CN103572378B - 基于Ion ProtonTM 测序平台的小片段DNA文库的构建方法及其应用 - Google Patents

基于Ion ProtonTM 测序平台的小片段DNA文库的构建方法及其应用 Download PDF

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CN103572378B CN201310518435.0A CN201310518435A CN103572378B CN 103572378 B CN103572378 B CN 103572378B CN 201310518435 A CN201310518435 A CN 201310518435A CN 103572378 B CN103572378 B CN 103572378B
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Abstract

本发明属于基因测序领域，公开了一种基于Ion？ProtonTM测序平台的小片段DNA文库的构建方法以及相关的试剂组合溶液。本发明的构建方法包括样品DNA提取、末端修复、片段筛选、接头连接、PCR扩增、文库检测和高通量测序等步骤。在末端修复、接头连接和PCR扩增步骤中分别采用试剂I、试剂II和试剂III。本发明的构建方法步骤精简、操作简单、试剂种类少、成本低、降低了文库的损失和浪费、提高了劳动效率。此外，本发明的构建方法可用于基于Ion？ProtonTM测序平台的孕妇外周血胎儿染色体非整倍体的无创产前诊断，诊断结果准确率高且安全经济，能够帮助有效控制染色体非整倍体胎儿的出生率。

Description

基于Ion ProtonTM 测序平台的小片段DNA文库的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及基因测序领域，特别是高通量测序领域，具体涉及一种基于IonProtonTM测序平台的小片段DNA文库的构建方法，以及该方法在孕妇外周血中胎儿染色体非整倍体的无创检测中的应用。
背景技术
染色体非整倍体是指相对于人的正常的46条染色体而言，细胞中的某一条或几条染色体数目增加或减少，与婴幼儿期显著的发病率和死亡率有着密切的关系。新生儿中染色体异常的发病率为1/160，其中21-三体(唐氏综合征)、18-三体(爱德华氏综合征)和13-三体(帕陶氏综合征)是三种最主要常染色体非整倍体疾病，在新生儿中发病率分别为1/800、1/6000和1/1000[1]。Klinefelter综合征(47，XXY)、XYY综合征、特纳氏综合征(45，X)和超雌综合征(47，XXX)是最常见的性染色体非整倍体疾病，在新生男婴和女婴中的发病率分别为1/500和1/850。目前，此类疾病尚无有效治疗方法，只能通过产前诊断减少患儿的出生。
在该类疾病现有的检测方法中，利用第二代高通量测序技术对胎儿染色体非整倍体进行检测的方法具有明显的优势。第一，只需抽取母体外周血进行检测，避免了传统的侵入性方法可能会对孕妇和胎儿带来的危害；第二，直接检测染色体上的DNA序列即直接致病因素，与用血清蛋白标记物和超声波进行检测的方法相比，检测的准确性和灵敏度都大大提高；第三，通过深度测序，实现了对孕妇外周血中少量胎儿游离DNA(cell-freefetalDNA，cffDNA)的准确检测，克服了传统检测方法因胎儿游离DNA的含量过低而呈现高的假阴性率的缺点。
高通量测序技术又称为下一代测序技术、深度测序技术，第二代高通量illumina测序平台具有测序通量高、准确度高和成本低等优点，并广泛应用于多个领域。在上述高通量检测方法的整个流程中，高通量测序文库的制备是非常关键的一步，文库质量的好坏将直接影响测序数据的质量，并最终影响到检测结果的准确性。
现有技术中基于illumina测序平台的文库构建方法主要包括以下步骤：
1、将DNA打断到一定的大小，纯化；
2、对DNA片段进行末端修复，纯化；
3、在已修复的DNA片段的3’端加上一个“A”碱基，纯化；
4、用DNA连接酶将特异性接头连接至DNA片段的两端，纯化；
5、对加接头的DNA序列进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收一定大小的片段，纯化；
6、采用PCR方法扩增DNA文库，纯化；
7、用AgilentBioanalyzer2100和Q-PCR检测片段大小及文库浓度；
8、使用illumina测序平台进行高通量测序。
上述基于illumina测序平台的文库构建方法存在自身的局限性：第一，上述小片段DNA文库构建流程繁琐，操作过程复杂，建库所花费的时间长；第二，上述建库流程中，各个步骤需相互独立进行制备且都需要进行纯化，这就造成了DNA文库样品不可避免的损失和浪费，不适用于DNA量少的样本或其他珍稀样本的检测；第三，构建文库所用试剂的种类繁多，使得整个构建文库的过程的成本增加。
发明内容
针对现有技术中存在的上述缺陷，本发明一方面提供了一种基于IonProtonTM测序平台的小片段DNA文库的构建方法，包括以下步骤：
1、样品DNA提取；
2、末端修复：将样品DNA与试剂I混合，室温下孵育进行反应；
3、片段筛选：对步骤1所得的混匀DNA液进行片段筛选及纯化，得到片段集中的平末端DNA片段；
4、接头连接：将步骤3所得到的DNA片段与试剂II、接头、特异标签序列反应后纯化，得到加了接头的DNA片段；
5、PCR扩增：将步骤4所得到的DNA片段加入试剂III，进行PCR扩增，纯化，得到小片段DNA文库；
6、文库检测：将步骤5所得到的扩增产物采用Q-PCR和AgilentBioanalyzer2100检测文库浓度及文库片段大小；
7、高通量测序：对步骤6所得到的合格文库进行高通量测序，优选采用IonProtonTM测序平台；
其中，步骤2中的试剂I的pH值为7.4～7.6，优选为7.5，溶剂为水，溶质为：5mM～20mM缓冲盐溶液、50mM～200mM可溶性盐溶液、1mM～5mM二硫苏糖醇、8mM～12mMATP、10mMdNTPs混合液和EndRepair酶；
步骤4中的混合试剂II的pH值为7.5～7.8，优选为7.6，溶剂为水，溶质为：20mM～80mM缓冲盐溶液、5mM～20mMMgCl2、5mM～50mM二硫苏糖醇、0.5mM～2mMATP、2mMdNTPs混合液、DNA连接酶和NickRepair酶；
步骤5中混合试剂III的pH值为7.6～7.9，优选为7.6，溶剂为水，溶质为如下终浓度物质：50mM～100mM缓冲盐溶液、18mM～30mM可溶性盐溶液、2mM～5mMMgSO4、200μM～300μMdNTPs混合液、DNA聚合酶和10mM引物混合液。
所述步骤2中试剂I中的缓冲盐溶液为Tris-HCl、磷酸盐溶液等缓冲盐溶液，优选为Tris-HCl。
所述步骤2中试剂I中的可溶性盐溶液为NaCl、KCl等盐溶液，优选为KCl。
所述步骤4中试剂II中的缓冲盐溶液为Tris-HCl、磷酸盐溶液等缓冲盐溶液，优选为Tris-HCl。
所述步骤5中试剂III中的缓冲盐溶液为Tris-SO4、Tris-HCl等缓冲盐溶液，优选为Tris-SO4。
所述步骤5中试剂III中的可溶性盐溶液为硫酸盐溶液，优选为(NH4)2SO4。
在本发明优选的实施方案中，步骤1中的样品DNA提取自孕妇外周血的血浆。
在本发明优选的实施方案中，步骤1采用试剂盒提取DNA，DNA提取试剂盒可使用TIANGEN公司的TIANampMicroDNAkit(产品号为DP316)，也可使用Qiagen公司的QIAampMinEluteVirusSpinKit(产品号为57704)。
在本发明优选的实施方案中，步骤3通过Ampure磁珠进行片段筛选，筛选的片段大小范围是100-350bp，例如100bp、200bp、300bp。
在本发明优选的实施方案中，步骤4的接头为带有T碱基末端的任意接头，更加优选地，是由如下正反两个序列组成的P1Adapter：
5'–CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT–3'
3'–T*T*GGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA–5'。
在本发明优选的实施方案中，步骤4中的特异标签序列是由如下正反两个序列组成的BarcodePrimerX：
5'–CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT–3'
3'–C-GCACAGAGGCTGAGTCNNNNNNNNNNCTA–5'。
其中BarcodePrimerX优选选自：
BarcodePrimer1：
5'-CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGAT-3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCGATTCCATTGCTA-5'；
BarcodePrimer2：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTAAGGAGAACGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCATTCCTCTTGCTA-5'；
BarcodePrimer3：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGAAGAGGATTCGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCTTCTCCTAAGCTA-5'；
BarcodePrimer4：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTACCAAGATCGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCATGGTTCTAGCTA-5'；
BarcodePrimer5：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGCAGAAGGAACGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCGTCTTCCTTGCTA-5'；
BarcodePrimer6：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGCTGCAAGTTCGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCGACGTTCAAGCTA-5'；
BarcodePrimer7：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTTCGTGATTCGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCAAGCACTAAGCTA-5'；
BarcodePrimer8：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTTCCGATAACGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCAAGGCTATTGCTA-5'；
BarcodePrimer9：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTGAGCGGAACGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCACTCGCCTTGCTA-5'；
BarcodePrimer10：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGCTGACCGAACGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCGACTGGCTTGCTA-5'；
BarcodePrimer11：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTCCTCGAATCGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCAGGAGCTTAGCTA-5'；
BarcodePrimer12
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTAGGTGGTTCGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCATCCACCAAGCTA-5'；
BarcodePrimer13
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTCTAACGGACGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCAGATTGCCTGCTA-5'；
BarcodePrimer14
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTTGGAGTGTCGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCAACCTCACAGCTA-5'；
BarcodePrimer15
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTCTAGAGGTCGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCAGATCTCCAGCTA-5'；
BarcodePrimer16
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTCTGGATGACGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCAGACCTACTGCTA-5'。
在本发明优选的实施方案中，步骤5中PCR扩增所使用的引物为：
Primer1.0：5'—CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG—3'
PrimerA：5'—CCATCTCACCCTGCGTGTC—3'。
本发明另一方面还提供了根据本发明的上述方法所构建的小片段DNA文库。
本发明再一方面还提供了用于构建基于IonProtonTM测序平台的小片段DNA文库的试剂I、试剂II和试剂III。其中试剂I的pH值为7.4～7.6，优选为7.5，溶剂为水，溶质为：5mM～20mM缓冲盐溶液、50mM～200mM可溶性盐溶液、1mM～5mM二硫苏糖醇、8mM～12mMATP、10mMdNTPs混合液和EndRepair酶，所述试剂I用于对样品DNA进行末端修复。试剂II的pH值为7.5～7.8，优选为7.6，溶剂为水，溶质为20mM～80mM缓冲盐溶液、5mM～20mMMgCl2、5mM～50mM二硫苏糖醇、0.5mM～2mMATP、2mMdNTPs混合液、DNA连接酶和NickRepair酶，所述试剂II用于对DNA片段进行接头连接。试剂III的pH值为7.6～7.9，优选为7.6，溶剂为水，溶质为如下终浓度物质：50mM～100mM缓冲盐溶液、18mM～30mM可溶性盐溶液、2mM～5mMMgSO4、200μM～300μMdNTPs混合液、DNA聚合酶和10mM引物混合液，所述试剂III用于对DNA片段进行PCR扩增。
本发明最后一方面还提供了本发明上述的试剂I、试剂II或试剂III在构建小片段DNA文库中的应用。
本发明的方法建立了一种新的基于IonProtonTM测序平台的小片段DNA文库构建方法。与以往基于测序平台的建库流程相比，本发明的方法步骤精简、操作简单、试剂种类少、成本低，降低了文库的损失和浪费、提高了劳动效率。同时，本发明的方法还适用于人为片段化的小DNA文库的构建。
此外，本发明的方法可被应用于基于IonProtonTM测序平台的孕妇外周血胎儿染色体非整倍体的无创检测。与现有的检测方法相比，采用本发明的方法不仅能够避免侵入性方法所导致的危害；而且降低了单个样本的检测成本、缩短了检测耗时；同时还扩大了适用范围：不仅适用于大规模样本的检测，还适用于小样本量的检测。从整体而言，本发明的方法可用于胎儿染色体非整倍体无创产前诊断，帮助有效控制染色体非整倍体胎儿的出生率。
附图说明
图1：基于本发明IonProtonTM测序平台的无创产前外周血血样检测流程图。
图2：基于本发明IonProtonTM测序平台的小片段DNA建库流程图。
图3A：采用AgilentBioanalyzer2100对本发明文库的检测结果图(样品G1、G2、G3、G4、G5、G6)。
图3B：采用AgilentBioanalyzer2100对本发明文库的检测结果图(样品G7、G8、G9、N)。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
实施例1：基于IonProtonTM测序平台的小片段DNA文库的构建方法
1、试剂
本实施例采用以下试剂：EndRepairEnzyme(LifeTechnology)、DNALigase(LifeTechnology)、NickRepairPolymerase(LifeTechnology)、Adapter(LifeTechnology)、BarcodeX(LifeTechnology)、lowTEbuffer(10mMTris-HCl,0.1mMEDTA,pH值为8.0)；
试剂I的pH值为7.5，溶剂为水，溶质为：10mMTris-HCl、100mMKCl、2mM二硫苏糖醇、10mMATP、10mMdNTPs混合液、6U/μlEndRepair酶；
试剂II的pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：50mMTris-HCl、10mMMgCl2、10mM二硫苏糖醇、1mMATP、2mMdNTPs混合液、400U/μlDNA连接酶和10U/μlNickRepair酶；
试剂III的pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：66mMTris-SO4(pH8.9)、19.8mM(NH4)2SO4、2.4mMMgSO4、220μMdNTPs混合液、22U/ml重组TaqDNApolymerase及PyrococcusspeciesGB-Dthermostablepolymerase和10mM引物混合液。
2、实验步骤
(1)采集母体外周血，制备血浆
在本实施例中，总共抽取了9名孕妇的外周血，编号为：G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9。血样经两步离心法得到除去了血细胞的血浆，每个血样的血浆量大约为1ml。上述血样均由广州市妇女儿童医疗中心采集获得，且均经过染色体核型分析。实验中加入阴性对照N，阴性对照以经过灭菌的高纯水替代血浆。因此，包括阴性在内共10份样品。
(2)提取血浆DNA
使用TIANGEN公司生产的TIANampMicroDNAkit(产品号为DP316)提取血浆中的DNA。也可使用Qiagen公司的QIAampMinEluteVirusSpinKit(产品号为57704)。
(3)将血浆DNA制成可供单端测序的文库
A、末端修复
将上一步提取获得的DNA分别按照下面的表格配置反应体系，在室温下放置20min。
B、片段筛选
经过两轮Ampure磁珠(来自Agencourt公司)纯化做DNA片段筛选得到片段集中的DNA，25μllowTEbuffer溶液溶解洗脱。
C、接头连接
将上述片段集中的DNA溶液分别按照下面的表格配置反应体系：
PCR反应条件：25℃，15min；72℃，5min；4℃，holding。连接完接头之后用Ampure磁珠进行纯化，19.2μllowTEbuffer溶液溶解洗脱。
接头为由如下两个正反序列组成的P1Adapter：
5'—CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT—3'，
3'—T*T*GGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA—5'。
对应于10个样品的BarcodeX分别如下：
BarcodePrimer1：
5'-CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGAT-3'
3'–C-GCACAGAGGCTGAGTCGATTCCATTGCTA-5'；
BarcodePrimer2：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTAAGGAGAACGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCATTCCTCTTGCTA-5'；
BarcodePrimer3：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGAAGAGGATTCGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCTTCTCCTAAGCTA-5'；
BarcodePrimer4：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTACCAAGATCGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCATGGTTCTAGCTA-5'；
BarcodePrimer5：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGCAGAAGGAACGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCGTCTTCCTTGCTA-5'；
BarcodePrimer6：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGCTGCAAGTTCGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCGACGTTCAAGCTA-5'；
BarcodePrimer7：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTTCGTGATTCGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCAAGCACTAAGCTA-5'；
BarcodePrimer8：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTTCCGATAACGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCAAGGCTATTGCTA-5'；
BarcodePrimer9：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTGAGCGGAACGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCACTCGCCTTGCTA-5'；
BarcodePrimer10：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGCTGACCGAACGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCGACTGGCTTGCTA-5'。
D、PCR扩增
将10份样品分别按照下面的表格配置反应体系，
PCR反应条件：95℃，5min；(95℃，15s；58℃，15s；70℃，1min)9cycles；4℃，Holding。PCR结束后，用Ampure磁珠进行纯化，20μllowTEbuffer溶液溶解洗脱。
试剂III中的PCR扩增引物为Primer1.0，其具体序列为：
5'—CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG—3'。
E、文库检测
用Q-PCR检测扩增产物的浓度，具体检测结果见下表。
从上表中的数据可知，本发明的试剂组合溶液和文库构建方法所构建的文库浓度适当，远远高于Proton上机浓度(26pM)，该发明的试剂组合溶液和文库构建方法可适用于IonProtonTM测序平台。
F、高通量测序及结果分析
利用IonProtonTM测序平台对上述构建好的DNA文库进行高通量测序，并对测序数据进行生物信息学分析得到如下结果。
上表中数据显示，9份血样的测序分析结果与医院核型结果完全一致。这说明该发明的试剂组合溶液和文库构建方法适用于IonProtonTM测序平台，并且该方法适用于在IonProtonTM测序平台上进行孕妇外周血胎儿染色体非整倍体检测。

Claims (20)

1.一种基于IonProtonTM测序平台的小片段DNA文库的构建方法，包括以下步骤：
（1）样品DNA提取；
（2）末端修复：将样品DNA与试剂I混合，室温下孵育进行反应；
（3）片段筛选：对步骤（2）所得的混匀DNA液采用两轮磁珠纯化进行片段筛选，得到片段大小范围集中在100-350bp的平末端DNA片段；
（4）接头连接：将步骤（3）所得到的DNA片段与试剂II、接头、特异标签序列反应后纯化，得到加了接头的DNA片段；
（5）PCR扩增：将步骤（4）所得到的DNA片段加入试剂III，进行PCR扩增，纯化，得到小片段DNA文库；
（6）文库检测：将步骤（5）所得到的扩增产物采用Q-PCR和AgilentBioanalyzer2100检测文库浓度及文库片段大小；
（7）高通量测序：基于IonProtonTM测序平台，对步骤（6）所得到的合格文库进行高通量测序；
其中，步骤（2）中的试剂I的pH值为7.4～7.6，溶剂为水，溶质为：5mM～20mM缓冲盐溶液、50mM～200mM可溶性盐溶液、1mM～5mM二硫苏糖醇、8mM～12mMATP、10mMdNTPs混合液和EndRepair酶；其中缓冲盐溶液为Tris-HCl或磷酸盐溶液；可溶性盐溶液为NaCl或KCl；
所述步骤（4）中的试剂II的pH值为7.5～7.8，溶剂为水，溶质为：20mM～80mM缓冲盐溶液、5mM～20mMMgCl2、5mM～50mM二硫苏糖醇、0.5mM～2mMATP、2mMdNTPs混合液、DNA连接酶和NickRepair酶；其中缓冲盐溶液为Tris-HCl或磷酸盐溶液；
所述步骤（5）中的试剂III的pH值为7.6～7.9，溶剂为水，溶质为如下终浓度物质：50mM～100mM缓冲盐溶液、18mM～30mM可溶性盐溶液、2mM～5mMMgSO4、200μM～300μMdNTPs混合液、DNA聚合酶和10mM引物混合液；其中缓冲盐溶液为Tris-SO4或Tris-HCl；可溶性盐溶液为硫酸盐溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（2）中的试剂I的pH值为7.5，溶剂为水，溶质为：10mMTris-HCl，100mMKCl、2mM二硫苏糖醇、10mMATP、10mMdNTPs混合液、6U/μlEndRepair酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（4）中的试剂II的pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：50mMTris-HCl、10mMMgCl2、10mM二硫苏糖醇、1mMATP、2mMdNTPs混合液、400U/μlDNA连接酶和10U/μlNickRepair酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（5）中的试剂III的pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：pH值为8.9的66mMTris-SO4、19.8mM(NH4)2SO4、2.4mMMgSO4、220μMdNTPs混合液、22U/ml重组TaqDNApolymerase及PyrococcusspeciesGB-Dthermostablepolymerase和10mM引物混合液。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（1）中的样品DNA提取自孕妇外周血的血浆。
6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（1）采用试剂盒提取DNA，DNA提取试剂盒为TIANGEN公司的产品号为DP316的TIANampMicroDNAkit或Qiagen公司的产品号为57704的QIAampMinEluteVirusSpinKit。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（3）通过Ampure磁珠进行片段筛选。
8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（4）的接头为带有T碱基末端的任意接头。
9.根据权利要求8所述的方法，其中步骤（4）的接头为由如下正反两个序列组成的P1Adapter：
5'–CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT–3'
3'–T*T*GGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA–5'。
10.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（4）中的特异标签序列是由如下正反两个序列组成的BarcodePrimerX：
5'–CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT–3'
3'–C-GCACAGAGGCTGAGTCNNNNNNNNNNCTA–5'。
11.根据权利要求10所述的方法，其中BarcodePrimerX选自：
BarcodePrimer1：
5'-CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGAT-3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCGATTCCATTGCTA-5'；
BarcodePrimer2：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTAAGGAGAACGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCATTCCTCTTGCTA-5'；
BarcodePrimer3：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGAAGAGGATTCGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCTTCTCCTAAGCTA-5'；
BarcodePrimer4：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTACCAAGATCGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCATGGTTCTAGCTA-5'；
BarcodePrimer5：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGCAGAAGGAACGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCGTCTTCCTTGCTA-5'；
BarcodePrimer6：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGCTGCAAGTTCGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCGACGTTCAAGCTA-5'；
BarcodePrimer7：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTTCGTGATTCGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCAAGCACTAAGCTA-5'；
BarcodePrimer8：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTTCCGATAACGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCAAGGCTATTGCTA-5'；
BarcodePrimer9：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTGAGCGGAACGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCACTCGCCTTGCTA-5'；
BarcodePrimer10：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGCTGACCGAACGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCGACTGGCTTGCTA-5'；
BarcodePrimer11：
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTCCTCGAATCGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCAGGAGCTTAGCTA-5'；
BarcodePrimer12
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTAGGTGGTTCGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCATCCACCAAGCTA-5'；
BarcodePrimer13
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTCTAACGGACGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCAGATTGCCTGCTA-5'；
BarcodePrimer14
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTTGGAGTGTCGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCAACCTCACAGCTA-5'；
BarcodePrimer15
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTCTAGAGGTCGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCAGATCTCCAGCTA-5'；
BarcodePrimer16
5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGTCTGGATGACGAT–3'
3'-C-GCACAGAGGCTGAGTCAGACCTACTGCTA-5'。
12.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（5）中PCR扩增所使用的引物为
Primer1.0：5'—CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG—3'
PrimerA：5'—CCATCTCACCCTGCGTGTC—3'。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法构建的小片段DNA文库。
14.一种用于构建基于IonProtonTM测序平台的小片段DNA文库的试剂I，其pH值为7.4～7.6，溶剂为水，溶质为：5mM～20mM缓冲盐溶液、50mM～200mM可溶性盐溶液、1mM～5mM二硫苏糖醇、8mM～12mMATP、10mMdNTPs混合液和EndRepair酶，所述试剂I用于对样品DNA进行末端修复；其中缓冲盐溶液为Tris-HCl或磷酸盐溶液；可溶性盐溶液为NaCl或KCl。
15.根据权利要求14所述的试剂I，其pH值为7.5，溶剂为水，溶质为：10mMTris-HCl，100mMKCl、2mM二硫苏糖醇、10mMATP、10mMdNTPs混合液、6U/μlEndRepair酶。
16.一种用于构建基于IonProtonTM测序平台的小片段DNA文库的试剂II，其pH值为7.5～7.8，溶剂为水，溶质为：20mM～80mM缓冲盐溶液、5mM～20mMMgCl2、5mM～50mM二硫苏糖醇、0.5mM～2mMATP、2mMdNTPs混合液、DNA连接酶和NickRepair酶，所述试剂II用于对DNA片段进行接头连接；其中缓冲盐溶液为Tris-HCl或磷酸盐溶液。
17.根据权利要求16所述的试剂II，其pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：50mMTris-HCl、10mMMgCl2、10mM二硫苏糖醇、1mMATP、2mMdNTPs混合液、400U/μlDNA连接酶和10U/μlNickRepair酶。
18.一种用于构建基于IonProtonTM测序平台的小片段DNA文库的试剂III，其pH值为7.6～7.9，溶剂为水，溶质为如下终浓度物质：50mM～100mM缓冲盐溶液、18mM～30mM可溶性盐溶液、2mM～5mMMgSO4、200μM～300μMdNTPs混合液、重组TaqDNApolymerase及PyrococcusspeciesGB-Dthermostablepolymerase和10mM引物混合液，所述试剂III用于对DNA片段进行PCR扩增；其中缓冲盐溶液为Tris-SO4或Tris-HCl；可溶性盐溶液为硫酸盐溶液。
19.根据权利要求18所述的试剂III，其pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：pH值为8.9的66mMTris-SO4、19.8mM(NH4)2SO4、2.4mMMgSO4、220μMdNTPs混合液、22U/ml重组TaqDNApolymerase及PyrococcusspeciesGB-Dthermostablepolymerase和10mM引物混合液。
20.权利要求14-19中任一项所述的试剂I、试剂II或试剂III在构建基于IonProtonTM测序平台的小片段DNA文库中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106867996A (zh) * 2017-03-01 2017-06-20 南京世和基因生物技术有限公司 一种从胸水中提取cfDNA的方法、试剂盒以及构建的cfDNA文库

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104313698B (zh) * 2014-10-29 2020-05-12 华中科技大学同济医学院附属同济医院 一种检测胆汁淤积性黄疸致病基因的dna文库及其应用
CN105624274B (zh) * 2014-11-06 2019-04-02 绍兴积准生物科技有限公司 肿瘤靶向药物相关基因突变高通量检测方法、引物及试剂
CN104404034A (zh) * 2014-12-15 2015-03-11 赛业健康研究中心（太仓）有限公司 利用口腔上皮细胞制作单细胞测序参考品的方法
US10435736B2 (en) * 2014-12-18 2019-10-08 Mgi Tech Co., Ltd. Target region enrichment method based on multiplex PCR, and reagent
CN104498614B (zh) * 2014-12-31 2017-07-11 广州和泰科技有限公司 假肥大型肌营养不良症的检测探针及其无创检测试剂盒
CN104789553A (zh) * 2015-04-08 2015-07-22 浙江圣庭生物科技有限公司 一种血液游离dna文库的构建方法
CN104946623A (zh) * 2015-04-08 2015-09-30 浙江圣庭生物科技有限公司 基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的构建方法
CN104911179B (zh) * 2015-06-25 2017-09-19 深圳承启生物科技有限公司 一种提取dna的方法
CN105239164B (zh) * 2015-07-22 2017-12-08 广州市达瑞生物技术股份有限公司 一种胎儿游离dna文库定量的标准品及其制备方法
CN105524920B (zh) * 2016-01-21 2018-10-02 深圳华大基因研究院 用于Ion Proton测序平台的TN5建库的引物组、试剂盒和建库方法
CN105624798B (zh) * 2016-02-19 2019-09-10 北京爱普益医学检验中心有限公司 一种胎儿染色体文库构建的试剂盒、方法及其应用
CN105779437A (zh) * 2016-03-11 2016-07-20 台州黄岩圣庭医学检验所 一种基于Ion PGMTM测序平台的扩增子DNA文库的构建方法、试剂及其应用
CN105926043B (zh) * 2016-04-19 2018-08-28 苏州贝康医疗器械有限公司 一种提高孕妇血浆游离dna测序文库中胎儿游离dna占比的方法
CN106591956A (zh) * 2016-11-15 2017-04-26 上海派森诺医学检验所有限公司 一种测序文库构建方法
CN107955835B (zh) * 2017-05-27 2021-05-14 广州市达瑞生物技术股份有限公司 一种检测brca1/2基因突变的引物池及检测方法
CN107955832B (zh) * 2017-09-08 2021-05-14 广州市达瑞生物技术股份有限公司 一套同时检测地贫、耳聋、苯丙酮尿症、肝豆状核变性病的引物组及方法
CN108060218A (zh) * 2017-11-14 2018-05-22 广州精科医学检验所有限公司 核酸测序文库中预定范围的核酸片段的筛选方法
CN108130323A (zh) * 2017-12-20 2018-06-08 奥明（杭州）基因科技有限公司 一种适用于植物转座酶可接近性染色质分析的建库方法
CN108588064B (zh) * 2018-04-23 2019-07-26 上海桐树生物科技有限公司 构建目的序列dna文库的试剂盒及目的序列dna文库的构建方法
CN113008647A (zh) * 2021-02-25 2021-06-22 武汉魅杰生物科技有限公司 一种atp酶组织化学染色方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102061526A (zh) * 2010-11-23 2011-05-18 深圳华大基因科技有限公司 一种DNA文库及其制备方法、以及一种检测SNPs的方法和装置
WO2012079490A1 (zh) * 2010-12-15 2012-06-21 深圳华大基因科技有限公司 构建dna测序文库的方法及其用途
CN102839168A (zh) * 2012-07-31 2012-12-26 深圳华大基因研究院 核酸探针及其制备方法和应用
CN103361743A (zh) * 2013-07-23 2013-10-23 安诺优达基因科技(北京)有限公司 一种用于产前诊断的dna文库构建方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102061526A (zh) * 2010-11-23 2011-05-18 深圳华大基因科技有限公司 一种DNA文库及其制备方法、以及一种检测SNPs的方法和装置
WO2012079490A1 (zh) * 2010-12-15 2012-06-21 深圳华大基因科技有限公司 构建dna测序文库的方法及其用途
CN102560688A (zh) * 2010-12-15 2012-07-11 深圳华大基因科技有限公司 一种新的基于illumina测序平台的文库构建方法
CN102839168A (zh) * 2012-07-31 2012-12-26 深圳华大基因研究院 核酸探针及其制备方法和应用
CN103361743A (zh) * 2013-07-23 2013-10-23 安诺优达基因科技(北京)有限公司 一种用于产前诊断的dna文库构建方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106867996A (zh) * 2017-03-01 2017-06-20 南京世和基因生物技术有限公司 一种从胸水中提取cfDNA的方法、试剂盒以及构建的cfDNA文库
CN106867996B (zh) * 2017-03-01 2018-05-18 南京世和基因生物技术有限公司 一种从胸水中提取cfDNA的方法、试剂盒以及构建的cfDNA文库

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