CN109055367B

CN109055367B - 一种人类aldh2基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109055367B
Application number: CN201811034949.8A
Authority: CN
Inventors: 王宁; 付金玲; 李倩; 李雪梅; 叶伦; 程弘夏; 陈刚
Original assignee: Wuhan Connecticut Biotechnology Ltd By Share Ltd
Current assignee: Wuhan Connecticut Biotechnology Ltd By Share Ltd
Priority date: 2018-09-06
Filing date: 2018-09-06
Publication date: 2019-07-09
Anticipated expiration: 2038-09-06
Also published as: CN109055367A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人类ALDH2基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。所述试剂盒由用于扩增ALDH2基因G1510A位点的PCR预混反应液、阳性对照品及阴性对照品组成，所述PCR预混反应液包含用于扩增各位点的特异性引物序列组、探针组和PCR反应液，所述特异性引物组由普通的外引物和带荧光标签的特异性的ARMs引物组成。本发明所述试剂盒用于检测人类ALDH2基因多态性具有灵敏度高、特异性高、操作简便、结果可靠等优点，且能在1小时内完成检测，并且结果判读简单客观。

Description

一种人类ALDH2基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人类ALDH2基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

人类乙醛脱氢酶2(aldehyde dehydrogenase,ALDH2)基因位于12号染色体，包含13个外显子，编码乙醛脱氢酶和硝酸酯酶两种异构酶。ALDH2是NAD(P)+依赖性酶，广泛参与由体内乙醇、氨基酸、生物胺、维生素、类胆固醇及脂质的代谢过程中产生的醛类物质的氧化反应，成为相应的羧酸，对减轻醛类物质对机体的毒性作用具有重要意义。目前发现存在His47Arg、Glu479Lys、Glu504Lys等多种突变体，其中主要突变体是Glu504Lys(rs671)，即位于12号外显子的单碱基突变G1510A。正常的等位基因记为ALDH2*1(*1510G)，突变的等位基因记为ALDH2*2(*1510A)。同时ALDH2表现出明显的遗传多态性，在不同的地域、民族、人种中其频率不同。其在欧美白种人中少见，而在中、日、韩等东亚黄种人中突变率高达30％～50％。图1是ALDH2基因多态性位点及基因型频率汇总。

ALDH2基因是硝酸甘油(GTN)有效代谢物NO形成的关键。硝酸甘油是治疗心绞痛的经典药物，但该药的临床有效性常因人而异，部分病人舌下含服硝酸甘油不能迅速有效地缓解心绞痛，使心肌严重缺血加重。研究发现，ALDH2*1基因型的患者硝酸甘油治疗心绞痛的疗效明显优于ALDH2*2患者，ALDH2*2突变型的患者硝酸脂酶活性会降低10倍以上，使硝酸甘油无法产生一氧化氮，难以发挥药效。因此，存在突变型ALDH2*2的患者硝酸甘油用药剂量、用药频率应相应增加，延长用药周期。

目前临床上主要采取以下四种方式检测ALDH2基因的多态性：

1.PCR-测序法

2.高分辨率溶解曲线法

3.芯片杂交法

4.Taqman-qPCR法

PCR-测序法灵敏度低，实验耗时长，不适合临床推广；芯片杂交法，检测灵敏度低并且特异性差，容易出现假阳性结果；高分辨率溶解曲线法对设备要求特殊，不适合临床推广，且检测灵敏度不高。Taqman-qPCR法，检测灵敏度高，但往往由于位点序列原因，导致检测特异性不高，并且其通过Genotyping方法进行分型，对样本数量和多态性分布有一定要求，不适合检测突变频率过低的位点。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种人类ALDH2基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。本试剂盒具有高灵敏度、高特异性、低成本高通量、操作简便、实验周期短等特点，可以快速精准的对人类基因组DNA中ALDH2基因多态性进行检测。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种人类ALDH2基因多态性检测引物组，所述引物组由普通的外引物和带荧光标签的特异性的ARMs引物组成，具体序列如下：

ALDH2-F1：5’-TGTTTGGAGCCCAGTCACCC-3’ SEQ ID NO.1

ALDH2-F2：5’-FAM-AAGATACATTGATGACATACACTA-3’ SEQ ID NO.2

(特异识别突变模板)

ALDH2-R1：5’-ACCAGCAGACCCTCAAGCCC-3’ SEQ ID NO.3

ALDH2-R2：5’-VIC-ATCCCTTGTCATCGTTTTCACTTC-3’ SEQ ID NO.4

(特异识别野生模板)

内控F：5’-CGGGACCTGACTGACTACCT-3’ SEQ ID NO.5

内控R：5’-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3’ SEQ ID NO.6。

一种人类ALDH2基因多态性检测探针组，所述探针组由特异性taqman-MGB探针和携带淬灭基团的锁核酸探针组成，具体序列如下：

内控-P：5’-ROX-ACCACCACGGCCGAGC-MGB-BHQ-3’ SEQ ID NO.7

野生型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-ACGATGACAAGGGAT-3’ SEQ ID NO.8

突变型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-TCATCAATGTATCTT-3’ SEQ ID NO.9。

一种人类ALDH2基因多态性检测试剂盒，由用于扩增ALDH2基因rs671位点的PCR预混反应液、阳性对照品及阴性对照品组成；所述PCR预混反应液由所述引物组、引物序列如SEQ ID NO：1～6所示，所述探针组、核苷酸序列如SEQ ID NO：7～9所示，以及PCR反应液组成；

所述阳性对照品包含：ALDH2基因rs671位点突变型质粒、ALDH2基因rs671位点野生型质粒以及内参基因质粒DNA；

所述阴性对照品包括不包含内标基因和目的基因位点的重组质粒。

上述方案中，所述PCR预混反应液中，探针组内taqman-MGB探针的浓度为50～100nM，携带淬灭基团的锁核酸探针的浓度均为100～400nM；用于扩增ALDH2基因rs671位点的不带荧光基团的引物浓度均为100～400nM，带荧光基团的引物浓度均为50～100nM；用于内控的引物的浓度均为100～400nM。

上述方案中，所述PCR反应液包括Premix qPCRmix和TE缓冲液。

上述方案中，所述阴性对照品由PUC-19质粒空载体和TE缓冲液组成。

上述人类ALDH2基因多态性检测试剂盒在制备用于检测人类ALDH2基因多态性产品中的应用。

采用人类ALDH2基因多态性检测试剂盒检测人类ALDH2基因多态性的过程，具体包括如下步骤：

(1)采用基因组DNA提取试剂盒提取待测人外周血的基因组DNA作为待检测样本；

(2)荧光定量检测：向反应管中加入PCR预混反应液和待测样本DNA；同时设置阳性对照组和阴性对照组，然后将反应管置于荧光PCR仪进行PCR扩增反应，并采集FAM、VIC和ROX荧光信号；

(3)PCR扩增反应结束后，根据所采集的荧光信号起线情况进行结果判定。

上述方案中，步骤(1)中将所述待检测样本DNA稀释到浓度为0.1～100ng/μL，再进行PCR扩增反应。

上述方案中，步骤(2)中所述PCR扩增反应的条件为：95℃1分钟预变性；15个循环：95℃5秒，61℃32秒，不收集荧光；30个循环：95℃5秒，61℃32秒，收集荧光。

上述方案中，步骤(3)所述结果判定的原则为(如下表2所示)：①当阳性对照组均有FAM、VIC、ROX荧光信号起线，阴性对照组均无FAM、VIC、ROX荧光起线，待检测样本有ROX荧光信号起线时，判定实验成功，可以进行后续分型判定；②根据检测样本的FAM、VIC荧光信号判断ALDH2的分型：VIC荧光信号起线ALDH2基因rs671位点分型为纯合野生型；FAM荧光信号起线，ALDH2基因rs671位点分型为纯合突变型；VIC、FAM荧光信号均起线，ALDH2基因rs671位点分型为杂合突变型。

本发明所述人类ALDH2基因多态性检测试剂盒的检测原理如图2和图3所示，携带FAM荧光的带有标签序列的ARMs引物可特异性识别并扩增突变基因型的模板，并且随着引物的消耗，将更多的FAM荧光释放出来，在循环结束时，采集各通道荧光，生成荧光曲线；携带VIC荧光的带有标签序列的ARMs引物可特异性识别并扩增野生基因型的模板，并且随着引物的消耗，将更多的VIC荧光释放出来，在循环结束时，采集各通道荧光，生成荧光曲线。内控探针采用MGB探针，特异性识别内控相应序列，通过扩增，越来越多的ROX荧光被释放出来。所以当检测的基因组模板是纯合野生型，最终显示只有内控(ROX)和野生(VIC)荧光曲线可以正常起线且曲线呈S型，突变(FAM)荧光曲线不起线，或起线很低且不呈S型。当检测的基因组模板是纯合突变型，最终显示只有内控(ROX)和突变(FAM)荧光曲线可以正常起线且曲线呈S型，野生(VIC)荧光曲线不起线，或起线很低且不呈S型。当检测的基因组模板是杂合子，最终显示有内控(ROX)、突变(FAM)和野生(VIC)荧光曲线均可以正常起线且曲线呈S型。

本发明的有益效果如下：本发明所述人类ALDH2基因多态性检测试剂盒可以简单快速的检测人类ALDH2基因多态性分型，采用ARMs引物结合特异性荧光标签进行PCR反应实现了基因的多态性通过一个多重PCR反应即可完成，PCR反应中含有内控，保证检测结果的准确性，防止假阴性和假阳性结果的出现；PCR反应体系中携带FAM或VIC荧光的带标签ARMs引物可以被相应带有淬灭基团的锁核酸锁定使荧光处于淬灭状态，PCR反应过程中，携带FAM或VIC荧光的带标签ARMs引物与待检测基因模板特异性结合后释放荧光生成荧光曲线进行结果判读；本发明利用携带荧光基团和标签序列的特异性ARMs引物结合携带淬灭基团的锁核酸序列、特异性的内控探针、和特异性的内控引物，可以大大提高基因分型的特异性和准确性；同时，两条外引物F1和R1也可以进行扩增，进一步富集基因组模板，可以大大提高分型效率，进而可以检测到更低浓度的基因组样本，本发明所述试剂盒最低可对0.1ng基因组DNA进行多态性检测；此外，本发明所述试剂盒采用预混合的方式进行包装，使用时仅需加入基因组DNA，同时简化了PCR的反应程序，可在1小时内完成阿司匹林抵抗基因多态性的检测，可直接根据荧光曲线进行结果判读，判读结果简便客观，便于分析。

附图说明

图1为临床上ALDH2基因位点多态性及其发生频率。

图2为本发明所述试剂盒的检测原理示意图。

图3为本发明所述试剂盒的检测原理示意图。

图4为ALDH2 rs671位点纯合野生型检测结果。

图5为ALDH2 rs671位点杂合型检测结果。

图6为ALDH2 rs671位点纯合突变型检测结果。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1制备本发明的ALDH2基因检测试剂盒

一、引物设计和合成：

ALDH2 1510位点反应体系中包含6条引物；其中两条正义链上游引物F1和F2，两条反义链下游引物R1和R2，F1和R1为普通引物，F2和R2为带荧光基团和标签序列的特异性ARMs引物，通过引物和PCR反应条件筛选，保证引物对F1R1对模板进行富集，而F2和R1，F1和R2可正常扩增出带荧光的特定基因型PCR产物；同时，基因位点中加入内参引物。

具体序列如下：

ALDH2-F1：5’-TGTTTGGAGCCCAGTCACCC-3’ SEQ ID NO.1

ALDH2-F2：5’-FAM-AAGATACATTGATGACATACACTA-3’ SEQ ID NO.2

(特异识别突变模板)

ALDH2-R1：5’-ACCAGCAGACCCTCAAGCCC-3’ SEQ ID NO.3

ALDH2-R2：5’-VIC-ATCCCTTGTCATCGTTTTCACTTC-3’ SEQ ID NO.4

(特异识别野生模板)

内控F：5’-CGGGACCTGACTGACTACCT-3’ SEQ ID NO.5

内控R：5’-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3’ SEQ ID NO.6。

具体的组合如下：

其中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4用于扩增ALDH2基因位点1510G DNA片段，扩增产物为87bp，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3用于扩增ALDH2基因位点1510A DNA片段，扩增产物为69p，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3对两种基因型均进行扩增；

SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6用于扩增内控DNA片段，扩增产物为186bp；

二、探针设计和合成：

ALDH2基因rs671位点反应体系中包含2条特异性带淬灭基团的锁核酸探针和1条内参特异性MGB探针，2条特异性带淬灭基团的锁核酸探针其中一条用于锁定检测野生型的带VIC荧光基团和标签序列的特异性ARMs引物，另一条用于锁定检测突变型的带FAM荧光基团和标签序列的特异性ARMs引物；内参特异性MGB探针用于识别内参位点。

具体序列如下：

内控-P：5’-ROX-ACCACCACGGCCGAGC-MGB-BHQ-3’ SEQ ID NO.7

野生型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-ACGATGACAAGGGAT-3’ SEQ ID NO.8

突变型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-TCATCAATGTATCTT-3’ SEQ ID NO.9。

具体的组合如下：

其中SEQ ID NO.7特异性识别内参位点；SEQ IDNO.8特异性识别并锁定检测野生型的带VIC荧光基团和标签序列的特异性ARMs引物；SEQ ID NO.9特异性识别检测突变型的带FAM荧光基团和标签序列的特异性ARMs引物；

三、PCR预混反应液配置

PCR预混反应液：由用于扩增ALDH2基因rs671位点的特异性引物，引物序列如SEQIDNO：1～4所示；内控引物，引物序列如SEQ ID NO：5～6所示；探针组，核苷酸序列如SEQIDNO：7～9所示；PCR反应液组成，具体成分如下表1：

表1 ALDH2基因rs671位点PCR反应液试剂组成

组分	配比
		Premix qPCR MIX	25μL
SEQ ID NO.1	100～400nM
		SEQ ID NO.2	50～100nM
SEQ ID NO.3	100～400nM
		SEQ ID NO.4	50～100nM
SEQ ID NO.13	100～400nM
		SEQ ID NO.14	100～400nM
SEQ ID NO.15	50～100nM
		SEQ ID NO.16	100～400nM
SEQ ID NO.17	100～400nM
		TE缓冲液	补足至30μL

四、对照品配置

阳性对照品：包含浓度各为10^4copy/μl的ALDH2基因rs671位点突变型质粒、ALDH2基因rs671位点野生型质粒以及内参基因质粒DNA和TE缓冲液。所述质粒序列为本领域人员所熟知，此处不再一一列举其序列。

阴性对照品：PUC-19质粒空载体和TE缓冲液。

五、组装试剂盒

试剂盒包含1管分别检测ALDH2 1510基因位点多态性的PCR预混反应液，1管阳性对照品，1管阴性对照品。计算20人份规格的使用量，配制各管中的成分并组装。

实施例2

使用实施例1中制备的人类ALDH2基因多态性检测试剂盒对待测样本进行检测。本实施例收集100例EDTA抗凝静脉全血样本，提取基因组DNA，使用人类ALDH2基因多态性检测试剂盒检测ALDH2 1510基因多态性情况，具体操作过程如下：

(1)血液样本基因组DNA提取：使用商品化提取试剂盒进行基因组DNA提取，提取完成后使用TE缓冲液洗脱DNA，并测定DNA浓度；将基因组DNA稀释到20ng/μl；

(2)荧光定量检测：向反应管中加入30μl PCR预混反应液和20μl待测样本DNA；PCR反应程序为：95℃ 1分钟预变性；15个循环：95℃ 5秒，61℃ 32秒，不收集荧光；30个循环：95℃ 5秒，61℃ 32秒，收集荧光。

(3)PCR反应结束后按照表2，进行结果判读。

表2结果判读

ALDH2 rs671位点G1510A	FAM(-A)	VIC(-G)	ROX(内控)
				GG(纯合野生型)	–	+	+
GA(杂合突变型)	+	+	+
				AA(纯合突变型)	+	–	+

注:“+”代表deta Rn终点荧光值>100,000，且扩增曲线呈S型；“-”代表deta Rn终点荧光值<100,000，或曲线非S型；

判读结果如下：

ALDH2 rs671位点1510纯合野生样本58例，其中一个检测结果如图4所示；

ALDH2 rs671位点1510杂合样本34例，其中一个检测结果如图5所示；

ALDH2 rs671位点1510纯合突变样本8例，其中一个检测结果如图6所示；

上述100例样本荧光定量检测结果与测序结果100％一致。以上结果表明，本试剂盒用于人类ALDH2基因多态性检测结果可靠，但本发明试剂盒检测灵敏度远高于测序法。采用本发明所述试剂盒检测人类ALDH2基因多态性的检测方法具有灵敏度高、特异性高、操作简便、结果可靠等优点，此外本发明简化了PCR的反应程序，将常规PCR反应中的退火和延伸步骤(退火30秒延伸1分钟)简化为一个步骤(仅需61度反应32秒)所以可在1小时内完成检测，并且本发明可直接根据荧光曲线进行结果判读，结果直观，判读简便。

实施例3

使用实施例1制备的试剂盒检测验证本试剂盒的最低检测线，具体包括如下操作步骤：

(1)使用实施例2中已知ALDH2相应位点基因型的样本，每个位点分别选取野生型基因组、突变型基因组和杂合型基因组样本各一例，将上述样本稀释至10ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL、0.25ng/μL、0.1ng/μL、0.05ng/μL、0.025ng/μL、0.001ng/μL；

(2)荧光定量检测：向反应管中加入30μl PCR预混反应液和20μl待测样本DNA；PCR反应程序为：95℃ 1分钟预变性；15个循环：95℃ 5秒，61℃ 32秒，不收集荧光；30个循环：95℃ 5秒，61℃ 32秒，收集荧光；每个样本的每个浓度梯度均重复检测20次；

(3)PCR反应结束后按照表2，进行结果判读；

(4)统计上述样本各个浓度梯度的检测成功率(分型与已知基因型一致即为检测成功，检测成功率＝检测结果一致结果数量/20×100％)，见表3。

表3 ALDH2 rs671位点位点检测成功率统计

上述结果显示，本发明可对浓度低至0.1ng/μL的DNA样本进行人类ALDH2基因多态性检测。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉康录生物技术股份有限公司

<120>一种人类ALDH2基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用

<160> 9

<210> 1

<211> 20bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞1

tgtttggagc ccagtcaccc 20

<210> 2

<211> 24bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞2

aagatacatt gatgacatac acta 24

<210> 3

<211> 20bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞3

accagcagac cctcaagccc 20

<210> 4

<211>24bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞4

atcccttgtc atcgttttca cttc 24

<210> 5

<211>20bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞5

cgggacctga ctgactacct 20

<210> 6

<211>20bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞6

ggccatctct tgctcgaagt 20

<210> 7

<211>16bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞7

accaccacgg ccgagc 16

<210> 8

<211>15bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞8

acgatgacaa gggat 15

<210> 9

<211>15bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞9

tcatcaatgt atctt 15

Claims

1.一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由用于扩增ALDH2基因rs671位点的PCR预混反应液、阳性对照品及阴性对照品组成；所述PCR预混反应液包括：引物组、探针组、以及PCR反应液；所述阳性对照品包含：ALDH2基因rs671位点突变型质粒、ALDH2基因rs671位点野生型质粒以及内参基因质粒DNA；所述阴性对照品包括不包含内标基因和目的基因位点的重组质粒；

所述引物组由普通的外引物和带荧光标签的特异性的ARMs引物组成，具体序列如下：用于扩增ALDH2基因rs671位点的特异性引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示，其中SEQ ID NO.2所示引物的5’端携带FAM荧光基团，SEQ ID NO.4所示引物的5’端携带VIC荧光基团；用于内控的引物序列如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.6所示；

所述探针组由特异性taqman-MGB探针和携带淬灭基团的锁核酸探针组成，核苷酸序列如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.9所示，具体形式如下：

内控-P：5’-ROX-ACCACCACGGCCGAGC-MGB-BHQ-3’

野生型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-ACGATGACAAGGGAT-3’

突变型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-TCATCAATGTATCTT-3’。

2.根据权利要求1所述检测试剂盒，其特征在于，所述PCR预混反应液中，探针组内taqman-MGB探针的浓度为50～100nM，携带淬灭基团的锁核酸探针的浓度均为100～400nM；用于扩增ALDH2基因rs671位点的不带荧光基团的引物浓度均为100～400nM，带荧光基团的引物浓度均为50～100nM；用于内控的引物的浓度均为100～400nM。

3.根据权利要求1所述检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括Premix qPCRmix和TE缓冲液。

4.权利要求1～3任一项所述检测试剂盒在制备用于检测人类ALDH2基因rs671位点多态性产品中的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，具体的检测方法包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(1)中将所述待检测样本DNA稀释到浓度为0.1～100ng/μL，再进行PCR扩增反应。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增反应的条件为：95℃1分钟预变性；15个循环：95℃5秒，61℃32秒，不收集荧光；30个循环：95℃5秒，61℃32秒，收集荧光。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(3)所述结果判定的准则为：①当阳性对照组均有FAM、VIC、ROX荧光信号起线，阴性对照组均无FAM、VIC、ROX荧光起线，待检测样本有ROX荧光信号起线时，判定实验成功，可以进行后续分型判定；②根据检测样本的FAM、VIC荧光信号判断ALDH2的分型：VIC荧光信号起线ALDH2基因rs671位点分型为纯合野生型；FAM荧光信号起线，ALDH2基因rs671位点分型为纯合突变型；VIC、FAM荧光信号均起线，ALDH2基因rs671位点分型为杂合突变型。