CN116377058A - 一种圆锥角膜的检测panel及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种圆锥角膜的检测panel及其应用，属于生物技术领域。所述的检测panel包括以下基因：VSX1、COL4A3、COL4A4、HGF、DOCK9、COL4A1、TUBA3D、KRT12、COL4A2、MPDZ、POLG、PARP1、ERCC8、MAP3K19、TGFBI、TNF‑α、TIMP‑1、MMP‑9、WNT10A、FNDC3B、IPO5、CENPF、CNBD1和ZNF469。本发明的检测panel可以针对性的检测突变基因，可实现对圆锥角膜的精准检测，可以有效降低检测的成本。

Description

一种圆锥角膜的检测panel及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种圆锥角膜的检测panel及其应用。

背景技术

圆锥角膜(Keratoconus，KC)是一种以角膜扩张、中央区角膜基质变薄、呈圆锥形突起及高度不规则近视散光为特征的角膜病变，是一种原发性变性疾病，是临床重要的致盲性眼病之一，多发生于青年人群，亦可见于未成年人群。患者的主要表现为进行性的角膜形态改变和高度不规则散光、视力下降，以角膜扩张为特征，可导致角膜中央部向前凸出、变薄呈圆锥形并产生高度不规则散光的角膜病变。目前，早期圆锥角膜的治疗方法主要是角膜接触镜、角膜胶原交联等，晚期圆锥角膜最有效的治疗方法是角膜移植术，但一方面术后可能存在免疫排斥反应和角膜植片浑浊而需再次手术，另一方面我国角膜供体稀缺，无疑延长了患者等待时间和错失最佳的治疗时机。

圆锥角膜的病理机制尚不清楚，目前还没有与该疾病发病机制密切相关的治疗靶点。圆锥角膜的发病机制相当复杂，尚无公认、系统的学说解释该病的发生发展过程。相关研究多集中在遗传因素、角膜生物力学和氧化应激等方面。张冬艳等(圆锥角膜患者房水sFas、sFasL水平与角膜形态指标的相关性[J]，中国实验诊断学，2022年11月，第26卷第11期)公开了圆锥角膜患者房水sFas、sFasL水平与角膜形态指标的相关性，针对圆锥角膜患者房水sFas、sFasL水平与角膜形态指标的相关性进行了分析，随着房水sFas、sFasL水平的降低，患者的角膜形态改变逐加剧，圆锥角膜患者房水中存在sFas、sFasL表达下调，其水平与患者的角膜形态病变程度具有相关性，提示了房水sFas、sFasL水平降低导致的角膜组织中Fas、FasL系统功能亢进可能是促进圆锥角膜发生和发展的机制这一结论在不同年龄、不同性别患者的亚组分析中均得到了支持。

中国专利CN105256059B公开了一种TUBA3D基因在制备检测圆锥角膜(KC)诊断制品中的应用，提供了TUBA3D基因的新的用途，从而提供了一种有效的进行KC疾病基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明该发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水进行TUBA3D基因突变位点的的快速检测。

研究证明，高通量测序技术提供一种便捷有效的检测手段，对于基因诊断的改进具有重要意义，然而，目前尚未有针对圆锥角膜检测的专用panel。

发明内容

术语解释：

除非上下文另有明确指示，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括单数和复数指示物。通过端点表述的数值范围包括在对应范围内的所有数值和分数，以及所表述的端点。

基因检测panel是指在检测中将若干个基因对应的探针汇集到同一张捕获芯片上以捕获目标DNA并用于后续的基因测序。基因检测panel不只是检测一个位点或一个基因，而是同时检测多个位点、多个基因，这些位点和基因需要按照特定标准进行选择和组合。

本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种圆锥角膜的检测panel及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种圆锥角膜的检测panel，所述的检测panel包括以下基因：VSX1、COL4A3、COL4A4、HGF、DOCK9、COL4A1、TUBA3D、KRT12、COL4A2、MPDZ、POLG、PARP1、ERCC8、MAP3K19、TGFBI、TNF-α、TIMP-1、MMP-9、WNT10A、FNDC3B、IPO5、CENPF、CNBD1和ZNF469。

优选地，所述的panel的检测试剂包括：检测panel的特异性抗体、特异性结合分子、特异性扩增所述检测panel的引物或引物对、特异性探针或芯片。

又一方面，本发明提供了上述检测panel的试剂在制备圆锥角膜检测产品中的应用。

优选地，所述的产品为检测装置或检测试剂盒。

又一方面，本发明提供了一种检测圆锥角膜的试剂盒，所述的试剂盒包括检测panel的试剂。

优选地，所述的试剂盒包括检测探针，所述的检测探针针对检测panel中基因的外显子区域和部分内含子区域。

在一些实施方式中，所述的检测探针包括5'检测探针和3'检测探针。

在一些实施方式中，所述的检测探针包括一个或多个内部检测探针，其与5'检测探针和3'检测探针的检测靶向序列之间的靶标核酸的区域互补。

在一些实施方式中，5'检测探针和任意的内部检测探针在5'端被磷酸化。在一些实施方式中，5'检测探针和任意的内部检测探针在5'端未被磷酸化。

优选地，所述的检测探针为针对上述检测panel的基因突变或拷贝数变异的探针。

进一步优选地，所述的基因突变包括点突变、缺失、插入和重复。

优选地，所述的试剂盒中还包括核酸提取试剂；

进一步优选地，所述的核酸提取试剂包括但不限于组织DNA提取纯化试剂。

优选地，所述的试剂盒中还包括打断酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTP、质控品中的一种或多种。

优选地，所述的试剂盒的检测方法包括以下步骤：

(1)样本DNA的提取；

(2)样本DNA文库的构建，将DNA片段化成小片段，采用文库构建试剂盒进行文库制备。

(3)构建检测panel的检测探针，与DNA文库杂交捕获，并测序；

(4)对测序结果进行生物学信息分析，获得样本序列信息；

(5)将样本突变结果与所述检测panel进行比对，得到该样本基因突变结果，结合临床信息得到最终诊断。

具体地，步骤(2)中文库的制备主要包括以下步骤：DNA打断，末端补平，3’端加“A”，接头连接，纯化，文库扩增，纯化。文库制备完成后将其置于-20℃保存。

具体地，所述的步骤(4)中测序结果为fastq文件，使用基因突变的算法分析测序结果，得到基因突变的结果并注释。

进一步具体地，所述的步骤(4)包括fastq文件的质量控制、基因组比对、体细胞突变及胚细胞突变的分析，进行注释。

进一步优选地，所述的评估包括比较圆锥角膜患者与健康对照者组织的测序数据判断基因的突变。

又一方面，本发明提供了一种如上述的检测panel的检测试剂的用途，所述的用途如下述的一种或多种：

(1)用于评估圆锥角膜的患病风险；

(2)用于圆锥角膜患者的预后评估；

(3)用于筛查圆锥角膜患者。

优选地，所述的检测的样本选自组织样本、血液样本、房水样本、细胞样本中的一种或多种。

又一方面，本发明提供一种圆锥角膜的检测装置，所述的检测装置包括：

(1)测序模块，用于对待测样本的DNA进行提取，并进行高通量测序，获得测序结果；

(2)对比模块，用于对高通量测序的结果进行处理，并将数据与所述的panel进行比对，获得突变信息；

(3)分析模块，用于分析获得的突变信息，得出临床指导方案。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种圆锥角膜的检测panel，所述的检测panel针对性地检测圆锥角膜相关的突变基因，可实现对圆锥角膜的精准检测，可以有效降低检测的成本，普适性广。

附图说明

图1为90名受试者检测到的基因突变频率分布图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此，描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

本发明的实施例1中提供了一种圆锥角膜的检测panel，包括以下基因(表1)：

表1.

实施例2

用于检测圆锥角膜的二代测序方法，包括以下步骤：

1、样本DNA的提取

样本DNA的提取：使用DNA提取试剂盒对受试者全血样本的DNA进行提取。

样本DNA的质量检测：用Nanodrop检测DNA的纯度，Qubit检测DNA的浓度。

将无降解、无RNA污染、OD260/OD280比值在1.8-2.0之间，总量在1.5μg以上的DNA样品用来建库。

2、DNA文库制备

(1)基因组DNA片段化处理

本例采用Covaris M220超声波破碎仪对提取的DNA样本进行片段化。在130μL打断管内用TE稀释样本至6ng/μL，总体积55μL；打断时间50s。打断产物可保存在-20℃。

(2)末端修复及加“A”

a.取出打断好的待测样本，溶解后混匀离心，冰上放置。

b.打开PCR仪，设置末端修复和加A程序：20℃15min、72℃15min，最后4℃待机。

c.配制末端修复和3’端加A混合液包括：End Repair&A Tailing Buffer 16μL，End Repair&A Tailing Enzyme Mix 4μL，将末端修复和3’端加A混合液高速涡旋5-10s充分混匀，瞬时离心，放置冰上。

d.分别往样本管中加20μL末端修复和3’端加A混合液，涡旋5-10s充分混匀，瞬时离心。

e.检查PCR程序无误后，把样本管放置到PCR仪上，在开启PCR仪盖子情况下启动程序。

f.当PCR程序温度降到4℃后，取下样本，放置冰上备用。

(3)连接接头

a.上述程序结束后，设置连接接头程序：20℃30min，4℃待机。

b.配制接头连接混合液，接头连接混合液包括：Ligation Buffer 23μL和T4 DNALigase2μL，总体积为25μL。

c.将接头连接混合液高速涡旋15s充分混匀，短暂离心。

d.往末修加A后的75μL产物的PCR管中加入5μL的Adaptor Oligo Mix，涡旋5-10s。

e.向每个样品管中加入25μL接头连接混合液，涡旋5-10s，短暂离心。

f.检查PCR程序无误后，将样本管放入PCR仪中运行程序。

g.待PCR仪温度降至4℃，取出反应管，短暂离心。

(4)连接产物纯化

a.取连接产物短暂离心，往其中加入50μL XP磁珠(提前室温平衡30min)；

b.震荡混匀，室温孵育10min，使DNA与磁珠充分结合，短暂离心，上磁力架吸附磁珠5min后弃上清；

c.加入200μL 80％乙醇孵育30s后弃去，重复一次200μL 80％乙醇清洗步骤；

d.将离心管短暂离心后，上磁力架，用枪头吸尽离心管底部的乙醇，室温干燥3-5min至乙醇完全挥发；

e.取下离心管，加入22μL超纯水，震荡混匀，室温孵育5min；

f.短暂离心，上磁力架吸附3min后，将20μL上清液体移至新的离心管。

(5)预文库制备

a.设置PCR反应程序：98℃2min，然后进入6个循环：98℃30s、60℃30s、72℃1min，循环结束后，72℃5min，最后4℃待机。

b.取出纯化好的连接产物，轻弹混匀后瞬时离心，冰上放置备用。

c.给每个样本分配不同的Index Primer。

d.配制预文库扩增混合液包括：5×Herculase II ReactionBuffer 10μL、Forward Primer 2μL、25mM dNTP Mix 0.5μL、Herculase II Fusion DNA Polymerase 1μL和无核酶水14.5μL，总体积28μL。

e.往样本管中加入28μL预文库扩增混合液，再往样本管中加入2μL的IndexPrimer，涡旋混匀，瞬时离心收集液体。

f.检查PCR程序无误后，将样本管放入PCR仪中，盖好PCR仪热盖运行程序。

g.待反应结束，取出反应管，瞬时离心，放置于冰上备用。

(6)预文库纯化

a.将XP磁珠放置室温平衡30min，配制新鲜的80％乙醇，充分混匀。

b.充分振荡XP磁珠不少于1min使其完全混匀。

c.往预文库扩增产物中加入50μL XP磁珠，涡旋5-10s混匀，室温孵育10min。

d.将样本管瞬时离心，放置于磁力架上5min，直至溶液完全澄清，用移液器小心吸弃上清，确保枪头不会碰到磁珠。

e.加入200μL的80％乙醇，孵育30s后弃去，重复一次200μL 80％乙醇清洗步骤；

f.瞬时离心后，上磁力架吸附，用枪头吸尽离心管底部的乙醇，室温干燥3-5分钟至乙醇完全挥发。

g.从磁力架上取下样本管，加入22μL超纯水，涡旋至磁珠完全混匀，瞬时离心，室温孵育5min。

h.短暂离心，离心管置于磁力架上吸附3min，待液体澄清，将21μL上清液体转移至新的离心管中，保存于-20℃。

(7)文库质检

取1μL DNA文库检测其浓度。

3、文库杂交捕获

利用本发明检测panel和杂交捕获试剂进行文库杂交捕获，操作过程按照产品说明书进行。

(1)文库上样的总量为1μg，计算每个文库加入的体积。文库加入的体积(μL)

＝1000ng/捕获文库个数/文库浓度(ng/μL)。向文库混合体系中加入2.5μL封闭寡聚核苷酸，加入5μL COT Human DNA，震荡混匀，短暂离心。

(2)文库与探针杂交：向上述体系中加入反应体系(反应体系中包括杂交缓冲液7.5μL，杂交增强剂3μL，总体积10.5μL)，涡旋混匀，短暂离心，置于95℃加热模块变性10min。取出4.5μL探针加入体系中，涡旋混匀，短暂离心，置于PCR仪中，47℃杂交。

(3)文库捕获

a.按照说明书配制洗脱工作液；

b.捕获磁珠准备：每个捕获分装100μL捕获磁珠，将100μL捕获磁珠置于磁力架上至液体澄清，弃去上清。加入200μL 1×磁珠洗涤液，震荡混匀，上磁力架至液体澄清后弃上清。再加入100μL 1×磁珠洗涤液，震荡混匀，置于磁力架上至液体澄清，弃去上清备用。

c.将捕获过夜的杂交液体转入清洗好的磁珠中，置于PCR仪中47℃孵育45min，每隔15min震荡一次。

d.孵育完成后，每管加入100μL 47℃预热的1×洗脱工作液1，震荡混匀。置于磁力架上至液体澄清，弃去上清。

e.加入200μL 47℃预热的1×洗脱工作液4，移液器吹打十次混匀。47℃孵育5min，置于磁力架上至液体澄清，弃去上清。重复上述步骤1次。

f.加入200μL 47℃预热的1×洗脱工作液4，移液器吹打十次混匀。47℃孵育5min，置于磁力架上至液体澄清，弃去上清。

g.按照上述步骤加入1×洗脱工作液1，振荡2min，其余步骤同上。

h.按照上述步骤加入1×洗脱工作液2，震荡1min，其余步骤同上。

i.按照上述步骤加入1×洗脱工作液3，震荡30sec，其余步骤同上。

j.向离心管中加入22μL超纯水洗脱，震荡混匀，静置5min后上磁力架吸附3min，吸取20μL上清进行下一步扩增试验。

(4)捕获后PCR：

往捕获产物中加入反应体系(扩增预混液50μL，引物(5μM)10μL，无核酶水20μL)涡旋混匀，离心，放置于PCR仪中，反应程序如下：98℃，45s；(98℃，15s；60℃，30s；72℃，30s；13个循环)；72℃，1min，4℃保存。

扩增后纯化：

取180μL纯化磁珠于1.5mL离心管中，加入100μL扩增后的捕获DNA文库，振荡混匀，室温孵育15min。置于磁力架上至液体澄清，弃去上清。加入200μL 80％乙醇孵育30sec后弃去。重复一次200μL 80％乙醇清洗步骤。用10μL枪头弃去离心管底部的残留乙醇，室温干燥至乙醇完全挥发。从磁力架取下离心管，加入50μL超纯水，振荡混匀。室温孵育2min。短暂离心，置于磁力架上至液体澄清，将捕获样本转入新的离心管中。取1μL捕获样本用于Qubit浓度检测。

实施例3

按照实施例2的方法对90名受试者进行DNA提取、打断、末端修复、连接，第一次PCR，基因panel的特异性捕获，第二次PCR扩增获得待测序DNA样本，DNA样本满足上机要求后测序。对测序的结果进行评估，90名受试者检测的基因突变频率如图1和表2所示。检测结果与实际情况相符，证明了本实施例制备的用于检测圆锥角膜的基因panel能够检测受试者是否患有圆锥角膜或患圆锥角膜的风险。

表2.

基因检测结果详情如下表3所示：

表3.

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种圆锥角膜的检测panel，其特征在于，所述的检测panel包括以下基因：VSX1、COL4A3、COL4A4、HGF、DOCK9、COL4A1、TUBA3D、KRT12、COL4A2、MPDZ、POLG、PARP1、ERCC8、MAP3K19、TGFBI、TNF-α、TIMP-1、MMP-9、WNT10A、FNDC3B、IPO5、CENPF、CNBD1和ZNF469。

2.权利要求1所述的检测panel的试剂在制备圆锥角膜检测产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的产品为检测装置或检测试剂盒。

4.一种检测圆锥角膜的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括检测panel的试剂。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的panel的检测试剂包括：检测panel的特异性抗体、特异性结合分子、特异性扩增所述检测panel的引物或引物对、特异性探针或芯片。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括检测探针，所述的特异性探针为针对权利要求1所述的检测panel的基因突变或拷贝数变异的探针。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的检测方法包括以下步骤：

(1)样本DNA的提取；

(2)样本DNA文库的构建，将DNA片段化成小片段，采用文库构建试剂盒进行文库制备；

(3)构建检测panel的检测探针，与DNA文库杂交捕获，并测序；

(4)对测序结果进行生物学信息分析，获得样本序列信息；

(5)将样本突变结果与所述检测panel进行比对，得到该样本基因突变结果，结合临床信息得到最终诊断。

8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测的样本选自组织样本、血液样本、房水样本、细胞样本中的一种或多种。

9.权利要求1所述的检测panel的检测试剂的用途，其特征在于，所述的用途包括：

(1)用于评估圆锥角膜的患病风险；

(2)用于圆锥角膜患者的预后评估；

(3)用于筛查圆锥角膜患者。

10.一种圆锥角膜的检测装置，其特征在于，所述的检测装置包括：

(1)测序模块，用于对待测样本的DNA进行提取，并进行高通量测序，获得测序结果；

(2)对比模块，用于对高通量测序的结果进行处理，并将数据与所述的panel进行比对，获得突变信息；

(3)分析模块，用于分析获得的突变信息，得出临床指导方案。

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