CN105256059A - Tuba3d基因在制备圆锥角膜诊断制品中的应用 - Google Patents

Tuba3d基因在制备圆锥角膜诊断制品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供一种TUBA3D基因在制备检测圆锥角膜(KC)诊断制品中的应用，本发明提供了TUBA3D基因的新的用途，从而提供了一种有效的进行KC疾病基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水进行TUBA3D基因突变位点的快速检测。

Description

TUBA3D基因在制备圆锥角膜诊断制品中的应用
技术领域
本发明属于基因诊断制品技术领域，具体涉及一种微管蛋白α3d(TUBA3D)在制备检测圆锥角膜基因诊断制品中的应用。
发明背景
圆锥角膜(Keratoconus，KC)是一种角膜中央或旁中央进行性变薄膨出，最终导致高度散光或角膜瘢痕的疾病。该病主要发生在青少年，所以其对患者的危害和影响是终生的。KC发病率约1/2000，据此估计我国约有KC患者60万人。由于对KC的发病机制不甚明了，因此临床上没有好的防治KC发展的方法，发展到晚期只能接受角膜移植手术治疗，为社会和家庭带来了沉重的经济负担。
大量研究表明，遗传因素参与KC的进展。KC有明确的遗传倾向，遗传方式为常染色体显性遗传伴不完全外显性或隐性遗传。近20年来，学者们对KC的遗传病因进行了大量的研究，迄今为止，已有20余个候选基因及区域包括VSX1、SOD1、IL1、COL8A1、COL8A2、COL4A3、COL4A4、TGFBI、DOCK9、IPO5、STK24、mir184、ZNF469、1p36.23-36.21、2p24、3p14-q13、5q14.3-q21.1、8q13.1-q21.11、9p、9q34、13q32、14q24.3、15q22.33-q24.2、16q22.3-q23.1、20q12、21着丝粒等被定位和筛查，但其中仅有VSX1、TGFBI及mir184三个基因突变被证实。众多研究表明，这三个候选基因仅能解释很少一部分患者的发病，大部分病人的遗传病因仍是不明。
KC具有显著的遗传异质性，存在多种遗传模式和多个候选致病基因。到目前为止对KC的致病基因的了解仍然有限，迄今为止的已知基因仅能解释一小部分的患者的发病。这已经成为圆锥的发病机制的研究以及针对病因的诊断和治疗研究的瓶颈。这种现状促使进一步去发现和了解该病新的致病基因，为后续的基因诊断、产前诊断及基因治疗提供基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种TUBA3D基因在制备检测圆锥角膜诊断制品中的应用，从而弥补现有技术的不足。
申请人从一个圆锥角膜双胞胎家系中，经过候选基因测序，排除了已知的3个候选基因突变致病的可能；同时，进一步对该家系的4名核心成员进行了外显子组测序，找到了该家系的致病基因微管蛋白α3d(TUBA3D)存在遗传上的致病突变，从而促成了本发明。
本发明首先提供TUBA3D基因新的用途，是在制备用于检测圆锥角膜诊断制品中的应用；
本发明还提供一种用于检测圆锥角膜的引物对，所述的引物对的上下游引物序列为SEQIDNO:1-10中，其引物信息如下：
TUBA3D-1F:GAGCGTCCCCAGTACACA(SEQIDNO:1)、
TUBA3D-1R:TGTTTCGAGTAGCACAAAGAC(SEQIDNO:2)、
TUBA3D-2F:TTTCCTTACCCAACCCGACT(SEQIDNO:3)、
TUBA3D-2R:AGGCACGCACGAGGGA(SEQIDNO:4)、
TUBA3D-3F:TCCCTCGTGCGTGCC(SEQIDNO:5)、
TUBA3D-3R:TCACATTCCAAGAACTACCCCT(SEQIDNO:6)、
TUBA3D-4F:GCATCTTGAGTCCTACTGAG(SEQIDNO:7)、
TUBA3D-4R:GTGATGACTCAGACAGAGAG(SEQIDNO:8)、
TUBA3D-5F:CTCAGGTCATGTTATGCCCG(SEQIDNO:9)、
TUBA3D-5R:GAATGCTGTGCAGAACTCGGTTA(SEQIDNO:10)
本发明还提供一种用于检测圆锥角膜的试剂盒，包含有上述的引物对中的任一种或几种。
本发明还提供一种与KC疾病相关的SNP位点，为TUBA3D基因编码区域由起始密码子起第31位，其碱基为C或T；用于检测上述SNP位点的引物对，其引物序列为TUBA3D-2F:TTTCCTTACCCAACCCGACT(SEQIDNO:4)和TUBA3D-2R:AGGCACGCACGAGGGA(SEQIDNO:4)。
本发明还提供另一种与KC疾病相关的SNP位点，为TUBA3D基因编码区域由起始密码子起第201位后插入突变，其碱基为-或TT；用于检测上述SNP位点的引物对，其引物序列为TUBA3D-5F:CTCAGGTCATGTTATGCCC(SEQIDNO:9)和TUBA3D-5R:GAATGCTGTGCAGAACTCGGTTA(SEQIDNO:10)。
本发明还提供另一种与KC疾病相关的SNP位点，该位点位于3’UTR区，为TUBA3D基因编码区域由起始密码子起第1355位(终止密码子下游第2位)，其碱基为G或A；用于检测上述SNP位点的引物对，其引物序列为TUBA3D-5F:CTCAGGTCATGTTATGCCC(SEQIDNO:9)和TUBA3D-5R:
GAATGCTGTGCAGAACTCGGTTA(SEQIDNO:10)。
本发明提供了TUBA3D基因的新的用途，从而提供了一种有效的进行圆锥角膜疾病基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水进行TUBA3D基因突变位点的的快速检测。
附图说明
图1：实施例1的KC双胞胎家系内患者及正常人TUBA3D测序图，其中A：患者；B：正常人。该家系中两名患者TUBA3D基因编码区域由起始密码子起第31位发生了杂合突变，其碱基由C为突变为T，其正向引物的测序结果显示该位点为杂合突变，由C为突变为T。
图2：实施例2的一名KC患者及正常人TUBA3D测序结果。A：患者；B：正常人。该患者TUBA3D基因编码区域由起始密码子起第201位碱基发生了杂合插入突变，由-突变为TT，其正向引物的测序结果显示该位点为杂合突变，由-突变为TT。
图3：实施例2的一名KC患者及其正常人TUBA3D测序结果。A：患者；B：正常人。该患者TUBA3D基因编码区域由起始密码子起第1355位(终止密码子下游第2位)，其碱基为G或A，其正向引物的测序结果显示该位点为杂合突变，由G突变为A。
具体实施方式
申请人在一个先天性的KC双胞胎家系中发现TUBA3D基因的突变位点，并在多名散发患者中证实该基因的突变是该病的致病基因，从而促成了本发明。
TUBA3D基因位于2q21.1，可转录成1646bp的mRNA(Genbank序列号为NM_080386.3)，直接翻译形成450个氨基酸组成的蛋白质。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：从KC双胞胎家系中筛选TUBA3D基因的突变位点
1、提取外周血基因组DNA：
在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，抽取双胞胎家系成员外周静脉血2-5ml，放入EDTA抗凝管内，-80℃冻存备用；冻存的EDTA抗凝血在室温融化后，取500μl放于离心管，加入等体积TE(pH8.0)，混匀，4℃，10000rpm离心10分钟，弃上清。
加入180μlTE、20μlSDS(10％)、8μl蛋白酶K(10mg/ml)混匀，置于37℃水浴过夜。从水浴中取出样品，瞬时离心沉淀样本。在反应管中加入等体积的Tris-饱和酚(约300μl)，充分混匀，室温下10000rpm离心10分钟，吸取上清液(约300μl)至一新离心管中。重复酚抽提一次，吸取上清液至一新离心管中。
加入等体积的Tris饱和酚:氯仿混合液(酚、氯仿各150μl)，混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。
加入等体积的Tris饱和酚:氯仿:异戊醇混合液(酚、氯仿、异戊醇各100μl)，混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。
加入1/10体积3mol/L、pH5.2醋酸钠(约30μl)，2倍体积预冷100％乙醇，轻轻混合，可见白色絮状沉淀。室温10000rpm离心10分钟，使DNA沉淀于管底，弃上清。
向DNA沉淀加入70％乙醇，漂洗一次，室温7000rpm离心5分钟，弃上清，置于室温中挥发剩余乙醇，最后加入50μlTE(pH8.0)，4℃过夜溶解DNA。
对提取的DNA行琼脂糖胶电泳，并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色，检测DNA纯度及浓度。
2、外显子组测序：
外显子组测序(ExomeSequencing)是一种新型的基因组分析技术，只需针对全基因外显子(exon)区域的DNA即可，取该家系中2名双胞胎患者及其父母(正常人)的基因组DNA，由北京诺禾致源生物信息科技有限公司应用Agilent的液相芯片捕获系统，对人的全外显子区域DNA进行高效富集，然后在HiSeq2000上进行高通量、高深度测序。将HiSeq2000测序得到的数据经过数据质控后，对比对到参考基因组上的有效数据进行测序深度、覆盖度的统计。在比对结果的基础上，利用最新版的SAMtools识别SNP、Indel(insertion-deletion，插入和缺失)位点，并采用国际惯用的过滤标准对SNP、Indel位点进行过滤。通过筛选已知数据库(dbSNP、千人基因组、Hapmap)，过滤掉常见的多态性位点，得到未知突变。将筛选到的位点结合家系成员的表型及功能预测结果(SIFT，PolyPhen2软件预测)，着重关注已报道相关区间内的非同义突变、剪切位点突变以及缺失和插入变异，逐步缩小候选基因的范围，分别以隐性遗传模式及新生突变模式(指患者新发生的变异，即患者有而其父母都未有的变异)，最终确定与该家系的表型完全共分离的基因及其突变。结果筛选出TUBA3D基因编码区域由起始密码子起第31位C到T的突变。该突变符合新生遗传模式，为新生突变，引起TUBA3D蛋白第11位氨基酸由谷氨酰胺突变为终止子，蛋白截短。应用点突变预测程序SIFT预测发现，该突变导致了TUBA3D蛋白功能“damaging”级的损坏，从而引起了患者KC的发生。而在200例正常当地人群及该家系中正常人的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查，未发现该突变。
3、Sanger测序法验证该家系内患者TUBA3D基因的突变
PCR扩增目的片段：反应条件与反应体系：
(1)PCR反应条件：95℃5min；94℃30sec，59℃30sec，72℃1min30sec，36cycles；72℃10min。引物对为TUBA3D-2F:TTTCCTTACCCAACCCGACT和TUBA3D-2R:AGGCACGCACGAGGGA。
(2)反应体系：(TaKaRaTaq)
10×PCRBuffer(Mg2+plus)2.5μl
dNTPMixture(各2.5mM)2μl
TUBA3D-2F引物(10pmol/μl)1μl
TUBA3D-R引物(10pmol/μl)1μl
TaKaRaTaq(5U/μl)0.125μl
基因组DNA模板(20ng/ul)1μl
ddH 2 O17.5μl
Total25μl
应用该反应体系分别进行每名家系成员的基因组DNA模板与该TUBA3D引物的扩增反应。
PCR产物测序：应用常规Sanger测序法对上述PCR产物进行测序，该家系中两名患者TUBA3D基因编码区域由起始密码子起第31位发生了杂合突变，其碱基由C为突变为T(图1)。多次测序结果表明该突变位点并不是因为扩增或测序错误引进的。在200例正常当地人群及该家系中正常人的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查，未发现该突变。
通过上述的分析，证明TUBA3D基因可以用来检测患者是否具有潜在患KC的危险。通过将检测者的TUBA3D基因的各外显子片段与正常的对应片段比较，确定待检测者的患病风险。
根据TUBA3D的基因组序列设计扩增其各外显子的引物对，其正反引物的序列信息如下：
TUBA3D-1F:GAGCGTCCCCAGTACACA
TUBA3D-1R:TGTTTCGAGTAGCACAAAGAC
TUBA3D-2F:TTTCCTTACCCAACCCGACT
TUBA3D-2R:AGGCACGCACGAGGGA
TUBA3D-3F:TCCCTCGTGCGTGCC
TUBA3D-3R:TCACATTCCAAGAACTACCCCT
TUBA3D-4F:GCATCTTGAGTCCTACTGAG
TUBA3D-4R:GTGATGACTCAGACAGAGAG
TUBA3D-5F:CTCAGGTCATGTTATGCCCG
TUBA3D-5R:GAATGCTGTGCAGAACTCGGTTA
分别应用上述的每一对引物进行TUBA3D基因的检测。
实施例2：从另2名先天性散发KC患者中筛选TUBA3D基因的突变位点
1、收集散发KC患者：在山东省眼科研究所暨青岛眼科医院共收集2例诊断明确的KC散发患者。
2、提取外周血基因组DNA：分别抽取2例散发KC患者的外周静脉血2-5ml，放入EDTA抗凝管内，-80℃冻存备用；冻存的EDTA抗凝血在室温融化后，取500μl放于离心管，应用实施例1中说述的常规酚氯仿法从外周血中提取基因组DNA。
3、PCR扩增目的片段：反应条件与反应体系：
(1)PCR反应条件：95℃5min；94℃30sec，59℃30sec，72℃1min30sec，36cycles；72℃10min。
(2)反应体系：(TaKaRaTaq)
10×PCRBuffer(Mg2+plus)2.5μl
dNTPMixture(各2.5mM)2μl
其中一种TUBA3D-F引物(10pmol/μl)1μl
对应的TUBA3D-R引物(10pmol/μl)1μl
TaKaRaTaq(5U/μl)0.125μl
基因组DNA模板(20ng/ul)1μl
ddH 2 O17.5μl
Total25μl
应用该反应体系分别进行每名患者的基因组DNA模板分别与TUBA3D基因的5对引物的扩增反应，结果表明，所提供的5对引物都能有效的用来进行扩增检测。
4、PCR产物测序：应用常规Sanger测序法对每名患者的基因组DNA模板分别与TUBA3D基因的5对引物的扩增产物进行测序，具体测序结果如下：
应用引物对TUBA3D-2F:TTTCCTTACCCAACCCGACT和TUBA3D-2R:AGGCACGCACGAGGGA，在1名散发患者中检测到了1个TUBA3D基因的杂合插入突变：TUBA3D基因编码区域由起始密码子起第201位碱基发生了杂合插入突变，由-突变为TT，其正向引物的测序结果显示该位点为杂合突变，由-突变为TT(图2)。该插入突变引起了TUBA3D蛋白从68位氨基酸开始读码框的改变，对蛋白的序列及功能造成了很大的影响，从而引起了患者KC的发生。并在200例正常当地人群及该家系中正常人的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查，未发现该突变。
应用引物对TUBA3D-5F:CTCAGGTCATGTTATGCCC和TUBA3D-5R:GAATGCTGTGCAGAACTCGGTTA，在1名散发患者中检测到了1个TUBA3D基因的杂合突变：TUBA3D基因编码区域由起始密码子起第1355位(终止密码子下游第2位)发生了杂合突变，由G突变为A，其正向引物测序结果显示该位点为杂合突变，由G突变为A(图3)。而在200例正常当地人群及该家系中正常人的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查，未发现该突变。
其它引物对的检测结果也证明TUBA3D基因能够用于检测KC患病风险。

Claims (9)

1.一种TUBA3D基因的应用，其特征在于，所述的应用是TUBA3D基因在制备用于检测圆锥角膜病诊断制品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诊断制品为PCR检测引物。
3.一种用于检测圆锥角膜病的引物对，其特征在于，所述的引物对的上下游引物的核苷酸序列为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:9、SEQIDNO:10。
4.一种用于检测圆锥角膜病的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要求3所述的引物对中的任一种或几种。
5.一种与圆锥角膜病相关的SNP位点，所述的SNP位点为TUBA3D基因编码区域由起始密码子起第31位，其碱基为C或T。
6.一种与圆锥角膜病相关的SNP位点，所述的SNP位点为TUBA3D基因编码区域由起始密码子起第201位后插入突变，其碱基为-或TT。
7.一种与圆锥角膜病相关的SNP位点，该位点位于3’UTR区，为TUBA3D基因编码区域由起始密码子起第1355位，其碱基为G或A。
8.一种检测圆锥角膜病的方法，其特征在于，所述的方法是检测权利要求5-7任一项所述的SNP位点。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法是用权利要求3所述的引物对进行检测的。
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