CN108977531B - 一种人类高血压风险基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种人类高血压风险基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人类高血压风险基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。所述试剂盒由分别用于扩增与人类高血压风险相关的CYP2C9、CYP2D6、ADRB1、AGTR1和ACE 5个基因多态性的PCR预混反应液、阳性对照品及阴性对照品组成，所述PCR预混反应液包含用于扩增各位点的特异性引物序列组、探针组和PCR反应液，所述特异性引物组由普通的外引物和带荧光标签的特异性的ARMs引物组成。本发明所述试剂盒用于检测人类高血压风险基因多态性具有灵敏度高、特异性高、操作简便、结果可靠等优点，且能在1小时内完成检测，并且结果判读简单客观。

Description

一种人类高血压风险基因多态性检测试剂盒及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人类高血压风险基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
我国高血压患者人数高达数亿，并且发病率仍呈上升趋势，导致的并发症成为我国第二大死因。目前通过药物治疗控制血压以减少高血压并发症成为了高血压的主要治疗手段。然而治疗高血压的药物在临床上出现个体反应差异十分普遍，有20～50％接受药物治疗的患者的血压并没有得到良好的控制。遗传药理和药物基因组的研究进展表明药物代谢酶、转运体和受体(药物靶点)的遗传变异是造成个体药物反应差异的主要原因。通过基因检测鉴定出与高血压或血压升高相关的易感基因或致病基因，在人群中筛选增加疾病风险的易感基因确定易感个体，将有助于高血压的发病风险预测、新药开发、诊断和个体化治疗。
目前，与高血压风险评估及用药相关的基因主要有CYP2C9、CYP2D6、ADRB1、AGTR1和ACE基因(图1)，其主要影响β1受体阻滞剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB类药物)和血管紧张素转换酶(ACEI)抑制剂的疗效。具体的，ADRB1和CYP2D6与倍他乐克等β受体阻断药有关，ACE与依那普利等血管紧张素转化酶抑制剂有关，AGTR和CYP2C9与厄贝沙坦等血管紧张素II受体阻滞剂有关。
目前临床上主要采取以下四种方式检测基因的多态性：
1.PCR-测序法
2.高分辨率溶解曲线法
3.芯片杂交法
4.Taqman-qPCR法
PCR-测序法灵敏度低，实验耗时长，不适合临床推广；芯片杂交法，检测灵敏度低并且特异性差，容易出现假阳性结果；高分辨率溶解曲线法对设备要求特殊，不适合临床推广，且检测灵敏度不高。Taqman-qPCR法，检测灵敏度高，但往往由于位点序列原因，导致检测特异性不高，并且其通过Genotyping方法进行分型，对样本数量和多态性分布有一定要求，不适合检测突变频率过低的位点。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种人类高血压风险基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。本试剂盒具有高灵敏度、高特异性、低成本高通量、操作简便、实验周期短等特点，可以快速精准的对人类基因组DNA中高血压风险基因多态性进行检测。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种人类高血压风险基因多态性检测引物组，所述引物组由普通的外引物和带荧光标签的特异性的ARMs引物组成，具体序列如下：
CYP2C9-F1：5’-TTGTGGACTTCTCTTCCTTC-3’ SEQ ID NO.1
CYP2C9-F2：5’-VIC-ATCCCTTGTCATCGTCAGAGATACA-3’ SEQ ID NO.2
(特异性识别野生模板)
CYP2C9-R1：5’-GTCACCCTGCCAGAAAT-3’ SEQ ID NO.3
CYP2C9-R2：5’-FAM-AAGATACATTGATGAAGAAGATCAAG-3’ SEQ ID NO.4
(特异性识别突变模板)
CYP2D6-F1：5’-GAGAGTGTCCTGCCTGGT-3’ SEQ ID NO.5
CYP2D6-F2：5’-VIC-ATCCCTTGTCATCGTCTGCACACTACC-3’ SEQ ID NO.6
(特异性识别野生模板)
CYP2D6-R1：5’-CCCAAACCTGCTTCCC-3’ SEQ ID NO.7
CYP2D6-R2:5’-FAM-AAGATACATTGATGAGGCCTAGTGA-3’ SEQ ID NO.8
(特异性识别突变模板)
ADRB1-F1：5’-GACGCTGGGCATCATCATGG-3’ SEQ ID NO.9
ADRB1-F2：5’-VIC-ATCCCTTGTCATCGTGGCCTTACAGG-3’ SEQ ID NO.10
(特异性识别野生模板)
ADRB1-R1：5’-TGCAGCCGGCCCAGGGCTCCAG-3’ SEQ ID NO.11
ADRB1-R2:5’-FAM-AAGATACATTGATGACAGAGCATTCG-3’ SEQ ID NO.12
(特异性识别突变模板)
AGTR1-F1：5’-AATTTAAAAGATATTTTCTCCA-3’ SEQ ID NO.13
AGTR1-F2：5’-VIC-ATCCCTTGTCATCGTACCAAATGAGCA-3' SEQ ID NO.14
(特异性识别野生模板)
AGTR1-R1：5’-AGGGAGATTGCATTTCTGTC-3’ SEQ ID NO.15
AGTR1-R2：5’-FAM-AAGATACATTGATGAAAGTACCTAAG-3’ SEQ ID NO.16
(特异性识别突变模板)
ACE-F1：5’-GGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3’ SEQ ID NO.17
ACE-F2：5’-VIC-ATCCCTTGTCATCGTAGGGGAGATCAG-3’ SEQ ID NO.18
(特异性识别野生模板)
ACE-R1：5’-AGTGAGCCGAGATCCCGC-3’ SEQ ID NO.19
ACE-R2：5’-FAM-AAGATACATTGATGAAGAGAATCTCA-3’ SEQ ID NO.20
(特异性识别突变模板)
内控F：5’-CGGGACCTGACTGACTACCT-3’ SEQ ID NO.21
内控R：5’-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3’ SEQ ID NO.22。
一种人类高血压风险基因多态性检测探针组，所述探针组由特异性taqman-MGB探针和携带淬灭基团的锁核酸探针组成，具体序列如下：
内控-P：5’-ROX-ACCACCACGGCCGAGC-MGB-BHQ-3’ SEQ ID NO.23
野生型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-ACGATGACAAGGGAT-3’ SEQ ID NO.24
突变型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-TCATCAATGTATCTT-3’ SEQ ID NO.25。
一种人类高血压风险基因多态性检测试剂盒，所述试剂盒由分别用于扩增CYP2C9、CYP2D6、ADRB1、AGTR1、ACE位点的PCR预混反应液、阳性对照品及阴性对照品组成；所述PCR预混反应液的具体组分如下：
(1)用于扩增CYP2C9位点的PCR预混反应液包括：所述用于扩增CYP2C9基因rs1057910位点的引物、引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示，用于内控的引物序列、序列如SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.22所示，所述探针组、序列如SEQ ID NO.23～SEQ IDNO.25所示，以及PCR反应液组成；
(2)用于扩增CYP2D6位点的PCR预混反应液：所述用于扩增CYP2D6基因rs1065852位点的引物、引物序列如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示，用于内控的引物序列、序列如SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.22所示，所述探针组、序列如SEQ ID NO.23～SEQ ID NO.25所示，以及PCR反应液组成；
(3)用于扩增ADRB1位点的PCR预混反应液：所述用于扩增ADRB1基因rs1801253位点的引物、引物序列如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示，用于内控的引物序列、序列如SEQID NO.21～SEQ ID NO.22所示，所述探针组、序列如SEQ ID NO.23～SEQ ID NO.25所示，以及PCR反应液组成；
(4)用于扩增AGTR1位点的PCR预混反应液：所述用于扩增AGTR1基因rs5186位点的引物、引物序列如SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.16所示，用于内控的引物序列、序列如SEQ IDNO.21～SEQ ID NO.22所示，所述探针组、序列如SEQ ID NO.23～SEQ ID NO.25所示，以及PCR反应液组成；
(5)用于扩增ACE位点的PCR预混反应液：所述用于扩增ACE基因rs4646994位点的引物、引物序列如SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.20所示，用于内控的引物序列、序列如SEQ IDNO.21～SEQ ID NO.22所示，所述探针组、序列如SEQ ID NO.23～SEQ ID NO.25所示，以及PCR反应液组成；
所述阳性对照包含：CYP2C9 rs1057910位点野生型质粒、CYP2C9 rs1057910位点突变型质粒、CYP2D6 rs1065852位点野生型质粒、CYP2D6 rs1065852位点突变型质粒、ADRB1 rs1801253位点野生型质粒、ADRB1 rs1801253位点突变型质粒、AGTR1 rs5186位点野生型质粒、AGTR1 rs5186位点突变型质粒、ACE rs4646994位点野生型质粒、ACErs4646994位点野生型质粒及内参基因质粒DNA混合物；
所述阴性对照品由不包含内标基因和目的基因位点的重组质粒和TE缓冲液组成。
上述方案中，所述PCR预混反应液中，探针组内taqman-MGB探针的浓度为50～100nM，携带淬灭基团的锁核酸探针的浓度均为100～400nM；用于扩增各位点的不带荧光基团的各引物浓度均为100～400nM，带荧光基团的各引物浓度均为50～100nM；用于内控的引物的浓度均为100～400nM。
上述方案中，所述PCR反应液包括Premix qPCRmix和TE缓冲液。
上述方案中，所述阴性对照品由PUC-19质粒空载体和TE缓冲液组成。
上述人类高血压风险基因多态性检测试剂盒在制备用于检测人类高血压风险基因多态性产品中的应用。
采用人类高血压风险基因多态性检测试剂盒检测人类高血压风险基因多态性的过程，具体包括如下步骤：
(1)采用基因组DNA提取试剂盒提取待测人外周血的基因组DNA作为待检测样本；
(2)荧光定量检测：向反应管中加入PCR预混反应液和待测样本DNA；同时设置阳性对照组和阴性对照组，然后将反应管置于荧光PCR仪进行PCR扩增反应，并采集FAM、VIC和ROX荧光信号；
(3)PCR扩增反应结束后，根据所采集的荧光信号起线情况进行结果判定(见下表1)。
上述方案中，步骤(1)中将所述待检测样本DNA稀释到浓度为0.1～100ng/μL，再进行PCR扩增反应。
上述方案中，步骤(2)中所述PCR扩增反应的条件为：95℃1分钟预变性；15个循环：95℃5秒，61℃32秒，不收集荧光；30个循环：95℃5秒，61℃32秒，收集荧光。
上述方案中，步骤(3)所述结果判定的原则为(如下表1所示)：①当阳性对照组均有FAM、VIC、ROX荧光信号起线，阴性对照组均无FAM、VIC、ROX荧光起线，待检测样本有ROX荧光信号起线时，判定实验成功，可以进行后续分型判定；②根据检测样本的FAM、VIC荧光信号判断CYP2C9的分型：VIC荧光信号起线CYP2C9基因rs1057910位点分型为纯合野生型；FAM荧光信号起线，CYP2C9基因rs1057910位点分型为纯合突变型；VIC、FAM荧光信号均起线，CYP2C9基因rs1057910位点分型为杂合突变型；③根据检测样本的FAM、VIC荧光信号判断CYP2D6的分型：VIC荧光信号起线CYP2D6基因rs1065852位点分型为纯合野生型；FAM荧光信号起线，CYP2D6基因rs1065852位点分型为纯合突变型；VIC、FAM荧光信号均起线，CYP2D6基因rs1065852位点分型为杂合突变型；④根据检测样本的FAM、VIC荧光信号判断ADRB1的分型：VIC荧光信号起线ADRB1基因rs1801253位点分型为纯合野生型；FAM荧光信号起线，ADRB1基因rs1801253位点分型为纯合突变型；VIC、FAM荧光信号均起线，ADRB1基因rs1801253位点分型为杂合突变型；⑤根据检测样本的FAM、VIC荧光信号判断AGTR1的分型：VIC荧光信号起线AGTR1基因rs5186位点分型为纯合野生型；FAM荧光信号起线，AGTR1基因rs5186位点分型为纯合突变型；VIC、FAM荧光信号均起线，AGTR1基因rs5186位点分型为杂合突变型；⑥根据检测样本的FAM、VIC荧光信号判断ACE的分型：VIC荧光信号起线ACE基因rs4646994位点分型为纯合野生型；FAM荧光信号起线，ACE基因rs4646994位点分型为纯合突变型；VIC、FAM荧光信号均起线，ACE基因rs4646994位点分型为杂合突变型。
本发明所述人类高血压风险基因多态性检测试剂盒的检测原理如图2和图3所示，携带FAM荧光的带有标签序列的ARMs引物可特异性识别并扩增突变基因型的模板，并且随着引物的消耗，将更多的FAM荧光释放出来，在循环结束时，采集各通道荧光，生成荧光曲线；携带VIC荧光的带有标签序列的ARMs引物可特异性识别并扩增野生基因型的模板，并且随着引物的消耗，将更多的VIC荧光释放出来，在循环结束时，采集各通道荧光，生成荧光曲线。内控探针采用MGB探针，特异性识别内控相应序列，通过扩增，越来越多的ROX荧光被释放出来。所以当检测的基因组模板是纯合野生型，最终显示只有内控(ROX)和野生(VIC)荧光曲线可以正常起线且曲线呈S型，突变(FAM)荧光曲线不起线，或起线很低且不呈S型。当检测的基因组模板是纯合突变型，最终显示只有内控(ROX)和突变(FAM)荧光曲线可以正常起线且曲线呈S型，野生(VIC)荧光曲线不起线，或起线很低且不呈S型。当检测的基因组模板是杂合子，最终显示有内控(ROX)、突变(FAM)和野生(VIC)荧光曲线均可以正常起线且曲线呈S型。
本发明的有益效果如下：本发明所述人类高血压风险基因多态性检测试剂盒可以简单快速的检测人类高血压风险基因多态性分型，采用ARMs引物结合特异性荧光标签进行PCR反应实现了每个基因的多态性分型只需通过一个多重PCR反应即可完成，每个PCR反应中均含有内控，保证检测结果的准确性，防止假阴性和假阳性结果的出现；每个PCR反应体系中携带FAM或VIC荧光的带标签ARMs引物可以被相应带有淬灭基团的锁核酸锁定使荧光处于淬灭状态，PCR反应过程中，携带FAM或VIC荧光的带标签ARMs引物与待检测基因模板特异性结合后释放荧光生成荧光曲线进行结果判读；本发明利用携带荧光基团和标签序列的特异性ARMs引物结合携带淬灭基团的锁核酸序列、特异性的内控探针、和特异性的内控引物，可以大大提高基因分型的特异性和准确性；同时，两条外引物F1和R1也可以进行扩增，进一步富集基因组模板，可以大大提高分型效率，进而可以检测到更低浓度的基因组样本，本发明所述试剂盒最低可对0.1ng基因组DNA进行多态性检测；此外，本发明所述试剂盒采用预混合的方式进行包装，使用时仅需加入基因组DNA，可在1小时内完成高血压风险基因多态性的检测，并且结果判读简单客观，便于分析。
附图说明
图1为临床上与高血压风险相关基因及其发生频率。
图2为本发明所述试剂盒的检测原理示意图。
图3为本发明所述试剂盒的检测原理示意图。
图4为CYP2C9 rs1057910位点纯合野生型检测结果。
图5为CYP2C9 rs1057910位点杂合型检测结果。
图6为CYP2C9 rs1057910位点纯合突变型检测结果。
图7为CYP2D6 rs1065852位点纯合野生型检测结果。
图8为CYP2D6 rs1065852位点杂合型检测结果。
图9为CYP2D6 rs1065852位点纯合突变型检测结果。
图10为ADRB1 rs1801253位点纯合野生型检测结果。
图11为ADRB1 rs1801253位点杂合型检测结果。
图12为ADRB1 rs1801253位点纯合突变型检测结果。
图13为AGTR1 rs5186位点纯合野生型检测结果。
图14为AGTR1 rs5186位点杂合型检测结果。
图15为AGTR1 rs5186位点纯合突变型检测结果。
图16为ACE rs4646994位点纯合插入型检测结果。
图17为ACE rs4646994位点杂合型检测结果。
图18为ACE rs4646994位点纯合缺失型检测结果。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1制备本发明所述高血压风险基因检测试剂盒
一、引物设计和合成：
CYP2C9、CYP2D6、ADRB1、AGTR1和ACE 5个位点每个体系中包含6条引物；其中两条正义链上游引物F1和F2，两条反义链下游引物R1和R2，F1和R1为普通引物，F2和R2为带荧光基团和标签序列的特异性ARMs引物，通过引物和PCR反应条件筛选，保证引物对F1R1对模板进行富集，而F2和R1，F1和R2可正常扩增出带荧光的特定基因型PCR产物；同时，每个基因位点中均加入内参引物。
具体序列如下：
CYP2C9-F1：5’-TTGTGGACTTCTCTTCCTTC-3’ SEQ ID NO.1
CYP2C9-F2：5’-VIC-ATCCCTTGTCATCGTCAGAGATACA-3’ SEQ ID NO.2
(特异性识别野生模板)
CYP2C9-R1：5’-GTCACCCTGCCAGAAAT-3’ SEQ ID NO.3
CYP2C9-R2：5’-FAM-AAGATACATTGATGAAGAAGATCAAG-3’ SEQ ID NO.4
(特异性识别突变模板)
CYP2D6-F1：5’-GAGAGTGTCCTGCCTGGT-3’ SEQ ID NO.5
CYP2D6-F2：5’-VIC-ATCCCTTGTCATCGTCTGCACACTACC-3’ SEQ ID NO.6
(特异性识别野生模板)
CYP2D6-R1：5’-CCCAAACCTGCTTCCC-3’ SEQ ID NO.7
CYP2D6-R2:5’-FAM-AAGATACATTGATGAGGCCTAGTGA-3’ SEQ ID NO.8
(特异性识别突变模板)
ADRB1-F1：5’-GACGCTGGGCATCATCATGG-3’ SEQ ID NO.9
ADRB1-F2：5’-VIC-ATCCCTTGTCATCGTGGCCTTACAGG-3’ SEQ ID NO.10
(特异性识别野生模板)
ADRB1-R1：5’-TGCAGCCGGCCCAGGGCTCCAG-3’ SEQ ID NO.11
ADRB1-R2:5’-FAM-AAGATACATTGATGACAGAGCATTCG-3’ SEQ ID NO.12
(特异性识别突变模板)
AGTR1-F1：5’-AATTTAAAAGATATTTTCTCCA-3’ SEQ ID NO.13
AGTR1-F2：5’-VIC-ATCCCTTGTCATCGTACCAAATGAGCA-3’ SEQ ID NO.14
(特异性识别野生模板)
AGTR1-R1：5’-AGGGAGATTGCATTTCTGTC-3’ SEQ ID NO.15
AGTR1-R2：5’-FAM-AAGATACATTGATGAAAGTACCTAAG-3’ SEQ ID NO.16
(特异性识别突变模板)
ACE-F1：5’-GGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3’ SEQ ID NO.17
ACE-F2：5’-VIC-ATCCCTTGTCATCGTAGGGGAGATCAG-3’ SEQ ID NO.18
(特异性识别野生模板)
ACE-R1：5’-AGTGAGCCGAGATCCCGC-3’ SEQ ID NO.19
ACE-R2：5’-FAM-AAGATACATTGATGAAGAGAATCTCA-3’ SEQ ID NO.20
(特异性识别突变模板)
内控F：5’-CGGGACCTGACTGACTACCT-3’ SEQ ID NO.21
内控R：5’-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3’ SEQ ID NO.22。
具体的组合如下：
其中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4用于扩增CYP2C9基因rs1057910位点野生型片段，扩增产物为113bp，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3用于扩增CYP2C9基因rs1057910位点突变型片段，扩增产物为166p，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3对两种基因型均进行扩增；
其中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.8用于扩增CYP2D6基因rs1065852位点野生型片段，扩增产物为118bp，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7用于扩增CYP2D6基因rs1065852位点突变型片段，扩增产物为103bp，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7对两种基因型均进行扩增；
其中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.12用于扩增ADRB1基因rs1801253位点野生型片段，扩增产物为89bp，SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11用于扩增ADRB1基因rs1801253位点突变型片段，扩增产物为96bp，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11对两种基因型均进行扩增；
其中SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.16用于扩增AGTR1基因rs5186位点野生型片段，扩增产物为133bp，SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15用于扩增AGTR1基因rs5186位点突变型片段，扩增产物为121bp，SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.15对两种基因型均进行扩增；
其中SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.20用于扩增ACE基因rs4646994位点野生型片段，扩增产物为367bp，SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19用于扩增ACE基因rs4646994位点突变型片段，扩增产物为108bp，SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.19对两种基因型均进行扩增；
SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22用于扩增内控DNA片段，扩增产物为136bp。
二、探针设计和合成：
CYP2C9、CYP2D6、ADRB1和AGTR1四个位点反应体系中均包含2条特异性带淬灭基团的锁核酸探针和1条内参特异性MGB探针，2条特异性带淬灭基团的锁核酸探针其中一条用于锁定检测野生型的带VIC荧光基团和标签序列的特异性ARMs引物，另一条用于锁定检测突变型的带FAM荧光基团和标签序列的特异性ARMs引物；内参特异性MGB探针用于识别内参位点。
具体序列如下：
内控-P：5’-ROX-ACCACCACGGCCGAGC-MGB-BHQ-3’ SEQ ID NO.23
野生型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-ACGATGACAAGGGAT-3’ SEQ ID NO.24
突变型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-TCATCAATGTATCTT-3’ SEQ ID NO.25。
具体的组合如下：
其中SEQ ID NO.23特异性识别内参位点；SEQ ID NO.24特异性识别并锁定检测野生型的带VIC荧光基团和标签序列的特异性ARMs引物；SEQ ID NO.25特异性识别检测突变型的带FAM荧光基团和标签序列的特异性ARMs引物。
三、PCR预混反应液配置
(1)CYP2C9PCR预混反应液：由用于扩增CYP2C9 rs1057910位点的特异性引物，引物序列如SEQ ID NO：1～4所示；内控引物，引物序列如SEQ ID NO：21～22所示；探针组，核苷酸序列如SEQ ID NO：23～25所示；PCR反应液组成，具体成分如下：
(2)CYP2D6PCR预混反应液：由用于扩增CYP2D6 rs1065852位点的特异性引物，引物序列如SEQ ID NO：5～8所示；内控引物，引物序列如SEQ ID NO：21～22所示；探针组，核苷酸序列如SEQ ID NO：23～25所示；PCR反应液组成，具体成分如下：
(3)ADRB1 PCR预混反应液：由用于扩增ADRB1 rs1801253位点的特异性引物，引物序列如SEQ ID NO：9～12所示；内控引物，引物序列如SEQ ID NO：21～22所示；探针组，核苷酸序列如SEQ ID NO：23～25所示；PCR反应液组成，具体成分如下：
(4)AGTR1 PCR预混反应液：由用于扩增AGTR1 rs5186位点的特异性引物，引物序列如SEQ ID NO：13～16所示；内控引物，引物序列如SEQ ID NO：21～22所示；探针组，核苷酸序列如SEQ ID NO：23～25所示；PCR反应液组成，具体成分如下表：
(5)ACE PCR预混反应液：由用于扩增ACE rs4646994位点的特异性引物，引物序列如SEQ ID NO：17～20所示；内控引物，引物序列如SEQ ID NO：21～22所示；探针组，核苷酸序列如SEQ ID NO：23～25所示；PCR反应液组成，具体成分如下表：
四、对照品配置
阳性对照：包含浓度各为10^4copy/μl的CYP2C9 rs1057910位点野生型质粒、CYP2C9 rs1057910位点突变型质粒、CYP2D6 rs1065852位点野生型质粒、CYP2D6rs1065852位点突变型质粒、ADRB1 rs1801253位点野生型质粒、ADRB1 rs1801253位点突变型质粒、AGTR1 rs5186位点野生型质粒、AGTR1 rs5186位点突变型质粒、ACE rs4646994位点野生型质粒、ACE rs4646994位点野生型质粒、内参质粒DNA和TE缓冲液；
阴性对照品：PUC-19质粒空载体和TE缓冲液。
五、组装试剂盒
试剂盒包含5管分别用于扩增CYSLTR1、GSDML基因位点多态性的PCR预混反应液，1管阳性对照品，1管阴性对照品。计算20人份规格的使用量，配制各管中的成分并组装。
实施例2
使用实施例1中制备的人类高血压风险基因多态性检测试剂盒对待测样本进行检测。本实施例收集100例健康人外周血样本，提取基因组DNA，使用人类高血压风险基因多态性检测试剂盒检测高血压风险基因多态性情况，具体操作过程如下：
(1)血液样本基因组DNA提取：使用商品化提取试剂盒进行基因组DNA提取，提取完成后使用TE缓冲液洗脱DNA，并测定DNA浓度；将基因组DNA稀释到20ng/μl；
(2)荧光定量检测：向反应管中加入30μl PCR预混反应液和20μl待测样本DNA；PCR反应程序为：95℃1分钟预变性；15个循环：95℃5秒，61℃32秒，不收集荧光；30个循环：95℃5秒，61℃32秒，收集荧光。
(3)PCR反应结束后按照表1，进行结果判读。
表1结果判读
注:“+”代表deta Rn终点荧光值>100,000，且扩增曲线呈S型；“-”代表deta Rn终点荧光值<100,000，或曲线非S型；
判读结果如下：
CYP2C9 rs1057910位点1075纯合野生样本88例，其中一个检测结果如图4所示；
CYP2C9 rs1057910位点1075杂合样本9例，其中一个检测结果如图5所示；
CYP2C9 rs1057910位点1075纯合突变样本3例，其中一个检测结果如图6所示；
CYP2D6 rs1065852位点纯合野生样本34例，其中一个检测结果如图7所示；
CYP2D6 rs1065852位点杂合样本28例，其中一个检测结果如图8所示；
CYP2D6 rs1065852位点纯合突变样本38例，其中一个检测结果如图9所示；
ADRB1 rs1801253位点纯合野生样本28例，其中一个检测结果如图10所示；
ADRB1 rs1801253位点杂合样本28例，其中一个检测结果如图11所示；
ADRB1 rs1801253位点纯合突变样本44例，其中一个检测结果如图12所示；
AGTR1 rs5186位点纯合野生样本87例，其中一个检测结果如图13所示；
AGTR1 rs5186位点杂合样本5例，其中一个检测结果如图14所示；
AGTR1 rs5186位点纯合突变样本8例，其中一个检测结果如图15所示；
ACE rs4646994位点纯合插入样本43例，其中一个检测结果如图16所示；
ACE rs4646994位点杂合样本31例，其中一个检测结果如图17所示；
ACE rs4646994位点纯合缺失样本26例，其中一个检测结果如图18所示。
上述100例样本荧光定量检测结果与测序结果100％一致。以上结果表明本试剂盒用于人类高血压风险基因多态性检测结果可靠，但本发明试剂盒检测灵敏度远高于测序法。采用本发明所述试剂盒检测人类高血压风险基因多态性的检测方法具有灵敏度高、特异性高、操作简便、结果可靠等优点，此外本发明简化了PCR的反应程序，将常规PCR反应中的退火和延伸步骤(退火30秒延伸1分钟)简化为一个步骤(仅需61度反应32秒)所以可在1小时内完成检测，并且本发明可直接根据荧光曲线进行结果判读，结果直观，判读简便。
实施例3
使用实施例1制备的试剂盒检测验证本试剂盒的最低检测线，具体包括如下操作步骤：
(1)使用实施例2中已知CYP2C9、CYP2D6、ADRB1、AGTR1和ACE相应位点基因型的样本，每个位点分别选取野生型基因组、突变型基因组和杂合型基因组样本各一例，将上述样本稀释至10ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL、0.25ng/μL、0.1ng/μL、0.05ng/μL、0.025ng/μL、0.001ng/μL；
(2)荧光定量检测：向反应管中加入30μl PCR预混反应液和20μl待测样本DNA；PCR反应程序为：95℃1分钟预变性；15个循环：95℃5秒，61℃32秒，不收集荧光；30个循环：95℃5秒，61℃32秒，收集荧光；每个样本的每个浓度梯度均重复检测20次；
(3)PCR反应结束后按照表1，进行结果判读；
(4)统计上述样本各个浓度梯度的检测成功率(分型与已知基因型一致即为检测成功，检测成功率＝检测结果一致结果数量/20×100％)，见表2～6。
表2 CYP2C9基因rs1057910位点检测成功率统计
表3 CYP2D6基因rs1065852位点检测成功率统计
表4 ADRB1基因rs1801253位点检测成功率统计
表5 AGTR1基因rs5186位点检测成功率统计
表6 ACE基因rs4646994位点检测成功率统计
上述结果显示，本发明可对浓度低至0.1ng/μL的DNA样本进行人类高血压风险基因多态性检测。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉康录生物技术股份有限公司
<120>一种人类高血压风险基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用
<160> 25
<210> 1
<211> 20bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞1
ttgtggactt ctcttccttc 20
<210> 2
<211> 25bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞2
atcccttgtc atcgtcagag ataca 25
<210> 3
<211> 17bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞3
gtcaccctgc cagaaat 17
<210> 4
<211>26bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞4
aagatacatt gatgaagaag atcaag 26
<210> 5
<211>18bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞5
gagagtgtcc tgcctggt 18
<210> 6
<211>27bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞6
atcccttgtc atcgtctgca cactacc 27
<210> 7
<211>16bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞7
cccaaacctg cttccc 16
<210> 8
<211>25bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞8
aagatacatt gatgaggcct agtga 25
<210> 9
<211>20bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞9
gacgctgggc atcatcatgg 20
<210> 10
<211>26bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞10
atcccttgtc atcgtggcct tacagg 26
<210> 11
<211>22bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞11
tgcagccggc ccagggctcc ag 22
<210> 12
<211>26bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞12
aagatacatt gatgacagag cattct 26
<210> 13
<211>22bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞13
aatttaaaag atattttctc ca 22
<210> 14
<211>27bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞14
atcccttgtc atcgtaccaa atgagca 27
<210> 15
<211>20bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞15
agggagattg catttctgtc 20
<210> 16
<211>26bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞16
aagatacatt gatgaaagta cctaag 26
<210> 17
<211>22bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞17
ggagaccact cccatccttt ct 22
<210> 18
<211>27bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞18
atcccttgtc atcgtagggg agatcag 27
<210> 19
<211>18bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞19
agtgagccga gatcccgc 18
<210> 20
<211>26bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞20
aagatacatt gatgaagaga atctca 26
<210> 21
<211>20bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞21
cgggacctga ctgactacct 20
<210> 22
<211>20bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞22
ggccatctct tgctcgaagt 20
<210> 23
<211>16bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞23
accaccacgg ccgagc 16
<210> 24
<211>15bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞24
acgatgacaa gggat 15
<210> 25
<211>15bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞25
tcatcaatgt atctt 15

Claims (8)

1.一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由分别用于扩增CYP2C9、CYP2D6、ADRB1、AGTR1、ACE位点的PCR预混反应液、阳性对照品及阴性对照品组成；
所述PCR预混反应液的具体组分如下：
（1）所述用于扩增CYP2C9位点的PCR预混反应液包括：用于扩增CYP2C9基因rs1057910位点的引物、引物序列如SEQ ID NO.1~ SEQ ID NO.4所示，其中SEQ ID NO.2所示引物的5’端携带VIC荧光基团，SEQ ID NO.4所示引物的5’端携带FAM荧光基团；用于内控的引物序列、序列如SEQ ID NO.21~SEQ ID NO.22所示；探针组序列如SEQ ID NO.23~SEQ ID NO.25所示，其中以及PCR反应液组成；
（2）所述用于扩增CYP2D6位点的PCR预混反应液：用于扩增CYP2D6基因rs1065852位点的引物、引物序列如SEQ ID NO.5~SEQ ID NO.8所示，其中SEQ ID NO.6所示引物的5’端携带VIC荧光基团，SEQ ID NO.8所示引物的5’端携带FAM荧光基团；用于内控的引物序列、序列如SEQ ID NO.21~SEQ ID NO.22所示，探针组序列如SEQ ID NO.23~SEQ ID NO.25所示，以及PCR反应液组成；
（3）所述用于扩增ADRB1位点的PCR预混反应液：用于扩增ADRB1基因rs1801253位点的引物、引物序列如SEQ ID NO.9~ SEQ ID NO.12所示，其中SEQ ID NO.10所示引物的5’端携带VIC荧光基团，SEQ ID NO.12所示引物的5’端携带FAM荧光基团；用于内控的引物序列、序列如SEQ ID NO.21~ SEQ ID NO.22所示，探针组序列如SEQ ID NO.23~ SEQ ID NO.25所示，以及PCR反应液组成；
（4）所述用于扩增AGTR1位点的PCR预混反应液：用于扩增AGTR1基因rs5186位点的引物、引物序列如SEQ ID NO.13~SEQ ID NO.16所示，其中SEQ ID NO.14所示引物的5’端携带VIC荧光基团，SEQ ID NO.16所示引物的5’端携带FAM荧光基团；用于内控的引物序列、序列如SEQ ID NO.21~SEQ ID NO.22所示，探针组序列如SEQ ID NO.23~ SEQ ID NO.25所示，以及PCR反应液组成；
（5）所述用于扩增ACE位点的PCR预混反应液：用于扩增ACE基因rs4646994位点的引物、引物序列如SEQ ID NO.17~SEQ ID NO.20所示，其中SEQ ID NO.18所示引物的5’端携带VIC荧光基团，SEQ ID NO.20所示引物的5’端携带FAM荧光基团；用于内控的引物序列、序列如SEQ ID NO.21~ SEQ ID NO.22所示，探针组序列如SEQ ID NO.23~SEQ ID NO.25所示，以及PCR反应液组成；
（1）~（5）中所述探针组的具体形式如下：
内控-P：5’-ROX-ACCACCACGGCCGAGC-MGB-BHQ-3’
野生型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-ACGATGACAAGGGAT-3’
突变型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-TCATCAATGTATCTT-3’；
所述阳性对照包含：CYP2C9 rs1057910位点野生型质粒、CYP2C9 rs1057910位点突变型质粒、CYP2D6 rs1065852位点野生型质粒、CYP2D6 rs1065852位点突变型质粒、ADRB1rs1801253位点野生型质粒、ADRB1 rs1801253位点突变型质粒、AGTR1 rs5186位点野生型质粒、AGTR1 rs5186位点突变型质粒、ACE rs4646994位点野生型质粒、ACE rs4646994位点野生型质粒及内参基因质粒DNA；
所述阴性对照品由不包含内标基因和目的基因位点的重组质粒和TE缓冲液组成。
2.根据权利要求1所述检测试剂盒，其特征在于，所述PCR预混反应液中，探针组内各引物的浓度均为50~100nM，用于扩增位点的各引物和用于内控的各引物浓度均为100~400nM。
3.根据权利要求1所述检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括Premix qPCRmix和TE缓冲液。
4.权利要求1~3任一项所述检测试剂盒在制备用于检测人类高血压风险基因多态性产品中的应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，具体检测方法包括如下步骤：
（1）采用基因组DNA提取试剂盒提取待测人外周血的基因组DNA作为待检测样本；
（2）荧光定量检测：向反应管中加入PCR预混反应液和待测样本DNA；同时设置阳性对照组和阴性对照组，然后将反应管置于荧光PCR仪进行PCR扩增反应，并采集FAM、VIC和ROX荧光信号；
（3）PCR扩增反应结束后，根据所采集的荧光信号起线情况进行结果判定。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（1）中将所述待检测样本
稀释到浓度为0.1~100ng/μL，再进行PCR扩增反应。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（2）所述PCR扩增反应的
条件为：95℃ 1分钟预变性；15个循环：95℃ 5秒，61℃ 32秒，不收集荧光；30个循环：95℃ 5秒，61℃ 32秒，收集荧光。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（3）所述结果判定的准则为：
①当阳性对照组均有FAM、VIC、ROX荧光信号起线，阴性对照组均无FAM、VIC、ROX荧光起线，待检测样本有ROX荧光信号起线时，判定实验成功，可以进行后续分型判定；② 根据检测样本的FAM、VIC荧光信号判断CYP2C9的分型：VIC荧光信号起线CYP2C9基因rs1057910位点分型为纯合野生型；FAM荧光信号起线，CYP2C9基因rs1057910位点分型为纯合突变型；VIC、FAM荧光信号均起线，CYP2C9基因rs1057910位点分型为杂合突变型；③ 根据检测样本的FAM、VIC荧光信号判断CYP2D6的分型：VIC荧光信号起线CYP2D6基因 rs1065852位点分型为纯合野生型；FAM荧光信号起线，CYP2D6基因 rs1065852位点分型为纯合突变型；VIC、FAM荧光信号均起线，CYP2D6基因 rs1065852位点分型为杂合突变型；④ 根据检测样本的FAM、VIC荧光信号判断ADRB1的分型：VIC荧光信号起线ADRB1基因rs1801253位点分型为纯合野生型；FAM荧光信号起线，ADRB1基因rs1801253位点分型为纯合突变型；VIC、FAM荧光信号均起线，ADRB1基因rs1801253位点分型为杂合突变型；⑤ 根据检测样本的FAM、VIC荧光信号判断AGTR1的分型：VIC荧光信号起线AGTR1基因rs5186位点分型为纯合野生型；FAM荧光信号起线，AGTR1基因rs5186位点分型为纯合突变型；VIC、FAM荧光信号均起线，AGTR1基因rs5186位点分型为杂合突变型；⑥根据检测样本的FAM、VIC荧光信号判断ACE的分型：VIC荧光信号起线ACE基因rs4646994位点分型为纯合野生型；FAM荧光信号起线，ACE基因rs4646994位点分型为纯合突变型；VIC、FAM荧光信号均起线，ACE基因rs4646994位点分型为杂合突变型。
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