CN104911179B - 一种提取dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种DNA提取方法以及基于所述提取方法的DNA文库构建方法和高通量测序方法。所述DNA提取方法可有效提取微量、已降解成小片段和/或被污染的DNA，从而使得之后DNA建库和测序能够顺利进行，最终获取其序列信息。

Description

一种提取DNA的方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及提取超微量和/或被污染和/或高度降解的DNA的方法。

背景技术

高通量测序(又称新一代测序、二代测序，Next-generation sequencing)可以一次性测定大量核酸序列，被广泛用于基因组、转录组研究，并在医学、法医等领域也获得诸多应用。高通量测序的基本原理是将待测DNA随机打断成小片段，经末端修复、连接接头序列并进行PCR(称为“建库”过程)，然后使用Illumina,Ion Torrent等测序仪进行测序(M.L.Metzker,Sequencing technologies—the next generation,Naturereviews.Genetics 11,31–46(2010))。但全面测定基因组信息需要较多的DNA量作为起始来进行建库，通常不少于100ng。当DNA的量低于这一量时，建库效率急剧降低，以致无法进行测序。为了解决超微量样品的测序问题，人们研究了所谓的“单细胞测序”(single-cellsequencing)技术，即采用几百、几十个甚至单个细胞内提取出的DNA作为起始DNA来进行测序。目前所有的单细胞测序技术都基于全基因组扩增方案，使用模板依赖性的DNA聚合酶(多用Phi29DNA聚合酶)对单个基因组DNA分子进行扩增，从而使DNA量满足测序建库的起始量要求。目前主要应用的实施方案分为多重置换扩增(MDA)、单引物等温扩增(SPIA)、MALBAC三大类(Dean,F.B.等人，“Comprehensive human genome amplification usingmultiple displacement amplification,”Proc Natl Acad Sci USA,99:5261-6,2002；Kurn N等人，Novel isothermal,linear nucleic acid amplification systems forhighly multiplexed applications,Clin Chem,51(10):1973-81,2005；Zong,C等人，“Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of asingle human cell,”Science,338:1622-6,2012)。考虑到一个人细胞基因组DNA大约为3.5pg，MDA和MALBAC都已实现对单细胞基因组DNA扩增，而SPIA需要的最低起始量为1ng(约300个人细胞)。

但这些单细胞测序技术都有着共同的局限性，主要体现在两点：(1)要求较长的DNA连续片段；(2)对污染DNA极端敏感。而这两点往往在实际应用中难以保证。实际医学应用中从冰冻切片、石蜡包埋切片中提取的DNA往往已被打断，法医应用中从高度腐烂尸体中提取的DNA也早已降解成小片段(根据保存条件的不同，可降解成20～500bp小片段)，因而难以使用全基因组扩增方案。同时，提取出的DNA样本中往往混有数量可观的微生物DNA的污染，在操作时也极易被环境中的微生物所污染，若使用全基因组扩增方案，优先扩增的将是污染的微生物DNA，致使最后测序结果中绝大部分序列都是污染的微生物DNA。

此外，超微量建库方法还常常遇到的挑战是DNA的提取。在传统的DNA提取方案中(包括基于酚-氯仿体系的提取方案和基于硅吸附的提取方案)，均使用乙醇或其类似物对DNA进行洗涤和沉淀，而DNA微溶于乙醇及其类似物。当DNA量极微的时候，DNA可能全部溶于乙醇而损失。若加入糖原等物质帮助沉淀，糖原会一同沉淀下来，可能干扰一些后续反应；若加入carrier DNA(如在人的微量DNA样品中加入大量细菌、酵母等DNA)帮助沉淀，会人为引入污染，虽然对普通单基因PCR实验没有影响，但会严重影响高通量测序的结果，致使最后测序结果中绝大部分序列都是carrier DNA。

综上所述，本领域中存在对于能够有效提取极微量DNA、高度降解的DNA和/或被污染的DNA的方法的需要。

发明内容

鉴于上述问题，提出了本发明，以便提供一种提取DNA的方法，以克服上述问题或者至少部分地解决上述问题。

在第一方面，本发明提供一种DNA提取方法，所述方法包括在有待提取DNA的生物样品中加入环状DNA。

在第二方面，本发明提供一种DNA文库构建方法，所述方法包括采用第一方面所述的方法进行DNA提取。

本发明的DNA文库构建方法可以包括：

(1)在所述生物样品中加入环状DNA；

(2)提取所述生物样品中的DNA；

(3)将所提取的DNA与接头序列连接，之后进行PCR扩增；和

(4)通过凝胶电泳分离扩增后的DNA片段，完成文库构建。

本发明的DNA文库构建方法还可以包括：

步骤(2)和步骤(3)之间进行步骤(2’)：对所述DNA进行末端修复。

在本发明的DNA提取方法或DNA文库构建方法中，所述生物样品可以为其中DNA高度降解和/或被污染的样品和/或微量样品。

在本发明的DNA提取方法或DNA文库构建方法中，所述生物样品可以包含已降解至30-40bp的DNA片段。

在本发明的DNA提取方法或DNA文库构建方法中，其中所述环状DNA的长度可以大于所述生物样品中最长DNA片段的长度至少500bp-20kb和/或所述环状DNA的长度可以小于所述生物样品中最短DNA片段的长度至少500bp-1000bp。。

在本发明的DNA提取方法或DNA文库构建方法中，所述环状DNA可以为细菌质粒DNA，优选地可以为高纯度的细菌质粒DNA。

在本发明的DNA提取方法或DNA文库构建方法中，所述细菌环状质粒DNA可以通过柱式质粒提取试剂盒提取。

在本发明的DNA提取方法或DNA文库构建方法中，所述生物样品可以为动物生物样品、微生物生物样品或植物生物样品。

在第三方面，本发明提供了一种高通量测序方法，所述方法采用第二方面所述的方法进行DNA文库构建。

在本发明的方法中，适合的环状DNA与所构建的目标DNA文库乃至后续测序步骤中所使用的测序仪有关，可根据需要选用不同大小的环状DNA，只要所述环状DNA与所构建的目标DNA文库能够有效分离即可。例如，Illumina和ion torrent测序仪只能测较短的DNA文库(50～1000nt)，于是适合的环状DNA大小一般应在1.5kb以上，而PacBio和MinION测序仪主要测序较长的DNA文库(3kb～30kb)，因此适合的环状DNA大小一般应在2.5kb以下或40kb以上。最常见、也最容易制备的高质量环状DNA是细菌的质粒，其大小通常为1.5kb～9kb。也可用线粒体基因组(约17kb)和细菌基因组(一般1～10Mb)。

本发明的有益效果在于：

(1)可有效提取微量、已降解成小片段的DNA，从而使得之后DNA建库和测序能够顺利进行，最终获取其序列信息。

(2)即使样品中混有大量微生物(或其他异种生物)基因组污染，也可不受干扰地进行建库和测序，这对处理一些已受污染的样品(如病人血液、法医应用中埋藏于野外的高度腐烂的尸体等)特别有用。

(3)可极大降低对实验环境洁净度和操作人员熟练程度的要求。即便实验环境中存在其他生物污染(如空气中漂浮的细菌、真菌孢子、植物花粉等)，待测微量DNA也可不受影响地建库和测序。

附图说明

通过以下参照附图对本发明实施例的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优点将更为清楚，在附图中：

图1显示超微量的、DNA已降解成30-40bp的人细胞基因组DNA样品进行建库的结果。图1A中所用凝胶电泳为2.5％琼脂糖凝胶电泳，图1B中所用凝胶电泳为12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(高分辨率解析小片段核酸)，在图1A和B中泳道1-4分别为1ng,100pg,10pg,3pg已降解的人细胞基因组DNA根据本发明的方法进行DNA提取和建库的结果。*(星号)标明所加入的环状质粒DNA，黑色三角形标明接头二聚体所在位置，黑色箭头标明待测DNA片段连接接头后(即有效测序文库)的位置；泳道5和6分别是对比例1和2中建库的结果；M1和M2分别为两种DNA分子量标准品。

图2显示对本发明方法耐受微生物污染的评估。1ng已降解成30-40bp的人细胞基因组DNA按照本发明方法进行DNA提取和建库，泳道1是没有微生物DNA污染的样品进行建库的结果，泳道2是加入10μg大肠杆菌基因组DNA污染后进行建库的结果，星号、黑色三角形、黑色箭头的含义同图1。

具体实施方式

本发明采用加入环状DNA的方法帮助提取超微量、已降解成小片段的目标DNA，并使用直接建库的方法进行DNA建库，其中环状DNA的长度需与待测已降解的DNA片段的长度有明显区别。

优选地，加入的环状DNA为高纯度的细菌质粒DNA。更优选地，制备细菌环状质粒DNA时应使用柱式质粒提取试剂盒，因其提取出的质粒DNA可基本维持环状而不断开成线形。柱式质粒提取试剂盒在场上已有很多成熟完善的产品可供选择，例如天根(Tiangen)公司的质粒小量提取试剂盒(DP103)。

从细胞、组织等样品中提取DNA的技术及所使用的试剂是本领域的常规技术，并且目前市场上有很多成熟完善的商品化试剂或试剂盒可供选择，例如天根(Tiangen)公司的组织DNA提取试剂盒(DP318)。须注意的是，根据样品来源不同，需选用合适的DNA提取方法和试剂盒，例如对于植物样品或被植物侵袭的动物组织样本，需选用可应对多糖多酚的DNA提取试剂盒，例如天根(Tiangen)公司的植物DNA提取试剂盒(DP305)。

本文中所使用的术语“高通量测序”和“新一代测序”可以互换使用，高通量测序技术的原理是本领域普通技术人员公知的，高通量测序通常是在微孔芯片上进行的，高通量测序技术及其所使用的试剂和装置是本领域的常规技术。目前商业化的高通量测序的仪器、芯片和反应试剂容易购得，且可根据所测片段的长短选用合适的测序平台。例如短片段测序(<300bp)可使用Illumina测序仪，中等长度片段测序(～500bp)可使用LifeTechnologies公司的ion torrent系列测序仪，长片段测序(1000～5000bp)可使用PacificBioscience公司的第三代单分子测序仪。本领域技术人员应当知道，提取的DNA在进行高通量测序之前需要经过预处理过程，例如末端修复、连接接头和标签、纯化等步骤来建库，这些技术以及其中所需要的试剂对于掌握高通量测序的普通技术人员而言是容易理解的，例如可以使用NEBNext Fast DNA Fragmentation&Library Prep Set for Ion Torrent(Life Technologies公司目录号4474180)试剂盒针对ion torrent测序仪进行建库。本领域技术人员应当知道，针对不同型号的测序仪，需选用合适的建库试剂盒(其中包含与测序仪匹配的接头序列、酶、缓冲液等)。

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，基于以下实施例结合附图对本发明进行详细说明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种化学试剂和生物制剂，均为市售产品。

实施例1：检测高度降解的人细胞DNA

(1)用人坏死细胞作为生物样品，事先确认其DNA已高度降解为约30-40bp的短片段。分别取四份样品，其分别含有相当于300个细胞、30个细胞、3个细胞和1个细胞的DNA量，每份样品中分别含有1ng、100pg、10pg、3pg的目标DNA。

(2)在每份样品中加入1μg pTRE-Tight环状质粒(购自Clontech公司)。

立即使用Magen组织DNA小量提取试剂盒(D3121)提取总DNA。

(3)不对DNA进行片段化，而是直接使用NEBNext○R Ultra DNA Library PrepKit for Illumina(E7370)试剂盒对提取出的总DNA进行建库流程(包括末端修复、连接接头、PCR反应)。

(4)将建库结果用2.5％的琼脂糖凝胶电泳或12％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，SybrGreen I染料染色，在紫外分析仪上照相检测。结果如图1所示(泳道1～4)。

图1中，黑色箭头所示的位置为预期的测序文库，即待测人DNA片段(30-40bp)两端连有测序接头。黑色三角所示位置为接头自连产物，这部分无法测到待测片段。星号所示为环状质粒DNA。

如泳道1～4所显示，1ng和100pg起始量(即相当于300个和30个人细胞的DNA总量)都可以得到预期的测序文库，这比使用NEBNext○R Ultra DNA Library Prep Kit forIllumina(E7370)试剂盒建库原本的DNA起始量下限5ng低50倍。测序文库可以切胶回收。由于环状质粒DNA没有可用的5’和3’端，因而无法参与连接反应，不会对建库造成任何影响，又因其大小(～2000bp)与测序文库大小(～160bp)相差甚远，因此也不会影响测序文库的切胶回收。

对比例1：不加入环状DNA，直接进行建库。

采用与相当于300个人细胞DNA总量(1ng)的人坏死细胞(与实施例1中所用的人坏死细胞来源相同)，不加入环状质粒DNA，而是加入5μg糖原，之后继续进行实施例1中的(3)～(5)步骤。结果见图1(泳道5)

图1泳道5未显示任何预期文库条带，说明建库失败，无法测序。造成这一结果的主要原因是微量DNA在乙醇漂洗过程中微溶于水而损失殆尽。这说明加入环状DNA是有效提取微量DNA片段的方法，明显优于糖原。

对比例2：不加入环状DNA，使用传统的全基因组扩增方法进行扩增后建库。

(1)取1ng已降解到30-40bp的人DNA(已纯化的DNA片段，不是坏死细胞，以排除提取时造成的损失)。

(2)使用Qiagen REPLI-g Single Cell Kit(货号150343)进行全基因组扩增(MDA法)。

(3)对扩增产物进行建库和检测，步骤同实施例1的(4)(5)。结果见图1(泳道6)。

图1泳道6未显示任何预期文库条带，说明建库失败，无法测序。造成这一结果的主要原因是传统的全基因组扩增方法需要较长的连续DNA片段作为模板，而高度降解的DNA无法进行全基因组扩增。亦即，全基因组扩增方案无法扩增已高度降解的DNA片段。

实施例2：有严重微生物污染的情况下检测高度降解的人细胞DNA

取相当于300个人细胞DNA总量(1ng)的人坏死细胞作为检测目标，加入10μg的大肠杆菌基因组DNA，作为微生物DNA污染。污染DNA量为目标DNA量的一万倍。之后继续进行实施例1中的(2)～(5)步骤。结果见图2。图2中泳道1是起始DNA量为1ng的无微生物污染的建库结果，泳道2是起始DNA量为1ng的有严重微生物污染的建库结果。

两者对比，预期的测序文库条带基本无区别，说明本发明方法能有效地排除严重的微生物DNA干扰而检测微量的目标DNA。造成这种效果的原因是微生物DNA本身片段巨大(一般细菌基因组长达数百万碱基，即便在提取过程中因剪切力造成偶然断裂，其片段也长达20kb以上)，导致在建库最后一步PCR过程中由于片段过长、PCR延伸时间短而无法被扩增，因而不影响目标DNA测序文库的PCR。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种改动和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (15)

1.一种DNA提取方法，所述方法包括在有待提取DNA的生物样品中加入环状DNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物样品为其中DNA被高度降解的样品和/或被污染的样品和/或微量样品。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物样品中的DNA片段包括已降解至30-40bp的DNA片段。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述环状DNA的长度比所述生物样品中最长DNA片段的长度大500bp-20kbp和/或所述环状DNA的长度比所述生物样品中最短DNA片段的长度小500bp-1000bp。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述环状DNA为细菌环状质粒DNA。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述细菌环状质粒DNA通过柱式质粒提取试剂盒提取。

7.一种DNA文库构建方法，所述方法包括：

(1)在有待提取DNA的生物样品中加入环状DNA；

(2)提取所述生物样品中的DNA片段；

(3)将所提取的DNA片段与接头序列连接，之后进行PCR扩增；和

(4)通过凝胶电泳分离扩增后的DNA片段，完成文库构建。

8.如权利要求7所述的方法，所述方法还包括：

步骤(2)和步骤(3)之间进行步骤(2’)：对所述DNA片段进行末端修复。

9.如权利要求7所述的方法，其中所述生物样品为其中DNA被高度降解的样品和/或被污染的样品和/或微量样品。

10.如权利要求7所述的方法，其中所述生物样品中的DNA片段包括已降解至30-40bp的DNA片段。

11.如权利要求7所述的方法，其中所述环状DNA的长度比所述生物样品中最长DNA片段的长度大500bp-20kbp和/或所述环状DNA的长度比所述生物样品中最短DNA片段的长度小500bp-1000bp。

12.如权利要求7所述的方法，其中所述环状DNA为细菌环状质粒DNA。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述细菌环状质粒DNA通过柱式质粒提取试剂盒提取。

14.如权利要求7所述的方法，其中所述生物样品为动物生物样品、微生物生物样品或植物生物样品。

15.一种高通量测序方法，其采用如权利要求7-14中任一项所述的方法进行DNA文库构建。