本为包含一个突变的细胞群。
10.一种如权利要求1-5中任一项所述的检测TERT基因启动子突变的试剂盒，或如权利要求6-9中任一项所述的方法用于检测C228T位点突变的应用。
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