CN104498614B - 假肥大型肌营养不良症的检测探针及其无创检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种假肥大型肌营养不良症的检测探针及检测试剂盒,该检测探针为SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:546所示的核酸序列,该检测试剂盒中含有SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:546所示的核酸序列。本发明的检测探针或检测试剂盒能够一次性检测DMD基因各种突变信息,包括外显子缺失/重复、点突变在内的DMD基因的完整突变信息;具有全面、快速、准确、价格适中的优点,解决了DMD分子诊断的瓶颈。本发明试剂盒适于肌肉、血液和羊水等多种组织样本的检测。该试剂盒能够检出外显子区和内含子区致病突变;能够检出已知突变,也能发现未报道致病突变;此外还能用于检测经干细胞治疗后病人基因是否被纠正。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种基于杂交捕获技和半导体测序技术快速检测假肥大型肌营养不良症致病基因突变的试剂盒。
背景技术
假肥大型肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是一种以进行性四肢近端骨骼肌萎缩无力、小腿腓肠肌假性肥大为特征,同时累及心肌和呼吸肌,部分患者伴有智力障碍的致死性X连锁隐性遗传病,其发病率为活产男婴的1/3500。患者从3-5岁起病,12岁左右失去行走能力,20多岁死亡。Becker肌营养不良症(Becker muscular dystrophy,BMD)与DMD互为等位基因异质性疾病,其发病率有报道为1/30000,发病年龄比DMD晚,进展速度慢。目前国内外尚缺乏对本病特效的治疗方法,故通过对先证者的确诊、携带者的产前诊断和提供正确的遗传咨询以杜绝假肥大型肌营养不良症患儿的出生是降低本病发病率的关键措施。
DMD/BMD是由定位于Xp21.2-21.3的编码抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的DMD基因突变所致。大约有60-65%的DMD患儿是由于DMD基因外显子缺失所致,5-10%是由于DMD基因外显子重复所致,其余约30%是由于DMD基因微小突变导致。
目前DMD基因的突变检测方法主要有如下几种:Southern杂交法(Southernblotting)、多重PCR、多重连接依赖式探针扩增法(Multiplex ligation-dependent probeamplification,MLPA)、变性高效液相色谱法(Denaturing high performance liquidchromatography,DHPLC)、微阵列-比较基因组杂交法(array comparative genomichybridization,arrayCGH)、单链构象多态性法(single-strand conformationpolymorphism,SSCP)、变性梯度凝胶电泳法(denaturing gradient gelelectrophoresis,DGGE)、高分辨率溶解曲线分析法(high resolution melting curveanalysis,HRM)、Sanger测序法等。上述这些检测方法存在的突出问题是:只能检出部分突变类型,检出率低;约30%患儿需要进行二次检测,增加了检测周期和检测成本。故此,本领域迫切需要建立一种可以一次性检测DMD基因所有突变且快速、准确的方法,以满足临床上基因诊断、产前诊断、种植前诊断的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供假肥大型肌营养不良症的检测探针。
本发明的另一目的在于提供含有上述假肥大型肌营养不良症的检测探针的检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是:
一种检测假肥大型肌营养不良症的检测探针为SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:546所示的核酸序列。
一种检测假肥大型肌营养不良症的核酸探针混合物,该核酸探针混合物含有核苷酸序列为SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:546所示的核酸探针。
一种检测假肥大型肌营养不良症的试剂盒,该试剂盒中含有核苷酸序列为SEQ IDNO:1~SEQ ID NO:546所示的核酸探针。
一种检测待测样品中假肥大型肌营养不良症相关核酸分子的核苷酸序列的方法,包括以下步骤:
1)基因组DNA文库的构建:提取将待测样品中的基因组DNA,并将其打断成100~500bp大小的片段;将打断后的双链DNA片段的两端进行末端修复后,再连接上测序接头;即可获得DNA文库;
2)DNA文库的优化:将上述DNA文库中带有测序接头的DNA片段进行PCR扩增,获得优化的DNA文库;
3)第一次杂交捕获靶序列:将优化的DNA文库中的双链DNA片断变性后,利用权利要求1中所述的检测探针SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:546对其进行杂交捕获靶序列;
4)靶序列洗脱和第一次PCR扩增:将上一步捕获的靶序列进行洗脱,将洗脱下来的靶序列进行PCR扩增;
5)第二次杂交捕获靶序列:将上一步PCR扩增后的靶序列进行变性后,再用权利要求1中所述的检测探针SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:546进行杂交捕获;
6)靶序列洗脱和第二次PCR扩增:将上述第二次捕获的靶序列进行洗脱,并将洗脱下来的靶序列进行第二次PCR扩增;
7)将上述第二次PCR扩增的产物进行测序,即可获得与DMD相关的核酸分子序列;对该序列进行生物信息学分析,确定待测样品中假肥大型肌营养不良症相关核酸分子的突变情况;
上述方法用于非诊断目的。
进一步的,上述步骤1)中所述测序接头包括A接头和P1接头,其序列如下:
A接头的序列为:
5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT-3'(SEQ ID NO:547);
3'-CGCACAGAGGCTGAGTCNNNNNNNNNNCTA-5'(SEQ ID NO:548);
上述序列中的N代表A/G/C/T四种碱基的任意一种;
P1接头的序列为:
5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3'(SEQ ID NO:549);
3'-TTGGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA-5'(SEQ ID NO:550)。
进一步的,上述步骤3)和步骤5)中所述第一次和第二次杂交捕获靶序列的具体操作为:
1)利用试剂盒SureSelect TE Reagent Kit,PTN,16按照说明书配制杂交buffer,配方如下所示:
将配制好的杂交buffer 65℃预热5min;
2)利用试剂盒SureSelect TE Reagent Kit,PTN,16按照说明书配制杂交文库体系,配方如下所示:
将配制好的文库体系于95℃预杂交5min;
其中Ion P1Adapter Block和Ion Xpress Barcode X Block,其目的在于分别封闭文库构建中用到的P1接头和A接头,防止文库上的这两个接头序列和探针杂交;其序列如下:
Ion P1Adapter Block序列为:
5'-ATCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGG/3SpC3/–3'(SEQ ID NO:551);
Ion Xpress Barcode X Block序列为:
5'-ATCNNNNNNNNNNCTGAGTCGGAGACACGCAGGGATGAGATGG/3SpC3/–3'(SEQ ID NO:552)
上述序列中N代表A/G/C/T四种碱基的任意一种,以保证与相应的A接头序列匹配,“/3SpC3/”代表硫代磷酸键修饰;
3)配制SureSelect Oligo Library Mix,其中含有SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:546所示的546种探针和RNase block,并将SureSelect Oligo Library Mix 65℃预热2min;
4)将上述处理后的杂交文库体系、杂交buffer和SureSelect Oligo Library Mix混匀,65℃孵育16~24h进行杂交捕获。
进一步的,上述步骤4)和步骤6)中所述第一次PCR扩增和第二次PCR扩增的引物为:
Primer-F:5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG-3'(SEQ ID NO:553),
Primer-R:5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTC-3'(SEQ ID NO:554)。
进一步的,上述测序用Ion PGM Dx或Ion Proton测序仪进行的半导体测序。
本发明的有益效果是:
本发明对DMD基因的79个外显子、两侧相邻50bp内含子序列和已知位于内含子区突变附近序列设计并合成了RNA探针进行杂交捕获,然后利用Life Technologies公司生产的IonPGM Dx或Ion Proton半导体测序仪进行序列测定,通过生物信息学分析获得待测样本包括外显子缺失/重复、点突变在内的DMD基因完整突变信息。
本发明所开发的检测试剂盒能够一次性检测DMD基因各种突变信息,具有全面、快速、准确、价格适中的优点,解决了DMD分子诊断的瓶颈。
本发明试剂盒同时适用于肌肉、血液和羊水等多种组织样本的检测。该试剂盒能够检出外显子区和内含子区致病突变;能够检出已知突变,也能发现未报道致病突变;此外还能用于检测经干细胞治疗后病人基因是否被纠正。
如前所述,本发明采用杂交捕获技术对DMD基因相关致病突变序列进行富集,利用半导体测序技术进行序列测定,能够获得待测样本完整的突变信息,即涵盖了外显子与内含子突变、包括了点突变和结构重排、覆盖了已知突变和未知突变。
与现有常规检测方法相比,本发明检测具有全覆盖、快速、准确、费用适中的优点,解决了目前DMD分子诊断的瓶颈。
附图说明
图1为本发明检测流程图;
图2为提取基因组完整性鉴定电泳图;M1和M2均为DNA Maker;
图3为16个样本基因组打断后的电泳检测图;M为DNA Maker;
图4为相关样本混合文库Agilent 2100的检测结果,A为1-4号样本混合文库的检测结果;B为5-8号样本混合文库的检测结果;C为9-16号样本混合文库的检测结果;
图5半导体芯片微珠上样率监测。
具体实施方式
本发明提供一种结合靶序列液相杂交捕获技术、半导体测序技术的DMD致病基因突变检测方法。整个检测流程见图1。具体地,包括如下步骤:
(1)探针序列的设计及合成
本发明前期经过查阅大量DMD基因致病突变相关文献及数据库,设计了大量的检测DMD基因的核酸探针,通过高通量的实验筛选及相关实验验证,最终选取出546个探针联合作为检测DMD基因的核酸探针(探针序列见SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:546所示),不仅确保了在同一反应体系中各探针高特异、高灵敏地捕获各自对应的靶序列,几乎不存在假阴性或假阳性的检测结果,多达546个探针之间也不相互干扰影响捕获结果;而且对DMD基因缺失、重复、点突变的情况均能进行有效的检测。上述SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:546所示的探针由美国Agilent公司采用SureSelect技术合成。
(2)样品基因组DNA提取及质量评估
取待检测样品为外周血0.5~1mL(或肌肉组织20mg,或羊水细胞106~107个),采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen,德国,外周血)或者QIAamp DNA Mini Kit(肌肉组织或者羊水细胞)进行基因组DNA提取。对提取的基因组用Nanodrop2000(ThermoScientific,美国)进行纯度检测及浓度初步评估,并用Qubit(Life Technologies,美国)对基因组进行浓度二次测定,最后通过琼脂糖凝胶电泳检测基因组的完整性。
(3)DNA文库构建
1)将基因组DNA通过S220(Covaris,美国)超声仪打断成100~500bp的片段,打断操作按照厂家操作说明进行。
2)打断后片段通过电泳进行质检。
3)对质检合格的DNA片段进行末端修复,末端修复的反应条件为:25℃温浴20min;70℃温浴10min;4℃放置。
4)将末端修复后的DNA片段连接测序接头,连接反应条件为:25℃温浴15min;65℃温浴5min;4℃放置备用。连接产物用Agencourt AMPure XP Kit(Beckman CoulterMassachusetts,USA)进行纯化,即可获得样品DNA文库。
(4)DNA文库的优化
在杂交捕获前,将上述DNA文库进行PCR扩增以获得更有利杂交捕获的DNA文库。PCR反应条件为:1)98℃预变性30s;2)98℃变性10s;58℃退火30s;72℃延伸30s;步骤2)循环5次;3)72℃延伸5min;4)4℃放置备用。PCR产物用Agencourt AMPure XP Kit进行纯化,即可获得品质更佳的样品DNA文库,确保后续杂交时每一种文库分子中至少有一个文库分子能够与探针杂交。
(5)DMD基因靶序列第一次杂交捕获
在进行第一次杂交捕获前先进行DNA文库的定量,将上述优化后的DNA文库用Qubit进行定量。将多个样品DNA文库以DNA等量混合,使每份混合后所得的DNA文库中DNA的总量为750ng。混合后所得DNA文库用于后续的杂交捕获。杂交捕获步骤如下:
1)按照相应的试剂盒使用说明配制杂交buffer、配制杂交文库体系;
2)将上述杂交文库体系于95℃预杂交5min;杂交buffer于65℃预热5min;配制SureSelect Oligo Library Mix(含有本发明所设计的546种探针和RNase block)并将Mix65℃预热2min;
3)将上述混合后的DNA文库、杂交buffer、杂交文库体系、SureSelect OligoLibrary Mix混匀,65℃孵育16~24h进行杂交捕获。
(6)第一次洗脱捕获的靶序列
1)将上述杂交捕获后的反应液加入Dynabeads MyOne Streptavidin T1磁珠(Life Technologies,美国),在垂直混匀仪(BD Biosciences,美国)上室温混匀孵育30min,瞬时离心;
2)将离心管转移置于Dynal磁力架上,静置1-2min至管内液体澄清,去除上清液;
3)加入500μL SureSelect Wash Buffer#1重悬磁珠,并于漩涡混合仪上振荡5s混匀样品,室温孵育样品15min;
4)将离心管转移放置在Dynal磁力架上,静置1-2min至澄清,去除上清液;
5)加入500μL 65℃预热的SureSelect Wash Buffer#2重悬磁珠,并于漩涡混合仪上振荡5秒混匀样品;
6)将样品放水浴锅或干浴锅中65℃孵育10min;
7)颠倒离心管以混匀样品,瞬时离心3s;
8)将离心管转移放置在Dynal磁力架上,静置1~2min至澄清,去除上清液;
9)重复步骤5)到步骤8)两次,共洗涤三次;
10)用33.5μL Nuclease-free water重悬磁珠,所得上清液即为捕获的靶序列。
(7)靶序列的第一次PCR扩增
对上述所捕获的靶序列进行第一次PCR扩增,获得富集的靶序列。
(9)DMD基因靶序列第二次杂交捕获
将上述富集后的靶序列进行第二次杂交捕获,以进一步提高杂交捕获的准确性。第二次杂交捕获的操作步骤与第一次杂交捕获相同。
(10)第二次洗脱捕获的靶序列
将第二次杂交捕获到的靶序列进行洗脱,操作方法与第一次洗脱相同。
(11)靶序列的第二次PCR扩增
对上述所捕获的靶序列进行第二次PCR扩增,以获得富集的靶序列。
(12)测序前靶序列溶液的质控与定量
将第二次PCR扩增后的靶序列纯化后的产物先进行Qubit定量:
1)在1.5ml离心管中按照厂家说明书配制好工作液;
2)取两份190μL配制好的工作液加到两个0.5mL的离心管,在两个离心管中分别加入标准品1和标准品2;
3)取199μL配好的工作液分装到0.5mL离心管,标号,加入对应编号的第二次PCR扩增后的靶序列纯化后的产物1μL;
4)室温静置2min;测定浓度;
6)重复测3次,取平均值。
然后用Agilent 2100生物分析仪(Agilent,美国)检测文库分子分布。正常情况可见文库分子主峰在250-350bp之间。
因Qubit定量的精度有限,为确保最后各个文库产出的测序数据量有较好的均一性,需要采用SteponePlusTM实时荧光定量PCR系统(Applied Biosystems,美国)对文库进行qPCR定量。
(13)半导体测序
利用Ion OneTouchTM仪器将上一步qPCR定量后的靶序列制备成测序模板并进行富集,然后利用Ion PGM Dx或Ion Proton测序仪进行半导体测序。
(14)生物信息学分析
首先对半导体测序数据进行质量评估,对于质量合格(合格的标准是:1.测序读长的分布;2.测序碱基的质量值分布;这两个指标的具体判断标准是基于以往的大量实验数据的表现,来设置合格的阈值,然后看,靶区域的测序覆盖度,要求10倍覆盖度不低于95%。)的数据进行生物信息学分析。如果不合格,根据情况选择重测序或者重建库。生物信息学分析包括基于内部开发的分析方法进行外显子缺失、重复、点突变检测,对检测结果进行过滤,最后对高质量的突变进行功能注释,鉴定已报道或未报道致病突变。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明,但并不局限于此。
实施例1
本实施例对中山大学附属第一医院神经科实验室提供的10例经临床肌肉病理活检确诊为DMD的患者的样本进行DMD基因检测,检测过程中采用本发明的检测探针及方法。这10个样本已经通过常规方法进行分子诊断并明确了致病突变。
此外,本实施例还对6例女性携带者的样本利用本发明的检测探针及方法进行了DMD基因检测。这6例女性携带者均曾生育过DMD患儿并经常规分子诊断确诊为携带者。
本实施例用到的主要仪器设备见表1。用到的主要试剂见表2。
表1 本实施例用到的主要仪器设备
表2 本实施例用到的主要试剂
(1)探针序列的设计及合成
本发明前期经过查阅大量DMD基因致病突变相关文献及数据库,设计了大量的检测DMD基因的核酸探针,通过高通量的实验筛选及相关实验验证,最终选取出546个探针联合作为检测DMD基因的核酸探针(探针序列见SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:546所示),不仅确保了在同一反应体系中各探针高特异、高灵敏地捕获各自对应的靶序列,几乎不存在假阴性或假阳性的检测结果,多达546个探针之间也不相互干扰影响捕获结果;而且对DMD基因缺失、重复、点突变的情况均能进行有效的检测。上述SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:546所示的探针由美国Agilent公司采用SureSelect技术合成。
(2)样品基因组DNA提取及质量评估
将待检测样品外周血0.5~1mL采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen,德国)进行基因组DNA提取。对提取的基因组用Nanodrop进行纯度检测及浓度的初步评估,用Qubit(采用QubitTM dsDNA BR Assay Kits)对基因组进行浓度二次测定,检测结果见表3所示。最后通过琼脂糖凝胶电泳检测基因组的完整性。图2为其中一个提取质量合格样本的基因组电泳图。
表3 16个样本提取基因组纯度与浓度检测结果
(3)DNA文库构建
1)首先需要将基因组DNA通过S220(Covaris,美国)超声仪打断成100~500bp的片段。打断操作按照厂家操作说明进行,具体为:取1ug DNA样品加入适量的TE buffer到对应1.5mL离心管中,体积为50μL,混匀离心;将1.5mL离心管中的样品转入标注好的microTUBE,4℃暂存;依次打开恒温箱“电源”“制冷”“循环”按钮;待水浴冷却至4度;开启Covaris超声破碎仪;排气30mins;按表4设置打断参数;开始打断,即可。
表4 打断参数
2)打断后片段进行电泳质检。图3为16个样本基因组打断后的电泳质检图,从图中可以看出,打断后的基因片段主要集中在100~500bp区域内,尤其集中在150~300bp之前,符合要求。
3)将质检合格的DNA片段进行末端修复,末端修复的反应体系如表5所示。末端修复的反应条件为:25℃温浴20min;70℃温浴10min;4℃放置。末端修复使随机片段化的DNA片段形成平末端,并且5’端磷酸化,3’端去磷酸化,便于后续与接头的连接。
表5 末端修复反应体系
4)将末端修复后的DNA片段连接测序接头,连接反应的体系如表6所示。连接反应条件:25℃温浴15min;65℃温浴5min;4℃放置备用。连接产物用Agencourt AMPure XP Kit(Beckman Coulter,美国)进行纯化,纯化后即可获得样品DNA文库。
表6 连接反应体系
表6所示连接反应体系中接头的序列如下所示:
A接头(存在于Ion Xpress Barcode X中)的序列为:
5'—CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT–3'(SEQ ID NO:547);
3'–CGCACAGAGGCTGAGTCNNNNNNNNNNCTA-5'(SEQ ID NO:548);
上述序列中的N代表A/G/C/T四种碱基的任意一种,不同文库使用不同“NNNNNNNNNN”序列,用于以区分后续混合杂交和测序后来自不同文库的DNA序列。
P1接头的序列为:
5'—CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT–3'(SEQ ID NO:549);
3'—TTGGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA-5'(SEQ ID NO:550)。
4.DNA文库的优化
在杂交捕获前,将上述DNA文库进行PCR扩增以获得更有利杂交捕获的DNA文库,确保后续杂交时每一种文库分子中至少有一个文库分子能够与探针杂交。PCR引物由DNA Library Prep Set for Ion TorrentTM试剂盒提供。PCR反应体系见表7。PCR反应条件为:1)98℃预变性30s;2)98℃变性10s;58℃退火30s;72℃延伸30s;步骤2)循环5次;3)72℃延伸5min;4)4℃放置备用。PCR产物用Agencourt AMPure XP Kit进行纯化后,得到优化的DNA文库。
表7 文库杂交前PCR反应体系
(5)DNA文库的定量
将上述优化后的16个样本DNA文库用Qubit(采用QubitTM dsDNA BR Assay Kits)进行定量。每个文库定量结果见表8。根据DNA文库浓度,将1-4号文库按每个DNA文库取750ng/4=187.5ng进行等量混合,5-8号文库按每个文库取750ng/4=187.5ng进行等量混合,9-16号文库按每个文库取750ng/8=93.75ng进行等量混合。混合后的DNA文库用于后续杂交捕获。
表8 杂交捕获前文库Qubit定量结果
(6)DMD基因靶序列第一次杂交捕获
1)按照试剂盒SureSelect TE Reagent Kit,PTN,16(Agilent,货号:G9605A)的使用说明配制杂交buffe,见表9;65℃预热杂交buffer 5min;
表9 杂交buffer体系
2)配制杂交文库体系,见表10;文库体系95℃预杂交5min;
表10 杂交文库体系
3)配制SureSelect Oligo Library Mix(含有本发明设计的546种探针和RNaseblock),并将SureSelect Oligo Library Mix 65℃预热2min;
4)将上述处理后的文库体系、杂交buffer和探针Mix混匀,65℃孵育16~24h进行杂交捕获。
上述表10中用到的Ion P1Adapter Block和Ion Xpress Barcode X Block,其目的在于分别封闭文库构建中用到的P1接头和A接头,防止文库上的这两个接头序列和探针杂交。其序列如下:
Ion P1Adapter Block序列为:
5'—ATCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGG/3SpC3/–3'(SEQ ID NO:551);
Ion Xpress Barcode X Block序列为:
5'—ATCNNNNNNNNNNCTGAGTCGGAGACACGCAGGGATGAGATGG/3SpC3/–3'(SEQ ID NO:552);
上述序列中N代表A/G/C/T四种碱基的任意一种,以保证与相应的A接头序列匹配,“/3SpC3/”代表硫代磷酸键修饰。
(7)第一次洗脱捕获的靶序列
1)将上述杂交捕获后的反应液加入Dynabeads MyOne Streptavidin T1磁珠(Life Technologies,美国),在垂直混匀仪(BD Biosciences,美国)上室温混匀孵育30min,瞬时离心;
2)将离心管转移置于Dynal磁力架上,静置1~2min至管内液体澄清,去除上清液;
3)加入500μL SureSelect Wash Buffer#1重悬磁珠,并于漩涡混合仪上振荡5s混匀样品,室温孵育样品15min;
4)将离心管转移放置在Dynal磁力架上,静置1~2min至澄清,去除上清液;
5)加入500μL 65℃预热的SureSelect Wash Buffer#2重悬磁珠,并于漩涡混合仪上振荡5秒混匀样品;
6)将样品放水浴锅或干浴锅中65℃孵育10min;
7)颠倒离心管以混匀样品,瞬时离心3s;
8)将离心管转移放置在Dynal磁力架上,静置1-2min至澄清,去除上清液;
9)重复步骤5)到步骤8)两次,共洗涤三次;
10)用33.5μL Nuclease-free water重悬磁珠,所得上清液即为捕获的靶序列。
(8)靶序列的第一次PCR扩增
对上述所捕获的靶序列进行第一次PCR扩增,其中PCR反应体系如表11所示。
表11 靶序列第一次PCR反应体系
表11中所述Primer-F和Primer-R为根据接头序列设计的引物,引物序列如下:
Primer-F:5'—CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG–3'(SEQ ID NO:553),
Primer-R:5'—CCATCTCATCCCTGCGTGTC–3'(SEQ ID NO:554)。
PCR反应条件为:1)98℃预变性2min;2)98℃变性30s;58℃退火30s;72℃延伸1min;步骤2)循环5次;3)72℃延伸5min;4)4℃放置备用。PCR产物用Agencourt AMPure XPKit进行纯化,获得富集的靶序列。
(9)DMD基因靶序列第二次杂交捕获
将上一步富集后的靶序列进行第二次杂交捕获,以进一步提高杂交捕获的准确性。第二次杂交捕获的操作步骤与第一次杂交捕获相同。
(10)第二次洗脱捕获的靶序列
将第二次杂交捕获到的靶序列进行洗脱,操作方法与第一次洗脱相同。
(11)靶序列的第二次PCR扩增
将上步洗脱得到的靶序列进行第二次PCR扩增,PCR反应体系见表12。
表12 第二次杂交后PCR反应体系
表12中所述Primer-F和Primer-R为根据接头序列设计的引物,引物序列如下:
Primer-F:5'—CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG–3'(SEQ ID NO:553),
Primer-R:5'—CCATCTCATCCCTGCGTGTC–3'(SEQ ID NO:554)。
PCR反应条件为:1)98℃预变性2min;2)98℃变性30s;58℃退火30s;72℃延伸1min;步骤2)循环11次;3)72℃延伸5min;4)4℃放置备用。PCR产物用Agencourt AMPure XPKit进行纯化,获得富集的靶序列。
(12)靶序列溶液的质控与定量
对上一步第二次PCR扩增后所得的靶序列溶液进行Qubit定量:1)在1.5ml离心管中按照试剂盒QubitTM dsDNA HS Assay Kits(Invitrogen)说明书配制好工作液;2)取两份190μL配制好的工作液加到两个0.5mL的离心管,在两个离心管中分别加入标准品1和标准品2;3)取199μL配好的工作液分装到0.5mL离心管,标号,加入对应编号的杂交后文库1μL;4)室温静置2min;5)测定浓度;6)重复测3次,取平均值。
靶序列溶液的Qubit定量结果见表13。
然后用Agilent 2100生物分析仪(Agilent,美国)检测靶序列溶液中分子分布:1)根据Qubit检测的样本浓度,取适量到0.2mL PCR管,稀释到0.5ng/μL;2)准备Chip PrimingStation;3)准备Gel-Dye Mix;4)Loading Gel-Dye Mix;5)Loading Marker;6)LoadingLadder and Sample。
Agilent 2100分析结果见图4。从图中可以看出从4个混合样本中捕获到的靶序列的大小主要分布在200~450bp之间。
由于Qubit定量的精度有限,为确保最后各个靶序列溶液中产出的测序数据量有较好的均一性,本实施例采用SteponePlusTM实时荧光定量PCR系统(Applied Biosystems,美国)对文库进行qPCR定量,定量结果见表13。
表13 上机测序前靶序列Qubit定量和qPCR定量
(13)靶序列作为测序模板的制备及富集
测序模板制备依据的是乳液PCR的原理,它是在Ion OneTouchTM仪器上进行的。它可分为如下几个主要步骤:
1)Ion OneTouchTM仪器清洗;
2)根据上述qPCR检测结果,将靶序列溶液终浓度稀释到26pM,且应保证靶序列溶液终体积大于20μL;
3)安装Ion OneTouchTM Amplification Plate;安装Ion OneTouchTM Oil和IonOneTouchTM Recovery Solution的圆管;安装Ion OneTouchTM Recovery Tubes和IonOneTouchTM Recovery Router;配制Amplification Solution;安装Reaction FilterAssembly;运行Ion OneTouchTM仪器;
4)回收template-positive ISPs;清洗Ion OneTouchTM仪器。
然后需要富集连接了测序模板(即文库分子)的微珠。富集过程是通过链霉亲和素和生物素特异性结合而达到富集的,该过程是在Ion OneTouchTM ES上进行的。它分为如下几个步骤:1)配制Melt-Off Solution;2)清洗MyOneTM StreptavidinC1Beads;3)配制富集反应体系;4)启动Ion OneTouchTM ES,富集template-positive ISPs;5)清洗富集后的ISPs。
(14)半导体测序
将带有模板分子的微珠加载到Ion PGM Dx或Ion Proton测序仪的半导体芯片上进行测序。微珠加载过程按照测序仪厂家的操作说明进行,它分为如下几个步骤:1)清洗测序仪;2)设置测序程序;3)测序仪的初始化;4)上机文库准备及芯片检测和清洗;5)芯片加样;6)启动测序。
其中半导体芯片上样监测图如图5所示,反应此次上机测序步骤中模板制备及富集效果和loading的结果符合要求。
(15)测序结果的生物信息学分析
上述16个样本经过杂交捕获和半导体测序的生物信息学分析结果以及和常规方法(对于点突变检测的常规方法为:采用Sanger测序进行检测;对于外显子缺失或重复的常规方法为:采用多重连接依赖探针扩增法MLPA进行检测)检测结果对比情况见表14。
表14 16份样本的DMD检测结果及与常规方法检测结果对比
从表14可见,本发明的试剂盒检测结果与常规方法结果一致,此外,还看出本发明试剂盒能够同时对外显子缺失、重复和点突变进行准确检测。从表14还可看出,虽然肌肉活检是诊断DMD的金标准,但肌肉活检是有创性检查,给患儿带来痛苦,而且检测周期也比较长。因此,说明本发明是切实可行的,同时本发明还具有显著的临床应用价值。
根据上述研究结果,可制备一种检测假肥大型肌营养不良症的试剂盒或核酸探针混合物,该试剂盒或核酸探针混合物中含有核苷酸序列为SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:546所示的核酸探针。
为本领域的专业技术人员容易理解,以上所述仅为本发明专利的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均落在本发明要求的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种检测假肥大型肌营养不良症的检测探针组,所述探针组为SEQ ID NO: 1~SEQID NO: 546所示的核酸序列。
2.一种检测假肥大型肌营养不良症的核酸探针混合物,其特征在于:该核酸探针混合物含有核苷酸序列为SEQ ID NO:1~ SEQ ID NO:546所示的核酸探针组。
3.一种检测假肥大型肌营养不良症的试剂盒,其特征在于:该试剂盒中含有核苷酸序列为SEQ ID NO:1~ SEQ ID NO:546所示的核酸探针组。
4.一种检测待测样品中假肥大型肌营养不良症相关核酸分子的核苷酸序列的方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)基因组DNA文库的构建:提取将待测样品中的基因组DNA,并将其打断成100~500bp大小的片段;将打断后的双链DNA 片段的两端进行末端修复后,再连接上测序接头;即可获得DNA文库;
2)DNA文库的优化:将上述DNA文库中带有测序接头的DNA 片段进行PCR扩增,获得优化的DNA文库;
3)第一次杂交捕获靶序列:将优化的DNA文库中的双链DNA片断变性后,利用权利要求1中所述的检测探针组SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:546对其进行杂交捕获靶序列;
4)靶序列洗脱和第一次PCR扩增:将上一步捕获的靶序列进行洗脱,将洗脱下来的靶序列进行PCR扩增;
5)第二次杂交捕获靶序列:将上一步PCR扩增后的靶序列进行变性后,再用权利要求1中所述的检测探针组SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:546进行杂交捕获;
6)靶序列洗脱和第二次PCR扩增:将上述第二次捕获的靶序列进行洗脱,并将洗脱下来的靶序列进行第二次PCR扩增;
7)将上述第二次PCR扩增的产物进行测序,即可获得与DMD相关的核酸分子序列;对该序列进行生物信息学分析,确定待测样品中假肥大型肌营养不良症相关核酸分子的突变情况;
上述方法用于非诊断目的。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于: 步骤1)中所述测序接头包括A接头和P1接头,其序列如下:
A接头的序列为:
5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT-3' (SEQ ID NO:547);
3'-CGCACAGAGGCTGAGTCNNNNNNNNNNCTA-5'(SEQ ID NO:548);
上述序列中的N代表A/G/C/T四种碱基的任意一种;
P1接头的序列为:
5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3' (SEQ ID NO:549);
3'-TTGGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA-5'(SEQ ID NO:550)。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:步骤3)和步骤5)中所述第一次和第二次杂交捕获靶序列的具体操作均为:
1)利用试剂盒SureSelect TE Reagent Kit, PTN, 16 按照说明书配制杂交buffer,配方如下所示:
将配制好的杂交buffer 65℃预热5min;
2)利用试剂盒SureSelect TE Reagent Kit, PTN, 16 按照说明书配制杂交文库体系,配方如下所示:
将配制好的文库体系于95℃ 预杂交5min;
其中Ion P1 Adapter Block和Ion Xpress Barcode X Block,其目的在于分别封闭文库构建中用到的P1接头和A接头,防止文库上的这两个接头序列和探针杂交;其序列如下:
Ion P1 Adapter Block序列为:
5'-ATCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGG/3SpC3/–3'(SEQ ID NO:551);
Ion Xpress Barcode X Block序列为:
5'-ATCNNNNNNNNNNCTGAGTCGGAGACACGCAGGGATGAGATGG/3SpC3/–3'(SEQ ID NO:552)
上述序列中N代表A/G/C/T四种碱基的任意一种,以保证与相应的A接头序列匹配,“/3SpC3/”代表硫代磷酸键修饰;
3)配制SureSelect Oligo Library Mix,其中含有SEQ ID NO:1~ SEQ ID NO:546所示的546种探针和RNase block,并将SureSelect Oligo Library Mix 65℃预热2min;
4)将上述处理后的杂交文库体系、杂交buffer和SureSelect Oligo Library Mix混匀,65℃孵育16~24h进行杂交捕获。
7.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:步骤4)和步骤6)中所述第一次PCR扩增和第二次PCR扩增的引物为:
Primer-F:5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG-3'(SEQ ID NO:553),
Primer-R:5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTC-3'(SEQ ID NO:554)。
8.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:步骤7)中所述测序为半导体测序。
9.根据权利要求4或7所述的方法,其特征在于:所述的测序用Ion PGM Dx或IonProton测序仪进行的半导体测序。
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