CN110628910B - 一种膀胱癌驱动基因点突变甲基化联合辅助诊断方法、试剂盒、系统及应用 - Google Patents
一种膀胱癌驱动基因点突变甲基化联合辅助诊断方法、试剂盒、系统及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110628910B CN110628910B CN201910988473.XA CN201910988473A CN110628910B CN 110628910 B CN110628910 B CN 110628910B CN 201910988473 A CN201910988473 A CN 201910988473A CN 110628910 B CN110628910 B CN 110628910B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- methylation
- detection
- point mutation
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种用于筛查或检测或辅助诊断膀胱癌的方法、试剂盒、系统及应用，可同时针对FGFR3、TERT以及PLEKHS1点突变以及OTX1、NID2、NRN1甲基化水平进行检测，巧妙的实现了基因点突变和甲基化检测联合检测，减少了样本的需求量和实验操作步骤以及检测周期，提高检测的特异性和灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于基因变异检测技术领域，尤其涉及一种同时针对膀胱癌驱动基因的DNA甲基化和单核苷酸变异的进行检测的方法以及相关试剂盒、系统及应用。
背景技术
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，居我国男性肿瘤发病率的第6位。其中男性发病率是女性发病率的3-4倍，而女性的死亡率要比男性高。由于手术后需要持续的复查随访及高复发率(非肌层浸润性膀胱的复发率可达60-70％)，使得膀胱癌成为诊治费用最高的成人癌种。
预后差和易复发是膀胱癌的重要特点，有效的治疗很大程度上依赖于膀胱癌的早期诊断与早期治疗。然而，膀胱癌发病隐匿，大部分患者都是因为肉眼或镜下血尿才会到医院就诊，而此时已是癌症晚期。所以寻找特异的膀胱癌早期诊断方法具有重要的临床价值。膀胱镜作为膀胱癌诊断的金标准，有高达10％的漏诊率，且为侵入性的检查，接受程度低；尿液细胞学对高级别的膀胱癌有较高的敏感性，对低级别的膀胱癌检出率较低；影像学检测可发现较大的膀胱内肿瘤。但上述传统的膀胱癌检查手段，均无法同时满足无创、且高检出率的要求。
虽然目前临床上可以使用分子诊断方法对膀胱癌进行诊断，但均是使采用单一的检测方式，如仅针对基因甲基化、或单一位点突变等相关生物学信息，进行检测。其检出率的准确性以及灵敏度仍然难以令人满意。
针对上述问题，本发明首次采用驱动基因点突变和甲基化联合检测的方式进行膀胱癌诊断，改善目前检测方式的单一性，从多维度综合评估检测样本的阴阳性，大大扩展了检测区域超早筛查出膀胱癌肿瘤病变。因此，开发基于本产品诊断技术，对预防膀胱癌、术后复发监控具有重大意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时针对膀胱癌驱动基因的DNA甲基化和单核苷酸变异的进行检测的方法以及相关试剂盒、系统及应用。所述检测方法以及相关试剂盒、系统灵敏度好、准确度高，大大提高早期发病的膀胱癌检出率。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种通过针对膀胱癌发生相关通路基因筛查膀胱癌的检测方法，其包括针对基因点突变、基因表达调控区域甲基化水平、以及基因点突变和基因调控区域甲基化水平其中一种进行检测；优选基因点突变和基因调控区域甲基化水平联合检测；
进一步地，检测点突变的基因包括：FGFR3、TERT以及PLEKHS1中的一种或一种以上的组合；进一步地，FGFR3中点突变待检区域如SEQ ID NO：1所示；TERT点突变待检区域如SEQ ID NO：2所示，PLEKHS1点突变待检区域如SEQ ID NO：3所示；进一步地，检测基因调控区域甲基化水平的包括：OTX1、NID2、NRN1中的一种或一种以上的组合；进一步地，针对OTX1甲基化水平待检区域如SEQ ID NO：4所示；针对NID2甲基化水平的模板结构待检区域如SEQID NO：5所示；针对NRN1甲基化水平待检区域如SEQ ID NO：6所示；进一步地，其检测方法还包括针对内参基因的检测；进一步地，其内参基因为ATCB；进一步的，其ATCB的引物、探针结构分为如SEQ ID NOs：41-43所示序列。
本发明还提供了一种针对膀胱癌发生相关通路基因筛查膀胱癌的检测试剂，其包括针对待检区域的模板设计的特异性的引物和探针，通过PCR反应体系，以荧光定量PCR仪进行检测，实现对样本检测的方法。
进一步地，所述的设计的特异性的引物包括针对待检测区域设计的上游引物和下游引物；进一步地，所述的待检区域包括点突变、基因甲基化；进一步地，所述的待检区域基因甲基化CpG位点；进一步地，所述的点突变包括：FGFR3、TERT以及PLEKHS1中的一种或一种以上的组合；进一步地，FGFR3中点突变待检区域如SEQ ID NO：1所示；TERT点突变待检区域如SEQ ID NO：2所示，PLEKHS1点突变待检区域如SEQ ID NO：3所示；进一步地，所述的基因甲基化包括：OTX1、NID2、NRN1中的一种或一种以上的组合；进一步地，针对OTX1甲基化水平待检区域如SEQ ID NO：4所示；针对NID2甲基化水平待检区域如SEQ ID NO：5所示；针对NRN1甲基化水平待检区域如SEQ ID NO：6所示；
进一步地，所述上游引物和下游引物扩增目标区域的大小为80～150bp，优先为100bp以内；进一步地，所述上游引物或下游引物3’端落在待检测点上；进一步地，所述的待检测点距离上游引物或下游引物3’端0～5碱基；进一步地，所述的检测引物的3’端倒数第二位、第三位引入0～2碱基错配，提高引物的检测突变模板的特异性；进一步地，所述的检测引物的3’端倒数第二位、第三位引物0～2碱基错配遵循强错配加弱错配或弱错配加强错配组合；进一步地，所述的强错配配碱基为：A/G；C/T；进一步地，所述的弱错配碱基为：A/C；G/T；进一步地，所述检测引物可选自如SEQ ID NOs：7-11、13-17、19-23、25-29、31-34、36-39所示序列；进一步地，针对FGFR3点突变的上下游引物分别为，可选自如SEQ ID NOs：7-10中的任一序列，以及SEQ ID NO：11所示序列，优选上下游引物分别为SEQ ID NOs：10、11所示序列；进一步地，针对TERT点突变的上下游引物分别为，可选自如SEQ ID NOs：13-16中的任一序列，以及SEQ ID NO：17所示序列，优选上下游引物分别为SEQ ID NOs：16、17所示序列；进一步地，针对PLEKHS1点突变的上下游引物分别为，可选自如SEQ ID NOs：19-22中的任一序列，以及SEQ ID NO：23所示序列，优选上下游引物分别为SEQ ID NOs：22、23所示序列；进一步地，针对OTX1甲基化的上下游引物分别为，可选自如SEQ ID NOs：25、26中的任一序列，以及SEQ ID NOs：27-29所示的任一序列，优选上下游引物分别为SEQ ID NOs：25、29所示序列；进一步地，针对NID2甲基化的上下游引物分别为，可选自如SEQ ID NO：31所示序列，以及SEQ ID NOs：32-34所示的任一序列，优选上下游引物分别为SEQ ID NOs：31、34所示序列；进一步地，针对NRN1甲基化的上下游引物分别为，可选自如SEQ ID NO：36所示序列，以及SEQ ID NOs：37-39所示的任一序列，优选上下游引物分别为SEQ ID NOs：36、39所示序列；进一步地，所述的探针靠近待检位点；进一步地，所述的探针报告荧光基团包括：FAM、HEX、VIC、ROX等一种或多种探针报告荧光基团；猝灭基团包括：BHQ1、BHQ2、Cy3、Cy5等一种或多种猝灭基团；进一步地，所述的探针选自如SEQ ID NOs：12、18、24、30、35、40所示的任一序列或其组合；进一步地，所述待检区的模板包括DNA模板、重盐转化后的单链模板；优选重盐转化后的模板；进一步地，所述重盐转化为通过亚硫酸盐进行转化；进一步地，所述待检区结构选自如SEQ ID NOs：1-6所示的任一序列或其任意组合；进一步地，所述特异性的引物和探针还包括针对内参基因设计的引物和探针；进一步地，所述内参基因选自ATCB；进一步地，所述针对内参基因设计的引物和探针结构如SEQ ID NOs：41、42、43所示序列。
此外，本发明还提供一种针对膀胱癌发生相关通路基因筛查膀胱癌的高效、高特异性的PCR反应体系；所述PCR反应体系包括：上述用于针对膀胱癌发生相关通路基因筛查膀胱癌的引物和探针，PCR反应酶、PCR增强剂；
进一步地，PCR反应酶选自5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶活性的：Taq DNA聚合酶、Glod 360Master MIX、2G Robust mastrer MIX其中一种或多种；
进一步地，PCR增强剂包括：1～10mM DTT、0.1～10％DMSO、1～5％甘油。
此外，本发明还提供一种针对膀胱癌发生相关通路基因筛查膀胱癌的PCR检测反应程序，其程序用于上述通过针对膀胱癌发生相关通路基因筛查膀胱癌的检测方法以及检测试剂，所述检测程序包括四个模块：样本变性反应模块、高TM区域模板预扩增富集模块、检测反应模块；进一步地，样本变性反应模块实现样本变性成单链；进一步地，高TM区域模板预扩增富集模块优先对突变模板进行扩增富集；进一步地，检测反应模块实现样本的PCR和荧光信号的采集，实现样本的检测；
进一步地，优选的PCR检测反应程序如下表：
此外，本申请还提供一种膀胱癌辅助诊断试剂盒，其试剂盒包括样本核酸提取试剂模块、核酸DNA重盐转化模块、膀胱癌驱动基因点突变甲基化检测模块；进一步地，所述样本优选为尿液样本；进一步地，所述核酸提取模块选自：金麦格基因组DNA提取试剂盒、天根游离DNA提取试剂盒、天根基因组DNA提取试剂盒、其中一种或多种；进一步地，所述重盐转化为通过亚硫酸盐进行转化；进一步地，所述核酸DNA重盐转化试模块选自：天根大体积核酸重盐转化试剂盒、Zymo核酸重盐转化试剂盒、其中一种或多种；进一步地，膀胱癌驱动基因点突变甲基化检测模块包括前述所述的针对膀胱癌发生相关通路基因筛查膀胱癌的检测试剂。
此外，本申请还提供一种所述膀胱癌辅助诊断试剂盒的检测方法，其包括以下步骤：1)对采集的样本进行核酸提取；2)对提取的核酸进行亚硫酸盐重盐转化；3)对重盐转化后的产物检测点突变和甲基化检测；4)对检测结果进行阴阳性判断分析；进一步地，其方法还可以为：1)对样本核酸进行提取；2)将提取的核酸分配为两部分，一部分用于重盐转化，另一部分用于基因点突变检测；3)对用于重盐转化的核酸样品进行重盐转化处理；4)分别对用于基因点突变检测的部分以及经重盐转化处理的部分进行点突变以及基因甲基化水平的检测；5)对检测结果进行阴阳性判断分析；进一步地，所述重盐转化为通过亚硫酸盐进行转化；进一步地，所述采集的样本为尿液。
此外，本发明还提供一种针对膀胱癌发生相关通路基因筛查膀胱癌的检测系统，其用于执行以下步骤，1)对样本核酸进行提取；2)将提取的核酸进行重盐转化处理；3)对经重盐转化处理的甲基化检测反应模块检测点突变以及甲基化水平；4)对检测结果进行阴阳性判断分析；所述针对膀胱癌发生相关通路基因筛查膀胱癌的检测系统，还可以为用于执行以下步骤的检测系统，1)对样本核酸进行提取；2)将提取的核酸分配为点突变检测反应模块以及甲基化检测反应模块；3)对甲基化检测反应模块中的核酸进行重盐转化处理；4)分别对点突变检测反应模块以及经重盐转化处理的甲基化检测反应模块检测点突变以及基因甲基化水平；5)对检测结果进行阴阳性判断分析；进一步地，所述样本可以为尿液样本；进一步地，所述检测系统还包括执行对内参基因进行检测的模块；进一步地，所述点突变的基因包括：FGFR3、TERT以及PLEKHS1中的一种或一种以上的组合；进一步地，所述的基因甲基化的基因包括：OTX1、NID2、NRN1中的一种或一种以上的组合；进一步地，通过特异性引物和探针对点突变以及基因甲基化水平进行检测；进一步地，所述特异性引物和探针所针对的区域大小为80～150bp，优先为100bp以内；进一步地，所述特异性引物和探针所针对的待检区结构选自如SEQ ID NOs：1-6任一所示的序列或其任意组合；进一步地，所述上游引物或下游引物3’端落在待检测点上；进一步地，所述的待检测点距离上游引物或下游引物3’端0～5碱基；进一步地，所述的检测引物的3’端倒数第二位、第三位引入0～2碱基错配，提高引物的检测突变模板的特异性；进一步地，所述特异性引物可选自如SEQ ID NOs：7-11、13-17、19-23、25-29、31-34、36-39所示序列；进一步地，针对FGFR3点突变的上下游引物分别为，可选自如SEQ ID NOs：7-10中的任一序列，以及SEQ ID NO：11所示序列，优选上下游引物分别为SEQ ID NOs：10、11所示序列；进一步地，针对TERT点突变的上下游引物分别为，可选自如SEQ ID NOs：13-16中的任一序列，以及SEQ ID NO：17所示序列，优选上下游引物分别为SEQ ID NOs：16、17所示序列；进一步地，针对PLEKHS1点突变的上下游引物分别为，可选自如SEQ ID NOs：19-22中的任一序列，以及SEQ ID NO：23所示序列，优选上下游引物分别为SEQ ID NOs：22、23所示序列；进一步地，针对OTX1甲基化的上下游引物分别为，可选自如SEQ ID NOs：25、26中的任一序列，以及SEQ ID NOs：27-29所示的任一序列，优选上下游引物分别为SEQ ID NOs：25、29所示序列；进一步地，针对NID2甲基化的上下游引物分别为，可选自如SEQ ID NO：31所示序列，以及SEQ ID NOs：32-34所示的任一序列，优选上下游引物分别为SEQ ID NOs：31、34所示序列；进一步地，针对NRN1甲基化的上下游引物分别为，可选自如SEQ ID NO：36所示序列，以及SEQ ID NOs：37-39所示的任一序列，优选上下游引物分别为SEQ ID NOs：36、39所示序列；进一步地，所述的探针靠近待检位点；进一步地，所述的探针报告荧光基团包括：FAM、HEX、VIC、ROX等一种或多种探针报告荧光基团；猝灭基团包括：BHQ1、BHQ2、Cy3、Cy5等一种或多种猝灭基团；进一步地，所述的探针选自如SEQ IDNOs：12、18、24、30、35、40所示的任一序列或其组合；进一步地，所述内参基因为ATCB；进一步地，针对内参基因进行检测的引物和探针结构如SEQ ID NOs：41、42、43所示序列。
进一步地，所述检测点突变以及基因甲基化水平时进行的PCR反应条件为，
此外，本发明还提供了上述引物、探针以及检测试剂、诊断试剂盒和检测系统在制备诊断或辅助诊断膀胱癌的产品中的用途。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明巧妙的实现了基因点突变和甲基化检测联合检测，检测了因待检位点突变类型不同而需分成两种模板检测，减少样本的需求量和实验操作步骤，检测周期；
2)本发明巧妙的设计检测反应程序，提供检测体系的稳定性和检测限，避免野生型模板扩增而出现假阳；
3)本发明巧妙的将膀胱驱动基因的点突变和甲基化联合检测，从两个维度评估样本的阴阳性，提高检测的特异性和灵敏度。
具体实施方式
实施例1尿液膀胱癌驱动基因点突变甲基化联合辅助诊断试剂盒的制备
1、引物探针设计
1)驱动基因点突变靶点及引物、探针
FGFR3 exon7
GTGCTGGGTGAGGGCCCTGGGGCGGCGCGGGGGTGGGGGCGGCAGTGGCGGTGGTGGTGAGGGAGGGGGTGGCCCCTGAGCGTCATCTGCCCCCACAGAGCGCT[C]CCCGCACCGGCCCATCCTGCAGGCGGGGCTGCCGGCCAACCAGACGGCGGTGCTGGGCAGCGACGTGGAGTTCCACTGCAAGGTGTACAGTGACGCACAGCCCCACATCCAGTGGCTCAAGCACGTGGA(SEQ ID NO：1)
c.746C>G
重盐转化后：
GTGTTGGGTGAGGGTTTTGGGGCGGCGCGGGGGTGGGGGCGGTAGTGGCGGTGGTGGTGAGGGAGGGGGTGGTTTTTGAGCGTTATTTGTTTTTATAGAGCGTT[T]TTCGTATCGGTTTATTTTGTAGGCGGGGTTGTCGGTTAATTAGACGGCGGTGTTGGGTAGCGACGTGGAGTTTTATTGTAAGGTGTATAGTGACGTATAGTTTTATATTTAGTGGTTTAAGTACGTGGA
FGFR3-ARMS-F1:GAGCGTTATTTGTTTTTATAGAGCGTTG(SEQ ID NO：7)
FGFR3-ARMS-F2:TTGAGCGTTATTTGTTTTTATAGAGCGTTGT(SEQ ID NO：8)
FGFR3-ARMS-F3:GAGCGTTATTTGTTTTTATAGAGCGTTGTT(SEQ ID NO：9)
FGFR3-ARMS-F4:GAGCGTTATTTGTTTTTATAGAGCGGTG(SEQ ID NO：10)
FGFR3-ARMS-R:TAAAACTATACGTCACTATACACCTTAC(SEQ ID NO：11)
FGFR3-ARMS-FAM:CGTATCGGTTTATTTTGTAGGCGGGGTTGTCG(SEQ ID NO：12)
TERT promoter
GCTTCCCACGTGCGCAGCAGGACGCAGCGCTGCCTGAAACTCGCGCCGCGAGGAGAGGGCGGGGCCGCGGAAAGGAAGGGGAGGGGCTGGGAGGGCCCGGAGGGGGCTGGGCCGGGGACCCGG[G]AGGGGTCGGGACGGGGCGGGGTCCGCGCGGAGGAGGCGGAGCTGGAAGGTGAAGGGGCAGGACGGGTGCCCGGGTCCCCAGTCCCTCCGCCACGTGGGAAG(SEQ ID NO：2)
c.1-146C>T
重盐转化后
GTTTTTTACGTGCGTAGTAGGACGTAGCGTTGTTTGAAATTCGCGTCGCGAGGAGAGGGCGGGGTCGCGGAAAGGAAGGGGAGGGGTTGGGAGGGTTCGGAGGGGGTTGGGTCGGGGATTCGG[G]AGGGGTCGGGACGGGGCGGGGTTCGCGCGGAGGAGGCGGAGTTGGAAGGTGAAGGGGTAGGACGGGTGTTCGGGTTTTTAGTTTTTTCGTTACGTGGGAAG
TERT-ARMS-F1:GAGGGGGTTGGGTCGGGGATTCGGA(SEQ ID NO：13)
TERT-ARMS-F2:GGGTTGGGTCGGGGATTCGGAA(SEQ ID NO：14)
TERT-ARMS-F3:GGTTGGGTCGGGGATTCGGAAG(SEQ ID NO：15)
TERT-ARMS-F4:GAGGGGGTTGGGTCGGGGATTCTGA(SEQ ID NO：16)
TERT-ARMS-R:CCGAACACCCGTCCTACCCCTTCA(SEQ ID NO：17)
TERT-ARMS-HEX:TCGGGACGGGGCGGGGTTCGCG(SEQ ID NO：18)
PLEKHS1
GAGCACTGGACCAGCGACCTCTTGGCTTCCAGTAAGTACTGCTTGGTGTATCTGGTTTGGACTTCCAAGGCTGGGATGATCTAGAAGCTTTTTTGCAATT[G]AACAATTGCAAAATTGGAAATGGAAAATTTTGCAGATATGCTGTATTTCTGTTATGGGCACTTTCTTCATAAGCTTCCTAGGCTATACTATAGTCAGAGGGAA(SEQ ID NO：3)
重盐转化后
GAGTATTGGATTAGCGATTTTTTGGTTTTTAGTAAGTATTGTTTGGTGTATTTGGTTTGGATTTTTAAGGTTGGGATGATTTAGAAGTTTTTTTGTAATT[G]AATAATTGTAAAATTGGAAATGGAAAATTTTGTAGATATGTTGTATTTTTGTTATGGGTATTTTTTTTATAAGTTTTTTAGGTTATATTATAGTTAGAGGGAA
G>A
PLEKHS1-ARMS-F1:GATGATTTAGAAGTTTTTTTGTAATTA(SEQ ID NO：19)
PLEKHS1-ARMS-F2:GATGATTTAGAAGTTTTTTTGTAATTAA(SEQ ID NO：20)
PLEKHS1-ARMS-F3:GGATGATTTAGAAGTTTTTTTGTAATTAAA(SEQ ID NO：21)
PLEKHS1-ARMS-F4:GATGATTTAGAAGTTTTTTTGTAAGTA(SEQ ID NO：22)
PLEKHS1-ARMS-R:CTTATAAAAAAAATACCCATAACAAAAATAC(SEQ ID NO：23)
PLEKHS1-ARMS-ROX:TAAAATTGGAAATGGAAAATTTTGTAGATATG(SEQ ID NO：24)
2)驱动基因甲基化模板及引物、探针
>OTX1
甲基化位点模板：
CGTTTGGAGGTTTTTTGATTTGTTTTTATATTTAATTTTGTGTAAATTTTTTATTTCGTTTGTCGGGGTGGGGGAGTGGGGGAGATTAGAAATAAGGGGTAGAAATTTTT[CG]AAAGGGAATAAAGTGTTTAATTTTTAGGAGGAGGTGTTATTTAAAAGATT[CG]TTTAGTTTAGAGTTGGTTT[CG]GGTGGGAAATGGGTTT[CG]TT[CG]TA[CG]AATAATT[CG]GGGAAAT[CG]TTTTAAGGAGGATTTTTA[CG]TAGTATGTGGAAAAAAGTTGAGGGTAGGGGTTTGTGGTTATATTTTTTATTAAAAAGTTTTTGTTAGAGGTAGTTTAAGAAAGAGAGAGAAAGAGCGAAAAAGAAATTTTT(SEQ ID NO：4)
OTX1-bis-ARMS-F1:CGTTTAGTTTAGAGTTGGTTTCG(SEQ ID NO：25)
OTX1-bis-ARMS-F2:AGTTTAGAGTTGGTTTCGGG(SEQ ID NO：26)
OTX1-bis-ARMS-R1:CTACGTAAAAATCCTCCTTAAAACG(SEQ ID NO：27)
OTX1-bis-ARMS-R2:CTACGTAAAAATCCTCCTTAAAAC(SEQ ID NO：28)
OTX1-bis-ARMS-R3:CTACGTAAAAATCCTCCTTAAATCG(SEQ ID NO：29)
OTX1-bis-ARMS-FAM:ATGGGTTTCGTTCGTACGAATAA(SEQ ID NO：30)
>NID2
GTAGTGGTTATTATATTTGGTTTTCGTTAATTTTTTTAAGGTAGCGGTCGTTGGAGTAGCGGGGTTGGCGGGGTAAAAGTTTTTGGTTAGGGTTGTTTGGAGTTGTTTTTTTTATTT[CG]TTTTTAGGGAGTTTT[CG]GGTTATTTTTTTATT[CG]GGTTGTTT[CG][CG]GTTTTTAAGGAGTTTTATTTT[CG]GGATTAAATGGTT[CG]TAAGGTTTGGGGTAG[CG]G[CG]TTGTAGGAGATGAGTTTAG[CG]TAAAGGGAATTT[CG]TAGCGGCGAGTGCGGTTGTTGGTTTGCGCGTTGTGGTTTTAATAGGTTGGTAGGGCGCGGGCGGGTGGCGGGGTTGCGGTATGAGTTTTGTTTTTTGTTTTG(SEQ ID NO：5)
NID2–bis-ARMS-F1:GGTTAGGGTTGTTTGGAGTTGT(SEQ ID NO：31)
NID2–bis-ARMS-R1:CAAACCTTACGAACCATTTAATCCC(SEQ ID NO：32)
NID2–bis-ARMS-R2:CAAACCTTACGAACCATTTAATACC(SEQ ID NO：33)
NID2–bis-ARMS-R3:CAAACCTTACGAACCATTTAATCAC(SEQ ID NO：34)
NID2–bis-ARMS-HEX:CGGGTTGTTTCGCGcgGTTTTTAAGGAG(SEQ ID NO：35)
NRN1
TCGGGAGGATCGGATATTTTAATTTTTCGGTTTTTAACGCGGGCGTTTGTTCGCGAGCGTCGGGTTAGACGTCGAAGAGGAAGGTGATCGAATTCGTAGTAGTTTTCGAGAGCGTATTCGTTTGTAAATTGTTGTAGGAAGAG[CG]AGG[CG]GGTTTTG[CG]TTTTTTAATT[CG]GAA[CG]GGAAGTATTGGGGAAGGGAT[CG]AGGTTAATTT[CG]ATTTT[CG]TTGGGGTAGATA[CG]TAAATTTTTTTAAATTTT[CG]AGTTTATTTTATAG[CG]AATATTAAATATTTTTG[CG]ATTATAATATTAATAAATCGAATATTGA[CG]TAAAATTTTAAGAATAAACGAATTTTT(SEQ IDNO：6)
NRN1-bis-ARMS-F1:GTTTGTAAATTGTTGTAGGAAGCGC(SEQ ID NO：36)
NRN1-bis-ARMS-ROX:ATCGAAATTAACCTCGATCCCTTCC(SEQ ID NO：37)
NRN1-bis-ARMS-R2:ATATTCGCTATAAAATAAACCCG(SEQ ID NO：38)
NRN1-bis-ARMS-R3:CGTTTATTCTTAAAATTTTCCG(SEQ ID NO：39)
NRN1-bis-ARMS-R1:ATAATCGCAAAAATATTTAATATCCG(SEQ ID NO：40)
上述[]区域为检测位点
3)ATCB基因引物和探针
ATCB-BIS-F2:AGTGAGAAAGGGTGTAGTTTTGGGAG(SEQ ID NO：41)
ATCB-BIS-R3:CCACAAAAAAATAACCCAAATAAATAACCCACT(SEQ ID NO：42)
ATCB-VIC:CCTCTTCTAATAACCACCTCCCTCCTTCCTAAC(SEQ ID NO：43)
2、试剂盒的配制及组成
本发明所述的尿液膀胱癌驱动基因点突变甲基化联合检测试剂盒主要成分包括以下：
| 试剂名称 | 主要成分 |
| primer&probe A | 3个驱动基因点突变和内参引物探针混合液 |
| primer&probe B | 3个驱动基因甲基化和内参引物探针混合液 |
| Gold 360Master MIX | DNA聚合酶、Mg2+、dN(U)TPs、 |
| PCR增强剂 | DTT、BSA等 |
| 点突变阳性质控品 | 包装阳性突变质粒的腺病毒 |
| 甲基化阳性质控品 | 甲基化酶转化后的甲基化阳性核酸 |
| 阴性质控品 | 野生型的质粒转染后T细胞 |
| NF-H2O | 无核酶水 |
primer&probe A:将FGFR3\TERT\PLEKHS1\ATCB四个基因的引物探针合适的比例混合，配制成primer&probe A。
primer&probe B：将OTX1\NRN1\NID2\ATCB四个基因的甲基化检测引物探针合适比例混合，配制成primer&probe B。
3、试剂盒的反应体系及检测程序
同一例样本分别进行驱动基因点突变和甲基化检测。既同一份样本核酸按照重盐转化试剂说明书(EZ DNA Methylation-Gold,Cat D5005)进行重盐转化，一部核酸用于基因点突变检测。如下表配制样本检测体系：
基因点突变检测反应体系(反应管A):
| 试剂名称 | 反应体积(uL) |
| Primer&Probe A | 2 |
| HotstarHITaq DNA polymerase | 1 |
| HotstarHiTaq Buffer | 24 |
| PCR增强剂 | 1 |
| 待检测核酸 | 5 |
| NF-H2O | 17 |
| 总体积 | 50 |
基因甲基化检测反应体系(反应管B):
| 试剂名称 | 反应体积(uL) |
| Primer&Probe B | 2 |
| HotstarHiTaq DNA polymerase | 1 |
| HotstarHiTaq Buffer | 24 |
| PCR增强剂 | 1 |
| 重盐转化纯化的核酸 | 5 |
| NF-H2O | 17 |
| 总体积 | 50 |
待检测样本按照上述表格配制反应体系，涡旋混匀，置于热循环仪上，按照下列程序进行检测：
4、阴阳性判读标准
按照下表对检测样本进行阴阳性判读
实施例2尿液膀胱癌驱动基因点突变甲基化联合辅助诊断试剂盒的引物探针优化对点突变的引物组合及引物使用浓度进行筛选和优化，按照下表进行引物组筛选及浓度优化测试
对甲基化引物探针按照下表进行组合筛选和浓度优化：
按照实施例1，配方反应体系，采用点突变阳性质控品、甲基化阳性质控品、阴性质控品为体系测试模板，分别对以上述表格进行引物探针的引物组合和浓度测试检测。
测试结果：
引物探针组合特异性测试结果：
引物探针浓度梯度测试结果对比表
根据引物的特异性和扩增效率综合评估，获得最优的引物探针组合及浓度见下表：
实施例3尿液膀胱癌驱动基因点突变甲基化联合辅助诊断试剂盒检测反应酶和检测程序优化
点突变阳性质控品、甲基化阳性质控品、阴性质控品为检测模板(10个重复)
分别按照下表检测反应酶和检测程序的优化测试：
标准的qPCR检测程序为：实施例1中的第一阶段、第三阶段、第四阶段组成。
测试结果：
综上所述，最优的反应酶体系为Glod 360Master MIX。
综上所述，最优的反应检测程序为本发明的检测程序。
实施例4尿液膀胱癌驱动基因点突变甲基化联合辅助诊断试剂盒检测限
按照下表，将点突变阳性质粒(E10 UI)和甲基化阳性质粒(甲基化水平100％)，分别通过一代测序验证。阴性质粒为无上述检测突变和非甲基化DNA质粒(E10 UI).，并以上样本梯度稀释，绘制点突变定量标准曲线和甲基化水平标准曲线。
按照上述表梯度稀释，配制相应的检测含量的阳性样本和阴性样本，按照最优检测方法其最优检测方法参数，如下表所示)对样本进行检测，并统计阳性样本理论检测值，实际检测值、CV。
最优的检测反应体系如下：
点突变反应体系：
基因甲基化反应体系
最优的检测反应程序：
阴阳性判断标准：
测试结果
实施例5尿液膀胱癌驱动基因点突变甲基化联合辅助诊断试剂盒临床小试
根据临床试验测试要求，获得100例(53例病例阴性的血尿样本，47例病例阳性的血尿样本)。分别采用核酸提取试剂盒对尿液沉淀样本进行核酸提取，同时取100ng尿液沉淀核酸进重盐转化(参见说明书进行重盐转化操作)，按照如上所述的最优检测方法(实施例1阴阳性判读标准、实施例2最优的引物探针组合、实施3最优的检测反应体系)，对临床100例样本进行检测测试。分别统计真阳，真阴，假阳、假阴样本数目，并统计相应的特异性，灵敏度性能。
检测结果
点突变检测结果
| 真阳 | 假阴 | 真阴 | 假阳 | ||
| 病理阳性样本 | 47 | 40 | 7 | ||
| 病理阴性样本 | 53 | 48 | 5 |
基因甲基化检测结果：
| 真阳 | 假阴 | 真阴 | 假阳 | ||
| 病理阳性样本 | 47 | 38 | 9 | ||
| 病理阴性样本 | 53 | 53 | 0 |
| 特异性(％) | 灵敏度(％) | 阳性预测值(％) | 阴性预测值(％) |
| 80.85 | 100 | 100 | 85.48 |
点突变及基因甲基化联合检测结果：
| 真阳 | 假阴 | 真阴 | 假阳 | ||
| 病理阳性样本 | 47 | 43 | 4 | ||
| 病理阴性样本 | 53 | 53 | 0 |
| 特异性(％) | 灵敏度(％) | 阳性预测值(％) | 阴性预测值(％) |
| 91.48 | 100 | 100 | 92.98 |
上面所述的只是说明本发明的一些实施方式，由于对相同技术领域的普通技术人员来说很容易在此基础上进行若干修改和改动，因此本说明书并非是要将本发明局限在所示和所述的具体结构、方法步骤和适用范围内，故凡是所有可能被利用的相应修改及等同物，均属于本发明所申请的专利范围。
序列表
<110> 申请人：湖南大地同年生物科技有限公司
<120> 一种膀胱癌驱动基因点突变甲基化联合辅助诊断方法、试剂盒、系统及应用
<130> 43
<160> 43
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1（点突变信息序列为显示）
<211> 234
<212> DNA
<213> human
<400> 1（点突变信息序列为显示）
gtgctgggtg agggccctgg ggcggcgcgg gggtgggggc ggcagtggcg gtggtggtga 60
gggagggggt ggcccctgag cgtcatctgc ccccacagag cgctccccgc accggcccat 120
cctgcaggcg gggctgccgg ccaaccagac ggcggtgctg ggcagcgacg tggagttcca 180
ctgcaaggtg tacagtgacg cacagcccca catccagtgg ctcaagcacg tgga 234
<210> 2（点突变信息序列为显示）
<211> 225
<212> DNA
<213> human
<400> 2（点突变信息序列为显示）
gcttcccacg tgcgcagcag gacgcagcgc tgcctgaaac tcgcgccgcg aggagagggc 60
ggggccgcgg aaaggaaggg gaggggctgg gagggcccgg agggggctgg gccggggacc 120
cgggaggggt cgggacgggg cggggtccgc gcggaggagg cggagctgga aggtgaaggg 180
gcaggacggg tgcccgggtc cccagtccct ccgccacgtg ggaag 225
<210> 3（点突变信息序列为显示）
<211> 204
<212> DNA
<213> human
<400> 3（点突变信息序列为显示）
gagcactgga ccagcgacct cttggcttcc agtaagtact gcttggtgta tctggtttgg 60
acttccaagg ctgggatgat ctagaagctt ttttgcaatt gaacaattgc aaaattggaa 120
atggaaaatt ttgcagatat gctgtatttc tgttatgggc actttcttca taagcttcct 180
aggctatact atagtcagag ggaa 204
<210> 4
<211> 351
<212> DNA
<213> human
<400> 4
cgtttggagg ttttttgatt tgtttttata tttaattttg tgtaaatttt ttatttcgtt 60
tgtcggggtg ggggagtggg ggagattaga aataaggggt agaaattttt saaagggaat 120
aaagtgttta atttttagga ggaggtgtta tttaaaagat tstttagttt agagttggtt 180
tsggtgggaa atgggtttst tstasaataa ttsgggaaat sttttaagga ggatttttas 240
tagtatgtgg aaaaaagttg agggtagggg tttgtggtta tattttttat taaaaagttt 300
ttgttagagg tagtttaaga aagagagaga aagagcgaaa aagaaatttt t 351
<210> 5
<211> 349
<212> DNA
<213> human
<400> 5
gtagtggtta ttatatttgg ttttcgttaa tttttttaag gtagcggtcg ttggagtagc 60
ggggttggcg gggtaaaagt ttttggttag ggttgtttgg agttgttttt tttatttstt 120
tttagggagt tttsggttat ttttttatts ggttgtttss gtttttaagg agttttattt 180
tsggattaaa tggttstaag gtttggggta gsgsttgtag gagatgagtt tagstaaagg 240
gaatttstag cggcgagtgc ggttgttggt ttgcgcgttg tggttttaat aggttggtag 300
ggcgcgggcg ggtggcgggg ttgcggtatg agttttgttt tttgttttg 349
<210> 6
<211> 330
<212> DNA
<213> human
<400> 6
tcgggaggat cggatatttt aatttttcgg tttttaacgc gggcgtttgt tcgcgagcgt 60
cgggttagac gtcgaagagg aaggtgatcg aattcgtagt agttttcgag agcgtattcg 120
tttgtaaatt gttgtaggaa gagsaggsgg ttttgstttt ttaattsgaa sggaagtatt 180
ggggaaggga tsaggttaat ttsattttst tggggtagat astaaatttt tttaaatttt 240
sagtttattt tatagsaata ttaaatattt ttgsattata atattaataa atcgaatatt 300
gastaaaatt ttaagaataa acgaattttt 330
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> human
<400> 7
gagcgttatt tgtttttata gagcgttg 28
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> human
<400> 8
ttgagcgtta tttgttttta tagagcgttg t 31
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> human
<400> 9
gagcgttatt tgtttttata gagcgttgtt 30
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> human
<400> 10
gagcgttatt tgtttttata gagcggtg 28
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> human
<400> 11
taaaactata cgtcactata caccttac 28
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> human
<400> 12
cgtatcggtt tattttgtag gcggggttgt cg 32
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> human
<400> 13
gagggggttg ggtcggggat tcgga 25
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> human
<400> 14
gggttgggtc ggggattcgg aa 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> human
<400> 15
ggttgggtcg gggattcgga ag 22
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> human
<400> 16
gagggggttg ggtcggggat tctga 25
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> human
<400> 17
ccgaacaccc gtcctacccc ttca 24
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> human
<400> 18
tcgggacggg gcggggttcg cg 22
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> human
<400> 19
gatgatttag aagttttttt gtaatta 27
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> human
<400> 20
gatgatttag aagttttttt gtaattaa 28
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> human
<400> 21
ggatgattta gaagtttttt tgtaattaaa 30
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> human
<400> 22
gatgatttag aagttttttt gtaagta 27
<210> 23
<211> 31
<212> DNA
<213> human
<400> 23
cttataaaaa aaatacccat aacaaaaata c 31
<210> 24
<211> 32
<212> DNA
<213> human
<400> 24
taaaattgga aatggaaaat tttgtagata tg 32
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> human
<400> 25
cgtttagttt agagttggtt tcg 23
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> human
<400> 26
agtttagagt tggtttcggg 20
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> human
<400> 27
ctacgtaaaa atcctcctta aaacg 25
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> human
<400> 28
ctacgtaaaa atcctcctta aaac 24
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> human
<400> 29
ctacgtaaaa atcctcctta aatcg 25
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> human
<400> 30
tgggtttcgt tcgtacgaat aa 22
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> human
<400> 31
ggttagggtt gtttggagtt gt 22
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> human
<400> 32
caaaccttac gaaccattta atccc 25
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> human
<400> 33
caaaccttac gaaccattta atacc 25
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> human
<400> 34
caaaccttac gaaccattta atcac 25
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> human
<400> 35
cgggttgttt ssgtttttaa ggag 24
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> human
<400> 36
gtttgtaaat tgttgtagga agcgc 25
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> human
<400> 37
atcgaaatta acctcgatcc cttcc 25
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> human
<400> 38
atattcgcta taaaataaac ccg 23
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> human
<400> 39
cgtttattct taaaattttc cg 22
<210> 40
<211> 26
<212> DNA
<213> human
<400> 40
ataatcgcaa aaatatttaa tatccg 26
<210> 41
<211> 26
<212> DNA
<213> human
<400> 41
agtgagaaag ggtgtagttt tgggag 26
<210> 42
<211> 33
<212> DNA
<213> human
<400> 42
ccacaaaaaa ataacccaaa taaataaccc act 33
<210> 43
<211> 33
<212> DNA
<213> human
<400> 43
cctcttctaa taaccacctc cctccttcct aac 33
Claims (8)
1.一种针对膀胱癌发生相关通路基因筛查膀胱癌的检测试剂，其包括针对待检区域的模板设计的特异性的引物和探针，所述待检区域为基因点突变和基因甲基化的组合；其基因点突变为针对FGFR3、TERT以及PLEKHS1组合的点突变；其基因甲基化为针对OTX1、NID2、NRN1组合的甲基化；
其针对FGFR3点突变的待检区域为如SEQ ID NO：1所示序列；
其针对TERT点突变的待检区域为如SEQ ID NO：2所示序列；
其针对PLEKHS1点突变的待检区域为如SEQ ID NO：3所示序列；
其针对OTX1甲基化的待检区域为如SEQ ID NO：4所示序列；
其针对NID2甲基化的待检区域为如SEQ ID NO：5所示序列；
其针对NRN1甲基化的待检区域为如SEQ ID NO：6所示序列；
进一步将所述检测试剂针对点突变以及甲基化水平的引物、探针分配在不同的反应管中；
所述反应管分别为反应管A以及反应管B，
其中反应管A组成如下所示：
其中Primer&Probe A为由FGFR3TERTPLEKHS1的3个驱动基因点突变和内参引物探针制成的混合液；
反应管B组成如下所示：
其中Primer&Probe B为由OTX1NRN1NID2的3个驱动基因点突变和内参引物探针制成的混合液；
所述检测试剂包括如下成分：
其中primer＆probe A中各引物对、探针的结构以及浓度为：
针对FGFR3点突变的上下游引物、探针分别为SEQ ID NOs：10、11、12所示序列，其浓度分别为25μM，25μM，15μM；
针对TERT点突变的上下游引物、探针分别为SEQ ID NOs：16、17、18所示序列，其浓度分别为25μM，25μM，10μM；
针对PLEKHS1点突变的上下游引物、探针分别为SEQ ID NOs：22、23、24所示序列，其浓度分别为25μM，25μM，8μM；
针对内参基因的上下游引物、探针分别为SEQ ID NOs：41、42、43所示序列，其浓度分别为2.5μM，2.5μM，5μM；
其中primer＆probe B中各引物对、探针的结构以及浓度为：
针对OTX1甲基化的上下游引物、探针分别为SEQ ID NOs：25、29、30所示序列，其浓度分别为25μM，25μM，15μM；
针对NID2甲基化的上下游引物、探针分别为SEQ ID NOs：31、34、35所示序列，其浓度分别为25μM，25μM，15μM；
针对NRN1甲基化的上下游引物、探针分别为SEQ ID NOs：36、38、37所示序列，其浓度分别为25μM，25μM，15μM；
针对内参基因的上下游引物、探针分别为SEQ ID NOs：41-43所示序列，其浓度分别为2.5μM，2.5μM，5μM。
2.一种针对膀胱癌发生相关通路基因筛查或辅助诊断膀胱癌的检测试剂盒，其包括如权利要求1所述的检测试剂。
3.一种利用权利要求1所述的检测试剂针对膀胱癌发生相关通路基因筛查膀胱癌的检测系统，其用于执行以下步骤，1）对样本核酸进行提取；2）将提取的核酸分配为点突变检测反应模块以及甲基化检测反应模块；3）对甲基化检测反应模块中的核酸进行重盐转化处理；4）分别对点突变检测反应模块以及经重盐转化处理的甲基化检测反应模块检测点突变以及基因甲基化水平；5）对检测结果进行阴阳性判断分析。
4.如权利要求3所述的检测系统，所述重盐转化处理是通过亚硫酸盐进行转化。
5.如权利要求3-4任一项所述的检测系统，所述样本为尿液。
6.如权利要求3-5任一项所述的检测系统，通过如权利要求1所述的检测试剂，或权利要求2所述的检测试剂盒执行检测点突变以及基因甲基化水平的步骤。
7.如权利要求3-6任一项所述的检测系统，通过如下PCR反应程序执行检测点突变以及基因甲基化水平的步骤：
8.如权利要求1所述的检测试剂，或权利要求2所述的检测试剂盒，或权利要求3-7任一项所述的检测系统在制备诊断或辅助诊断膀胱癌的产品中的用途。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910988473.XA CN110628910B (zh) | 2019-10-17 | 2019-10-17 | 一种膀胱癌驱动基因点突变甲基化联合辅助诊断方法、试剂盒、系统及应用 |
| US17/298,299 US20220259664A1 (en) | 2019-10-17 | 2020-03-11 | Combined auxiliary diagnostic method, kit, system and use of point mutation and methylation of bladder cancer driver genes |
| PCT/CN2020/078811 WO2021073029A1 (zh) | 2019-10-17 | 2020-03-11 | 一种膀胱癌驱动基因点突变和甲基化联合辅助诊断方法、试剂盒、系统及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910988473.XA CN110628910B (zh) | 2019-10-17 | 2019-10-17 | 一种膀胱癌驱动基因点突变甲基化联合辅助诊断方法、试剂盒、系统及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110628910A CN110628910A (zh) | 2019-12-31 |
| CN110628910B true CN110628910B (zh) | 2023-06-20 |
Family
ID=68976643
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910988473.XA Active CN110628910B (zh) | 2019-10-17 | 2019-10-17 | 一种膀胱癌驱动基因点突变甲基化联合辅助诊断方法、试剂盒、系统及应用 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220259664A1 (zh) |
| CN (1) | CN110628910B (zh) |
| WO (1) | WO2021073029A1 (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110628910B (zh) * | 2019-10-17 | 2023-06-20 | 湖南大地同年生物科技有限公司 | 一种膀胱癌驱动基因点突变甲基化联合辅助诊断方法、试剂盒、系统及应用 |
| CN113528672B (zh) * | 2021-09-14 | 2021-11-30 | 北京求臻医疗器械有限公司 | 用于膀胱癌早期筛查的引物和探针组合、试剂盒及应用 |
| WO2023082142A1 (zh) * | 2021-11-11 | 2023-05-19 | 华大数极生物科技(深圳)有限公司 | 用于检测肝癌的otx1甲基化标志物 |
| CN115786502B (zh) * | 2022-07-14 | 2023-08-01 | 武汉艾米森生命科技有限公司 | 检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌的诊断产品中的应用 |
| CN116987787A (zh) * | 2023-06-09 | 2023-11-03 | 北京泛生子基因科技有限公司 | 检测膀胱癌是否复发的装置和计算机可读存储介质 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013173478A1 (en) * | 2012-05-15 | 2013-11-21 | Predictive Biosciences, Inc. | Screening assay for bladder cancer |
| CN105586422A (zh) * | 2016-02-19 | 2016-05-18 | 苏州捷诺威生物科技有限公司 | 一种检测tert基因启动子突变的试剂盒、其检测方法及应用 |
| WO2017067477A1 (en) * | 2015-10-20 | 2017-04-27 | Hung-Cheng Lai | Methods for making diagnosis and/or prognosis of gynecologic neoplasm |
| CN107592885A (zh) * | 2015-02-24 | 2018-01-16 | 兹莫研究公司 | 测定dna甲基化的分析法和癌症的dna甲基化标记 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013116705A1 (en) * | 2012-02-02 | 2013-08-08 | Predictive Biosciences, Inc. | Composite assay for detecting a clinical condition |
| US9096905B2 (en) * | 2012-02-23 | 2015-08-04 | Medical Diagnostic Laboratories, Llc | Detecting DNA methylation of BCL2, CDKN2A and NID2 genes to predict bladder cancer in humans |
| CN103451267B (zh) * | 2012-05-31 | 2015-12-16 | 益善生物技术股份有限公司 | Tert基因突变检测特异性引物和液相芯片 |
| WO2015049063A1 (en) * | 2013-10-02 | 2015-04-09 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Human tert promoter variants, as well as kits, methods and uses thereof |
| US20180087114A1 (en) * | 2015-03-05 | 2018-03-29 | Trovagene, Inc. | Early assessment of mechanism of action and efficacy of anti-cancer therapies using molecular markers in bodily fluid |
| CN106148516A (zh) * | 2016-06-29 | 2016-11-23 | 苏州捷诺威生物科技有限公司 | 一种用于检测tert基因启动子突变的试剂盒及其检测方法和应用 |
| KR101857227B1 (ko) * | 2017-07-31 | 2018-05-11 | (주)다이오진 | 다중 증폭 이중 시그널 증폭에 의한 암 유전자 분석 방법 및 이를 위한 암 유전자 분석용 키트 |
| CN108531594A (zh) * | 2018-04-19 | 2018-09-14 | 安徽达健医学科技有限公司 | 一种多基因联合用于膀胱癌早期筛查的无创检测方法及其试剂盒 |
| CN108588219B (zh) * | 2018-04-19 | 2021-10-26 | 安徽达健医学科技有限公司 | 一种用于早期膀胱癌检测的试剂盒及其使用方法 |
| CN110628910B (zh) * | 2019-10-17 | 2023-06-20 | 湖南大地同年生物科技有限公司 | 一种膀胱癌驱动基因点突变甲基化联合辅助诊断方法、试剂盒、系统及应用 |
-
2019
- 2019-10-17 CN CN201910988473.XA patent/CN110628910B/zh active Active
-
2020
- 2020-03-11 US US17/298,299 patent/US20220259664A1/en active Pending
- 2020-03-11 WO PCT/CN2020/078811 patent/WO2021073029A1/zh active Application Filing
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013173478A1 (en) * | 2012-05-15 | 2013-11-21 | Predictive Biosciences, Inc. | Screening assay for bladder cancer |
| CN107592885A (zh) * | 2015-02-24 | 2018-01-16 | 兹莫研究公司 | 测定dna甲基化的分析法和癌症的dna甲基化标记 |
| WO2017067477A1 (en) * | 2015-10-20 | 2017-04-27 | Hung-Cheng Lai | Methods for making diagnosis and/or prognosis of gynecologic neoplasm |
| CN105586422A (zh) * | 2016-02-19 | 2016-05-18 | 苏州捷诺威生物科技有限公司 | 一种检测tert基因启动子突变的试剂盒、其检测方法及应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| GÉRALDINE PIGNOT et al.PLEKHS1: A new molecular marker predicting risk of progression of non‑muscle‑invasive bladder cancer.《ONCOLOGY LETTERS》.2019,第18卷参见摘要、第3742页右栏. * |
| 膀胱癌尿液肿瘤标志物的研究进展;王宏磊等;《医学综述》;20170805(第15期);全文 * |
| 膀胱肿瘤标记物的研究进展;徐春国等;《医学与哲学(B)》;20121223(第12期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2021073029A1 (zh) | 2021-04-22 |
| US20220259664A1 (en) | 2022-08-18 |
| CN110628910A (zh) | 2019-12-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110628910B (zh) | 一种膀胱癌驱动基因点突变甲基化联合辅助诊断方法、试剂盒、系统及应用 | |
| CN113265456B (zh) | 一种检测宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化的引物和探针组合 | |
| CN106987640A (zh) | Pik3ca基因突变检测引物探针及其试剂盒 | |
| CN113186283B (zh) | 一种定量检测U2AF1基因突变的drop-off ddPCR方法和试剂盒 | |
| CN113249475B (zh) | 一种定量检测NPM1基因突变的drop-off ddPCR方法和试剂盒 | |
| CN110484625A (zh) | 用于检测prky基因甲基化的引物探针组合物、试剂盒及检测方法 | |
| CN109182493A (zh) | 人16p11.2微缺失综合征检测的引物和试剂盒及其检测方法 | |
| CN113215260A (zh) | 一种gstp1，apc和rassf1在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒 | |
| CN106498028A (zh) | Egfr的t790m突变的诊断方法及试剂盒 | |
| CN113502335A (zh) | 一种与绵羊生长性状相关的分子标记及其应用 | |
| CN111826446A (zh) | 用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的引物、探针和试剂盒 | |
| CN110734978B (zh) | Dlx1，hoxc6和pca3在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒 | |
| WO2023098788A1 (zh) | 用于筛查肝癌的引物和探针、试剂盒及其应用 | |
| CN111500728A (zh) | 检测人ar-v7及ar基因表达的引物探针组合物、试剂盒及检测方法 | |
| CN109136367B (zh) | 提高braf基因v600e突变的诊断效率的方法 | |
| CN116121439A (zh) | 一种多重定量pcr检测真菌的方法以及试剂盒 | |
| CN109355362B (zh) | 一种高灵敏的SNPs检测体系及应用 | |
| CN113337608A (zh) | 用于肝癌早期诊断的组合标志物及其应用 | |
| CN112522403A (zh) | 使用多重荧光pcr技术检测znf384相关融合基因的引物、探针及应用 | |
| CN103966310A (zh) | 乳腺癌易感基因快速检测试剂盒及检测方法 | |
| CN114959030B (zh) | 检测hcg9基因甲基化的试剂在制备诊断膀胱癌的产品中的应用 | |
| CN115807091B (zh) | 基于微流控芯片式数字PCR的Septin9基因甲基化检测试剂盒 | |
| CN116970705A (zh) | 用于尿路上皮癌基因甲基化检测的核酸产品、试剂盒及应用 | |
| CN111411156A (zh) | 用于癌症早期检测的试剂盒及检测方法 | |
| CN118006769A (zh) | 一种肺癌相关7基因甲基化联合检测试剂盒及使用方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20191231 Assignee: Shenzhen same year medical equipment Co.,Ltd. Assignor: HUNAN YEARTH BIOTECHNOLOGICAL Co.,Ltd. Contract record no.: X2020430000003 Denomination of invention: Auxiliary diagnose method, reagent kit and system of bladder cancer through union of drive gene point mutation and methylation, and application License type: Common License Record date: 20200428 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |