CN112430658A - 结内外周t细胞淋巴瘤相关基因的检测试剂盒及建库方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因突变检测领域，具体讲，涉及结内外周T细胞淋巴瘤相关基因检测试剂盒及建库方法。本发明的结内外周T细胞淋巴瘤相关基因的检测试剂盒包括针对76个目的基因捕获探针。本发明试剂盒采用液相捕获进行文库构建，具有文库构建、覆盖率高、比对率高、均一性好、操作简单等优点。
Description
技术领域
本发明涉及基因突变检测领域，具体讲，涉及结内外周T细胞淋巴瘤相关基因检测试剂盒及建库方法。
背景技术
淋巴瘤是起源于淋巴结和淋巴组织的血液系统恶性肿瘤，病理类型复杂，发病率高。传统的淋巴瘤主要分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)和非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)两大类，后者又可分为B细胞NHL和T细胞NHL等不同类别。外周T细胞淋巴瘤(PTCLs)起源于胸腺后成熟T细胞或NK/T细胞，具有高度异质性和侵袭性，其中最常见的原发结内T细胞淋巴瘤包括外周T细胞瘤非特指型(PTCL-NOS)、血管免疫母细胞型淋巴瘤(AITL)和间变性大细胞瘤(ALCL)，约占所有PTCLs病例的75％。亚洲地区PTCLs发病率占非霍奇金淋巴瘤的15％～22％，其发生比例高于欧美国家。结内PTCLs的诊断和分类具有挑战性，2010年Iqbal J等对PTCLs进行基因表达谱分析，证实各类亚型间分子异质性明显。通过基因表达谱可识别多个分子亚群，支持分子检测作为PTCLs诊断的辅助工具。其中PTCL-NOS是一类排除其它T细胞淋巴瘤后的诊断疾病，在PTCL-NOS中通过基因表达情况可以将其进一步区分两个主要的分子亚群，特征分别为GATA3和TBX21的高表达。国外研究报道结内PTCLs频发基因突变，包括表观遗传调控基因(如TET2、DNMT3A、KMT2D、IDH2)、T细胞受体信号通路的基因(如RHOA、TNFAIP3、APC、CHD8)、肿瘤抑制因子(如TP53、ATM)等。其中TET2、DNMT3A、IDH2、RHOA基因突变多出现在具有滤泡性T细胞表型(TFH)的PTCL中，如AITL，具有一定辅助诊断价值。结合病理形态学、免疫表型、基因检测等方式，PTCLs患者的诊断已得到很大提升。
对于PTCL患者预后评估主要基于临床指标、免疫组化及细胞遗传学异常，目前临床上最常用的评分标准是国际预测评分IPI(International prognostic index，IPI)，包括年龄、疾病分期、乳酸脱氢酶、ECOG评分、结外累及5个指标，和改良国际预后指数NCCN-IPI。但因外周T细胞存在较高异质性，IPI评分仍无法满足临床需要。2004年Gallamini的提出的T细胞淋巴瘤预后评分(PIT)，包括年龄、乳酸脱氢酶、PS评分和骨髓受侵4个与临床结局相关的危险因素，将危险分层分为三组，主要用于PTCL-NOS患者预后评估。但该分类也存在一定局限性，无法对亚组进行风险评分。若结合基因检测对PTCLs进行更深入的分析，可进一步优化预后评估，如通过基因表达谱检测，发现PTCL-NOS患者中GATA3高表达的患者预后较差。目前PTCLs的治疗以传统化疗方案CHOP(环磷酰胺，阿霉素，长春新碱及泼尼松)治疗为主，除了ALK+ALCL的预后较好，其他PTCLs亚型的疗效均较差。虽然总有效率可达60％～70％，但5年生存率仅为25％～35％，无进展生存率更低。总体来说，PTCLs缺乏高效、特异、规范的治疗手段。随着对PTCLs分子遗传学的认知不断扩充，其发病机制的研究不断深入，应用新型靶向药物为PTCLs的治疗提供了新的选择。部分研究已取得了较好的效果，包括新型药物的安全性、新药与一线化疗方案的联合应用等。根据分子特异性，指导PTCLs个体化治疗，有望改善PTCLs患者的预后。
目前国内PTCLs基因组学研究有限，且在较小样本、不同人群中的基因检测结果存在一定的差异性；基因检测本身也存在一些局限性，其成本相对较高。如何将基因检测更准确更经济地应用于临床，从而为PTCLs患者病理的诊断、预后的评估、治疗方案的选择提供依据，是对临床医生和研究者的挑战。目前淋巴瘤靶向测序，尤其是深度靶向测序，敏感性高，可同时对数十个甚至数百个基因和/或拷贝数变异进行检测。鉴于此，本发明提出一种基于靶向测序的PTCLs相关基因检测试剂盒及扩增子文库的构建方法。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提出一种结内外周T细胞淋巴瘤相关基因的检测试剂盒。
本发明的第二发明目的在于提出一种结内外周T细胞淋巴瘤相关基因的建库方法。
为了完成本发明的目的，采用的技术方案为：
本发明提出一种结内外周T细胞淋巴瘤相关基因的检测试剂盒，所述检测试剂盒中含有用于捕获目的基因的探针，所述目的基因包括：ALK、APC、APC2、ARID1A、ARID1B、ARID2、ASXL3、ATM、BCOR、BIRC3、BIRC6、CARD11、CCND3、CD58、CDKN2A、CHD8、CHEK2、CIC、CIITA、CREBBP、DNMT3A、EP300、FYN、HLA-A、HLA-B、IDH2、IKBKB、ITPKB、ITPR3、JAK1、JAK2、JAK3、JMY、KDM6B、KMT2A、KMT2C、KMT2D、LRP1B、MEF2A、MSH2、MSH3、MSH6、MTOR、NCOR2、NF1、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、PDCD1、PHLPP1、PIK3R1、PIK3R2、PLCG1、PLCG2、PMS1、PTEN、PTPRS、REV3L、RHOA、SALL3、SETBP1、SETD1B、SETD2、SMARCA2、SMARCA4、SOCS1、SPEN、STAT3、STAT5B、TAL1、TET1、TET2、VAV1、YEATS2、YTHDF2和ZEB1。
可选的，所述探针采用以下方法设计得到：
S1、根据数据库提取所述目的基因的外显子坐标，获得外显子区域的集合；
S2、截取一个所述外显子区域的1～2M bp作为第一个探针单元，截取所述外显子区域的(n-1)M～(n+1)M bp作为第n个探针单元，依次截取，M＝60bp，获得该外显子区域的探针；
S3、对所述探针的核苷酸序列进行评估，评估的参数包括：Tm值、GC含量、Hairpin自由能、序列复杂度和基因组内同源性；
S4、对于评分低于阈值的探针进行调整，所述调整为调整所述评分低于阈值的探针的序列截取时的M值为60±10bp，重复S2、S3步骤优化探针的序列；
S5、对所述外显子区域的集合按照S2～S4所述方法获取探针，获得所述探针的集合。
可选的，所述检测试剂盒包括建库试剂盒和杂交捕获试剂盒。
可选的，所述建库试剂盒包括建库试剂盒-1和建库试剂盒-2；所述建库试剂盒-1中含有末端修复加尾缓冲液、末端修复加尾酶、连接缓冲液、连接酶、PCR混合液、QU试剂；所述建库试剂盒-2中含有接头混合液、re-PCR P5(1-8)、Pre-PCR P7(1-12)。
本发明还涉及一种结内外周T细胞淋巴瘤相关基因的建库方法，至少包括以下步骤：
(1)基因组打断；
(2)补平修复加A；
(3)接头连接；
(4)Pre-PCR反应；
(5)样本及探针杂交；所述探针用于捕获以下目的基因：ALK、APC、APC2、ARID1A、ARID1B、ARID2、ASXL3、ATM、BCOR、BIRC3、BIRC6、CARD11、CCND3、CD58、CDKN2A、CHD8、CHEK2、CIC、CIITA、CREBBP、DNMT3A、EP300、FYN、HLA-A、HLA-B、IDH2、IKBKB、ITPKB、ITPR3、JAK1、JAK2、JAK3、JMY、KDM6B、KMT2A、KMT2C、KMT2D、LRP1B、MEF2A、MSH2、MSH3、MSH6、MTOR、NCOR2、NF1、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、PDCD1、PHLPP1、PIK3R1、PIK3R2、PLCG1、PLCG2、PMS1、PTEN、PTPRS、REV3L、RHOA、SALL3、SETBP1、SETD1B、SETD2、SMARCA2、SMARCA4、SOCS1、SPEN、STAT3、STAT5B、TAL1、TET1、TET2、VAV1、YEATS2、YTHDF2和ZEB1；
(6)链霉亲和素磁珠准备；
(7)捕获磁珠富集文库及清洗；
(8)Post-PCR反应。
可选的，所述探针采用以下方法设计得到：
S1、根据数据库提取所述目的基因的外显子坐标，获得外显子区域的集合；
S2、截取一个所述外显子区域的1～2M bp作为第一个探针单元，截取所述外显子区域的(n-1)M～(n+1)M bp作为第n个探针单元，依次截取，M＝60bp，获得该外显子区域的探针；
S3、对所述探针的核苷酸序列进行评估，评估的参数包括：Tm值、GC含量、Hairpin自由能、序列复杂度和基因组内同源性；
S4、对于评分低于阈值的探针进行调整，所述调整为调整所述评分低于阈值的探针的序列截取时的M值为60±10bp，重复S2、S3步骤优化探针的序列；
S5、对所述外显子区域的集合按照S2～S4所述方法获取探针，获得所述探针的集合。
本发明的技术效果至少为：
本发明通过对瑞金医院110例外周T细胞淋巴瘤中国患者进行了全外显子测序，发现了涉及p53 signaling pathway、PI3K-Akt-mTOR signaling pathway、Notch signalingpathway、JAK-STAT signaling/PD-1checkpoint pathway、Histone methylation、Histoneacetylation、DNA methylation、Chromatin remodeling、T cell receptor signalingpathway、Immune surveillance、tumor suppressor十个通路的76个基因突变及CNV改变。这是中国基于外周T细胞淋巴瘤群体进行的最大数量的全外显子测序结果，其中发现TET2、KMT2D、KMT2C、RHOA、NCOR2、LRP1B、DNMT3A、HLA-B基因突变在亚洲人群中突变概率较高，MGA、ASXL3、CIC、SPEN、JMY、MEF2A、APC2、BIRC6、MSH3、YEATS2、BCOR和STAT5B基因突变为亚洲人群的特异性突变。采用本发明的试剂盒对亚洲人群的结内外周T细胞淋巴瘤相关基因进行检测，可针对亚洲人群的结内外周T细胞淋巴瘤相关基因进行全面的分析，从而可正确的进行预后分级和指导靶向治疗。本发明的结内外周T细胞淋巴瘤相关基因的检测试剂盒包括针对76个目的基因捕获探针。本发明试剂盒采用两轮PCR反应进行文库构建，具有文库构建周期短、覆盖率高、比对率高、均一性好、操作简单等优点。
附图说明
图1为DNA文库峰形图(Agilent Bioanalyzer 2100)；
图2为杂交捕获文库峰形图(Agilent Bioanalyzer 2100)；
图3为实施例2中样本序号为1的片段化质检结果；
图4为实施例2中样本序号为2的片段化质检结果；
图5为实施例2中样本序号为3的片段化质检结果；
图6为实施例2中样本序号为1的预文库质检结果；
图7为实施例2中样本序号为2的预文库质检结果；
图8为实施例2中样本序号为3的预文库质检结果；
图9为实施例2中样本序号为1和2的终文库质检结果；
图10为实施例2中样本序号为3的终文库质检结果。
具体实施方式
下面通过实施例和对比例进一步说明本发明，这些实施例只是用于说明本发明，本发明不限于以下实施例。凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
本发明实施例涉及一种结内外周T细胞淋巴瘤相关基因的检测试剂盒，所述检测试剂盒中含有用于捕获目的基因的探针，目的基因包括：ALK、APC、APC2、ARID1A、ARID1B、ARID2、ASXL3、ATM、BCOR、BIRC3、BIRC6、CARD11、CCND3、CD58、CDKN2A、CHD8、CHEK2、CIC、CIITA、CREBBP、DNMT3A、EP300、FYN、HLA-A、HLA-B、IDH2、IKBKB、ITPKB、ITPR3、JAK1、JAK2、JAK3、JMY、KDM6B、KMT2A、KMT2C、KMT2D、LRP1B、MEF2A、MSH2、MSH3、MSH6、MTOR、NCOR2、NF1、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、PDCD1、PHLPP1、PIK3R1、PIK3R2、PLCG1、PLCG2、PMS1、PTEN、PTPRS、REV3L、RHOA、SALL3、SETBP1、SETD1B、SETD2、SMARCA2、SMARCA4、SOCS1、SPEN、STAT3、STAT5B、TAL1、TET1、TET2、VAV1、YEATS2、YTHDF2和ZEB1。
本发明实施例探针的设计方法为：
S1、根据数据库提取目的基因的外显子坐标，获得外显子区域；具体的，采用的数据库包括：RefSeq。外显子区域坐标具体图表1所示：
表1
S2、截取一个外显子区域的1～2M bp作为第一个探针单元，截取外显子区域的(n-1)M～(n+1)M bp作为第n个探针单元，依次截取，M＝60bp，获得该外显子区域的探针；
S3、对探针的核苷酸序列进行评估，评估的参数包括：Tm值、GC含量、Hairpin自由能、序列复杂度和基因组内同源性；
S4、对于评分低于阈值的探针进行调整，调整评分低于阈值的探针的序列截取时的M值为60±10bp，重复S2、S3步骤优化探针的序列；
S5、对外显子区域的集合按照S2～S4方法获取探针，获得探针的集合。
具体的，检测试剂盒包括建库试剂盒和杂交捕获试剂盒。建库试剂盒包括建库试剂盒-1和建库试剂盒-2；建库试剂盒-1中含有末端修复加尾缓冲液、末端修复加尾酶、连接缓冲液、连接酶、PCR混合液、QU试剂；建库试剂盒-2中含有接头混合液、re-PCR P5(1-8)、Pre-PCR P7(1-12)。Pre-PCR P5(1-8)、Pre-PCR P7(1-12)分别如表2和表3所示：
表2
表3
具体的，接头混合液可采用迪赢生物产品(货号为LP2004A)。
具体的，杂交捕获试剂盒包括杂交捕获试剂盒-1、杂交捕获试剂盒-2和杂交捕获试剂盒-3；杂交捕获试剂盒-1中含有杂交液1、杂交液2、洗液1、洗液2和洗液3；杂交捕获试剂盒-2中含有杂交液3和探针保护液；杂交捕获试剂盒-3中含有通用封闭液和后PCR引物混合液。上述可采用迪赢生物产品(货号为C1001A)。
本发明实施例涉及结内外周T细胞淋巴瘤相关基因的建库方法，至少包括以下步骤：
(1)基因组打断；
(2)补平修复加A；
(3)接头连接；
(4)Pre-PCR反应；
(5)样本及探针杂交；探针用于捕获以下目的基因：ALK、APC、APC2、ARID1A、ARID1B、ARID2、ASXL3、ATM、BCOR、BIRC3、BIRC6、CARD11、CCND3、CD58、CDKN2A、CHD8、CHEK2、CIC、CIITA、CREBBP、DNMT3A、EP300、FYN、HLA-A、HLA-B、IDH2、IKBKB、ITPKB、ITPR3、JAK1、JAK2、JAK3、JMY、KDM6B、KMT2A、KMT2C、KMT2D、LRP1B、MEF2A、MSH2、MSH3、MSH6、MTOR、NCOR2、NF1、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、PDCD1、PHLPP1、PIK3R1、PIK3R2、PLCG1、PLCG2、PMS1、PTEN、PTPRS、REV3L、RHOA、SALL3、SETBP1、SETD1B、SETD2、SMARCA2、SMARCA4、SOCS1、SPEN、STAT3、STAT5B、TAL1、TET1、TET2、VAV1、YEATS2、YTHDF2、ZEB1；
(6)链霉亲和素磁珠准备；
(7)捕获磁珠富集文库及清洗；
(8)Post-PCR反应。
实施例1
本发明实施例试剂盒的组成如表3所示，采用迪赢生物产品(货号为L1001A、LP2004A、C1001A、CP3004A、Y1016A)。
表4
捕获探针的设计方法为：
S1、根据数据库提取目的基因的外显子坐标，外显子区域坐标具体图表1所示；
S2、截取一个外显子区域的1～120bp作为第一个探针单元，截取外显子区域的60～180bp作为第2个探针单元，截取外显子区域的120～240bp作为第3个探针单元，截取外显子区域的180～300bp作为第4个探针单元，依次截取，获得该外显子区域的探针；
S3、对探针的核苷酸序列进行评估，评估的参数包括：Tm值、GC含量、Hairpin自由能、序列复杂度和基因组内同源性；
S4、对于评分低于阈值的探针进行调整，调整评分低于阈值的探针的序列截取时的长度为50～70bp，重复S2、S3步骤优化探针的序列；
S5、对表1所示的外显子区域按照S2～S4方法获取探针，获得探针的集合，人工合成用于杂交。
试剂盒的具体使用方法为：
1、基因组打断
1.1启动Covaris S220 system：确保新鲜的去离子水超过Covaris槽上level12；事先预冷并脱气半小时。
1.2转移50μL的DNA样本到Covaris micro Tube，贴壁慢慢打出液体，小心不要在tube底部产生气泡。
1.3在Covaris S220和M220的超声条件设置如表5所示：
表5
| 仪器型号 | Covaris S220、M220 |
| 温度(℃) | 20 |
| Peak Incident Power(W) | 75 |
| Duty Factor(％) | 20 |
| Cycles Per Burst | 200 |
| 打断时间(秒) | 205(100For FFPE) |
2、补平修复加A
2.1配置表6反应体系，并吹打混合均匀。
表6
| 组分 | 体积(μL) |
| 上步产物或DNA样本 | 39 |
| FFPE DNA修复混合液 | 3 |
| 末端修复加尾缓冲液 | 6.8 |
| 末端修复加尾酶 | 1.2 |
| 共计 | 50 |
2.2放置于PCR仪上执行表7程序：
表7
| 步骤 | 温度(℃) | 时间 |
| 1 | 30 | 30分钟 |
| 2 | 65 | 30分钟 |
| 3 | 4 | 孵育 |
3、接头连接
3.1配制表8所示的接头连接的反应体系：
表8
3.2吹打混合均匀，瞬时离心。
3.3放置于PCR仪上执行表9所示程序，同时取出磁珠室温孵育30分钟备用，用无核酸酶水配置足够80％的乙醇。
表9
| 步骤 | 温度(℃) | 时间 |
| 1 | 25 | 15分钟 |
| 2 | 4 | 孵育 |
3.4加入64μL的纯化磁珠，Vortex混合均匀。
3.5室温放置5分钟，注意此时不要放在磁力架上。
3.6放置于磁力架上静置澄清后弃上清液。
3.7加入200μL的80％乙醇，静置30秒后弃上清。
3.8再加入200μL的80％乙醇，静置30秒后弃上清。
3.9快速离心后用10μL的移液器弃去残余乙醇，室温放置1-3分钟，确保乙醇挥发干净，但不要干燥过度防止文库产量降低。
3.10从磁力架上取下管子，加入14μL的无核酸酶水重悬磁珠，Vortex混合均匀，室温放置2分钟。
3.11放置于磁力架上静置澄清后吸取上清液，转移至新的PCR管中。
4、Pre-PCR反应
4.1配置表10所示反应体系，并Vortex混合均匀。
表10
| 组分 | 体积(μL) |
| 上述洗脱产物 | 14 |
| PCR混合液 | 25 |
| QU试剂 | 3 |
| Pre-PCR P5(1-8) | 4 |
| Pre-PCR P7(1-12) | 4 |
| 共计 | 50 |
4.2根据不同的样本类型，样本起始量，按照表11所示的PCR条件执行PCR扩增：
表11
4.3在PCR管中加入40μL的纯化磁珠，Vortex混合均匀。
4.4室温放置5分钟，注意此时不要放在磁力架上。
4.5放置于磁力架上静置澄清后弃上清液。
4.6加入200μL的80％乙醇，静置30秒后弃上清。
4.7加入200μL的80％乙醇，静置30秒后弃上清。
4.8快速离心后用10μL的移液器弃去残余乙醇，室温放置1-3分钟，确保乙醇挥发干净，但不要干燥过度防止文库产量降低。
4.9从磁力架上取下管子，加入20μL的无核酸酶水重悬磁珠，Vortex混合均匀，室温放置2分钟。
4.10放置于磁力架上静置澄清后吸取上清液，转移至新的PCR管中。
4.11质控步骤：安捷伦2100或4200仪器检测片段范围和Qubit BR测定浓度。片段范围在225bp～275bp。DNA文库产量不低于500ng。得到的文库峰形图如图1所示。
5、样本及探针杂交
5.1根据Qubit浓度取总量500ng的建库文库进行后续杂交，cfDNA样本建议使用所有的文库已获得完整的样本信息。使用浓缩干燥仪进行浓缩，温度不超过45℃，刚好干燥完成后加入5μL无核酸酶水和7.7μL的universal blocker通用封闭液充分震荡混匀，混匀后静置。PS：若无浓缩干燥仪，也可采用加入1.8倍的纯化磁珠进行步骤4.4-4.8，但DNA损失会较大。
5.2放置于PCR仪上执行表12所示程序，带热盖模式运行。
表12
| 步骤 | 温度(℃) | 时间 |
| 1 | 95 | 5分钟 |
| 2 | 65 | 孵育 |
5.3在1.5mL EP管中制备表13所示杂交混合液，根据样本量配置单个或多个：
表13
5.4使用旋涡混匀仪剧烈震荡2秒后快速离心。
5.5转移全部18.5μL的杂交探针混合溶液到5.1步的文库混合液中(一直保持在PCR仪上操作)，轻轻吹打10次。
5.6密封好管盖，在65℃杂交16小时。
6、链霉亲和素磁珠准备
6.1实验前至少2小时将洗液3放置65℃水浴锅预热(每个样本需要600μL，建议可预热准备650μL，温度计测量水温确保水浴锅65℃)。
6.2在漩涡震荡器上重悬QuarAcces Hyper Enrichment beads(室温平衡30分钟以上)。
6.3每个反应吸取50μL QuarAcces Hyper Enrichment beads到1.5mL LoBind管中。
6.4加200μL的洗液1，在漩涡振荡器上震荡5秒钟，充分混匀磁珠。
6.5快速离心后，放置于磁力架上静置澄清后弃上清液。
6.6重复步骤6.4-6.5，总共3次清洗，最后用200μL的洗液1重悬磁珠，室温放置待用。
7、捕获磁珠富集文库及清洗
7.1杂交混合液65℃孵育约16小时后，确保剩余杂交体系体积不低于20μL。然后直接在PCR仪上打开PCR管，将杂交混合液吸出，加入200μL磁珠混悬液中，震荡混匀5秒。
7.2室温将管子放置在垂直旋转器上旋转孵育30分钟。
7.3从旋转器上取下8连管或96孔板，简短离心后，放置磁力架5分钟，待液体清澈后，吸走上清。
7.4加200μL的洗液2来重悬磁珠，在振荡器上混匀5秒钟，室温孵育15分钟，每间隔5分钟，在漩涡振荡器上振荡一次。
7.5简短离心后，放置磁力架上待液体清澈后，吸走上清液；放置65℃的PCR仪上，马上加200μL的在6.1步预热好的洗液3，在PCR仪上吹吸10次使磁珠完全混匀，65℃孵育10分钟。
7.6重复步骤7.5，共3次，注意第二次和第三次洗的过程在磁力架上的时间尽可能短，最后吸走上清后再简短离心，用20μL的移液器吸走残余液体。
7.7加20μL无核酸酶水重悬磁珠，上下吹打均匀后全部磁珠悬液加入新的PCR管。
8、Post-PCR反应
8.1配置表14所示的反应体系，上下吹打混合均匀，注意不要快速离心。
表14
| 组分 | 体积(μL) |
| 磁珠混悬液 | 20 |
| PCR混合液 | 25 |
| 后PCR引物混合液 | 5 |
| 共计 | 50 |
8.2放置于PCR仪上，按照表15所示的条件执行PCR扩增：
表15
8.3将PCR管放置于磁力架上，静置1分钟后吸取大约50μL的上清液转移至新的PCR管中(注意：上清液中包括捕获后文库，请勿遗弃)，然后加入40μL混匀的纯化磁珠，吹打混匀。
8.4室温放置5分钟，注意此时不要放在磁力架上。
8.5放置于磁力架上静置澄清后弃上清液。
8.6加入200μL的80％乙醇(当天配置)，静置1分钟后弃上清。
8.7再次加入200μL的80％乙醇(当天配置)，静置30秒后弃上清，快速离心后弃去残余乙醇，室温放置3分钟。
8.8从磁力架上取下管子，加入30μL的Low TE缓冲液洗脱，吹打均匀后室温静置2分钟。
8.9放置于磁力架上静置澄清后吸取上清液，转移至新的PCR管中。
9、文库质检和上机准备
9.1使用Agilent Bioanalyzer 4200或2100仪器对样本进行质检，4200所需试剂为High Sensitivity D1000或D5000 ScreenTape，2100所需试剂为High Sensitivity DNAAssay。
9.2杂交捕获文库的峰形如图2所示，峰值约为250～350bp，一般的浓度约5～50nmol/μL。
9.3文库适用于Illumina(HiSeq 3000/4000，NextSeq platform，X-Ten及NovaSeq等平台)2×150测序模式，Index为双端(8bp)Index。对于新鲜FFPE样本测序数据量基于Panel大小和期望测序深度；对于中度降解样本(DIN值在3～8)测序数据量额外提高2～4倍；对于严重降解样本(DIN值小于3)测序数据量需额外提高5～10倍。
10、结果判定：峰值约为250～350bp，一般的浓度约5～50nmol/μL。
实施例2
1、以4个样本采用本发明实施例1的试剂盒及方法进行检测，得到的实验结果和数据如下。样本信息如表16所示：
表16
| 样本序号 | 浓度(ng/μL) | 样本类型 | 样本描述 |
| 1 | 19.3 | DNA | 临床诊断为PTCL |
| 2 | 12.8 | DNA | 临床诊断为PTCL |
| 3 | 68.2 | DNA | 临床诊断为PTCL |
| 4 | 5.42 | DNA | 临床诊断为PTCL |
2、片段化后的实验结果如表17所示：
表17
备注：1)打断时间为：205s；2)目标片段化长度150bp。
片段化后质检结果如图3～5所示。其中，图3为样本序号为1的片段化质检结果，图4为样本序号为2的片段化质检结果，图5为样本序号为3的片段化质检结果。由图3～5可知：样本质量较好。
3、Pre-PCR反应的关键信息和实验结果如表18所示：
表18
采用QSEP机器对预文库进行质控，得到的实验结果如图6～8所示。其中，图6为样本序号为1的预文库质检结果，图7为样本序号为2的预文库质检结果，图8为样本序号为3的预文库质检结果。由图6～8可知：样本质量较好。
4、样本及探针杂交关键信息和实验结果如表19所示：
表19
终文库质检情况如图9、10所示。其中，图9为样本序号为1和2的终文库质检结果，图10为样本序号为3的终文库质检结果。由图9、10可知：样本质量较好。
5、测序：采用NovaSeq进行测序。
6、数据分析(QC)得到数据分析结果如表20：
表20
根据表20所示的实验结果可知，本实施例的试剂盒的重复率(Duplication rate)低，说明扩增的冗余性良好，正确比例率(Accurate mapping rate)高、比对到目标区域的Read占总read数的百分比(Reads capture rate)高、比对到目标区域的碱基占总碱基数的百分比(Bases capture rate)高，说明本发明试剂盒探针的捕获效率良好，试剂盒的整体性能良好。
本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。
序列表
<110> 上海交通大学医学院附属瑞金医院
苏州云泰生物医药科技有限公司
<120> 结内外周T细胞淋巴瘤相关基因的检测试剂盒及建库方法
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctggacca 8
<210> 2
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacggtca 8
<210> 3
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tccacttg 8
<210> 4
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgttggca 8
<210> 5
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttggtcaa 8
<210> 6
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctgtatga 8
<210> 7
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acactctt 8
<210> 8
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
taacacca 8
<210> 9
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tggtccag 8
<210> 10
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgaccgtt 8
<210> 11
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caagtgga 8
<210> 12
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgccaacg 8
<210> 13
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttgaccaa 8
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<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcatacag 8
<210> 15
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aagagtgt 8
<210> 16
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tggtgtta 8
<210> 17
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccagttca 8
<210> 18
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tggcttca 8
<210> 19
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cgactgga 8
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<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caagacta 8
<210> 21
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cctcctga 8
<210> 22
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tggtggta 8
<210> 23
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aacaacca 8
<210> 24
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aatccgtc 8
<210> 25
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
caaggagc 8
<210> 26
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ttcacgca 8
<210> 27
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
caccttac 8
<210> 28
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aagacgga 8
Claims (6)
1.一种结内外周T细胞淋巴瘤相关基因的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中含有用于捕获目的基因的探针的，
所述目的基因包括：ALK、APC、APC2、ARID1A、ARID1B、ARID2、ASXL3、ATM、BCOR、BIRC3、BIRC6、CARD11、CCND3、CD58、CDKN2A、CHD8、CHEK2、CIC、CIITA、CREBBP、DNMT3A、EP300、FYN、HLA-A、HLA-B、IDH2、IKBKB、ITPKB、ITPR3、JAK1、JAK2、JAK3、JMY、KDM6B、KMT2A、KMT2C、KMT2D、LRP1B、MEF2A、MSH2、MSH3、MSH6、MTOR、NCOR2、NF1、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、PDCD1、PHLPP1、PIK3R1、PIK3R2、PLCG1、PLCG2、PMS1、PTEN、PTPRS、REV3L、RHOA、SALL3、SETBP1、SETD1B、SETD2、SMARCA2、SMARCA4、SOCS1、SPEN、STAT3、STAT5B、TAL1、TET1、TET2、VAV1、YEATS2、YTHDF2和ZEB1。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述探针采用以下方法设计得到：
S1、根据数据库提取所述目的基因的外显子坐标，获得外显子区域的集合；
S2、截取一个所述外显子区域的1～2M bp作为第一个探针单元，截取所述外显子区域的(n-1)M～(n+1)M bp作为第n个探针单元，依次截取，M＝60bp，获得该外显子区域的探针；
S3、对所述探针的核苷酸序列进行评估，评估的参数包括：Tm值、GC含量、Hairpin自由能、序列复杂度和基因组内同源性；
S4、对于评分低于阈值的探针进行调整，所述调整为调整所述评分低于阈值的探针的序列截取时的M值为60±10bp，重复S2、S3步骤优化探针的序列；
S5、对所述外显子区域的集合按照S2～S4所述方法获取探针，获得所述探针的集合。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括建库试剂盒和杂交捕获试剂盒。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述建库试剂盒包括建库试剂盒-1和建库试剂盒-2；所述建库试剂盒-1中含有末端修复加尾缓冲液、末端修复加尾酶、连接缓冲液、连接酶、PCR混合液、QU试剂；所述建库试剂盒-2中含有接头混合液、re-PCR P5(1-8)、Pre-PCR P7(1-12)。
5.一种结内外周T细胞淋巴瘤相关基因的建库方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
(1)基因组打断；
(2)补平修复加A；
(3)接头连接；
(4)Pre-PCR反应；
(5)样本及探针杂交；所述探针用于捕获以下目的基因：ALK、APC、APC2、ARID1A、ARID1B、ARID2、ASXL3、ATM、BCOR、BIRC3、BIRC6、CARD11、CCND3、CD58、CDKN2A、CHD8、CHEK2、CIC、CIITA、CREBBP、DNMT3A、EP300、FYN、HLA-A、HLA-B、IDH2、IKBKB、ITPKB、ITPR3、JAK1、JAK2、JAK3、JMY、KDM6B、KMT2A、KMT2C、KMT2D、LRP1B、MEF2A、MSH2、MSH3、MSH6、MTOR、NCOR2、NF1、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、PDCD1、PHLPP1、PIK3R1、PIK3R2、PLCG1、PLCG2、PMS1、PTEN、PTPRS、REV3L、RHOA、SALL3、SETBP1、SETD1B、SETD2、SMARCA2、SMARCA4、SOCS1、SPEN、STAT3、STAT5B、TAL1、TET1、TET2、VAV1、YEATS2、YTHDF2和ZEB1；
(6)链霉亲和素磁珠准备；
(7)捕获磁珠富集文库及清洗；
(8)Post-PCR反应。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述探针采用以下方法设计得到：
S1、根据数据库提取所述目的基因的外显子坐标，获得外显子区域的集合；
S2、截取一个所述外显子区域的1～2M bp作为第一个探针单元，截取所述外显子区域的(n-1)M～(n+1)M bp作为第n个探针单元，依次截取，M＝60bp，获得该外显子区域的探针；
S3、对所述探针的核苷酸序列进行评估，评估的参数包括：Tm值、GC含量、Hairpin自由能、序列复杂度和基因组内同源性；
S4、对于评分低于阈值的探针进行调整，所述调整为调整所述评分低于阈值的探针的序列截取时的M值为60±10bp，重复S2、S3步骤优化探针的序列；
S5、对所述外显子区域的集合按照S2～S4所述方法获取探针，获得所述探针的集合。
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| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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