CN113008647A - 一种atp酶组织化学染色方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种ATP酶组织化学染色方法，其包括如下步骤：(1)取材与冷冻切片；(2)试剂配制：配制预孵育液、增强洗液、孵育液、氯化钴溶液及硫化铵溶液，备用；(3)染色处理：室温下将切片置于预孵育液中处理3‑5min,处理完后取出切片并置入增强洗液中洗15‑30s,随后将切片浸入孵育液中37℃处理25‑30min，再将切片浸入氯化钴溶液中处理3‑5min,取出后水洗，随后将切片浸入硫化铵溶液中处理20‑30s,流水冲洗，然后脱水封片。优点为，各试剂配制简单、成份明确，染色处理时使用了前孵育液和增强洗液，其中前孵育液和增强洗液中首次引入了巴比妥钠成份，孵育液中首次引入了Dtt成分，适用性好，对不同部位的肌肉组织均能收获较好的染色效果。
Description
技术领域
本发明属于生物组织化学染色领域，具体涉及一种ATP酶组织化学染色方法。
背景技术
在肌纤维形态学分型研究和肌肉疾病病理诊断上，采用新鲜肌肉标本进行经典ATP酶组织化学染色非常重要。ATP酶组织化学主要原理是钙激活法，当新鲜肌肉组织中的三磷酸腺苷水解为二磷酸腺苷和磷酸，磷酸能够与钙离子结合，在酶活性处形成无色的磷酸钙，磷酸钙经氯化钴处理，会形成磷酸钴，再经硫化铵处理便形成棕黑色的硫化钴沉淀在酶活性部位。采用新鲜肌肉组织做相关病理学检查，因为组织本身时效要求严格，但在肌肉各种特殊染色实验操作中的步骤繁复且需时较长，所以实验者们一直在临床运用中不断的改进和完善。现有的ATP酶组织化学染色方法存在取材切片处理不规范、预孵育液适用性不好等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种ATP酶组织化学染色方法，旨在至少一定程度的克服现有技术中存在的上述问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种ATP酶组织化学染色方法，其包括如下步骤：
(1)取材与冷冻切片：麻醉完成后，偏离麻醉剂注射的位置确定为肌肉取材部位，刀片划开皮肤及目标肌肉，用带齿镊子夹住划开位置，使用刀片切下10mm×5mm×5mm的肌肉块，并转移至用生理盐水湿润过的纱布上，将装有异戊烷的离心管置于液氮中预冷至底部结霜，将切下的肌肉块用镊子夹起后浸入预冷好的异戊烷中，匀速顺时针旋转40-60次，再将其迅速置于封口袋中并置于液氮中保存，使用冷冻切片机对冷冻的肌肉块进行切片；
(2)试剂配制：配制预孵育液、增强洗液、孵育液、氯化钴溶液及硫化铵溶液，备用；
(3)染色处理：室温下将切片置于预孵育液中处理3-5min,处理完后取出切片并置入增强洗液中洗15-30s,随后将切片浸入孵育液中37℃处理25-30min，再将切片浸入氯化钴溶液中处理3-5min,取出后先用自来水冲洗数次，再用双蒸水洗4次，随后将切片浸入硫化铵溶液中处理20-30s,流水冲洗，然后脱水封片。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以有如下进一步的具体选择。
具体的，步骤(1)中切片的厚度为5-10μm。
具体的，步骤(2)中的预制孵育液由如下原料混合而成：5mL预配液、8mL双蒸水及10mL 0.1M盐酸；其中预配液的组成为：乙酸钠1.94g、巴比妥钠2.94g、双蒸水100mL。
具体的，步骤(2)中的增强洗液的组成为：巴比妥钠0.4124g、氯化钙0.1998g、双蒸水100mL。
具体的，步骤(2)中的孵育液的组成为：ATP 10mg、氯化钙缓冲液20mL、1mM Dtt水溶液100μ；其中氯化钙缓冲液的成份为：甘氨酸缓冲液15mL，1M氯化钙水溶液3mL，0.1M氢氧化钠水溶液7.8mL。甘氨酸缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH在8.6-10.6之间，其由甘氨酸、去离子水组成，经氢氧化钠调节pH值制成。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的ATP酶组织化学染色方法使用的各试剂配制简单、成份明确，染色处理时使用了前孵育液和增强洗液，其中前孵育液和增强洗液中首次引入了巴比妥钠成份，孵育液中首次引入了Dtt成分，综合而言，适用性较好，对不同部位的肌肉组织均能收获较好的染色效果且不用区分使用酸碱性前孵育液，操作更简便。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
为免赘述，以下实施例中用到的方法若无特别说明则均为常规方法，用到的药品若无特别说明则均为市售产品。
实施例
一种ATP酶组织化学染色方法，其包括如下步骤：
(1)取材与冷冻切片：麻醉完成后，偏离麻醉剂注射的位置确定为肌肉取材部位，刀片划开皮肤及目标肌肉，用带齿镊子夹住划开位置，使用刀片切下10mm×5mm×5mm的肌肉块，并转移至用生理盐水湿润过的纱布上，将装有异戊烷的离心管置于液氮中预冷至底部结霜，将切下的肌肉块用镊子夹起后浸入预冷好的异戊烷中，匀速顺时针旋转40-60次，再将其迅速置于封口袋中并置于液氮中保存，使用冷冻切片机对冷冻的肌肉块进行切片,切片厚度为5-10μm；
(2)试剂配制：配制预孵育液、增强洗液、孵育液、氯化钴溶液及硫化铵溶液，备用；预制孵育液由如下原料混合而成：5mL预配液、8mL双蒸水及10mL 0.1M盐酸；其中预配液的组成为：乙酸钠1.94g、巴比妥钠2.94g、双蒸水100mL；增强洗液的组成为：巴比妥钠0.4124g、氯化钙0.1998g、双蒸水100mL；孵育液的组成为：ATP 10mg、氯化钙缓冲液20mL、1mM Dtt水溶液100μ；其中氯化钙缓冲液的成份为：甘氨酸缓冲液15mL，1M氯化钙水溶液3mL，0.1M氢氧化钠水溶液7.8mL。
(3)染色处理：室温下将切片置于预孵育液中处理3-5min,处理完后取出切片并置入增强洗液中洗15-30s,随后将切片浸入孵育液中37℃处理25-30min，再将切片浸入氯化钴溶液中处理3-5min,取出后先用自来水冲洗数次，再用双蒸水洗4次，随后将切片浸入硫化铵溶液中处理20-30s,流水冲洗，然后脱水封片。氯化钴溶液的浓度为2％，配制时由5mg氯化钴与250mL双蒸水混合而成；硫化铵，配制时由600μL和30mL水混合而成。
需要说明的是，上述实施例中的增强洗液可室温保存6个月，超过该时限则不能使用，需要重新配制；预配液需要在4℃下保存，一周更换一次；孵育液和氯化钙缓冲液均要现配现用。
使用实施例1的方法步骤，对成年竹鼠的四肢肌肉、背部肌肉、胸腹部肌肉及心肌等分别进行ATP酶组织化学染色，染色后观察，发现均能够收获较满意的染色效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种ATP酶组织化学染色方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取材与冷冻切片：麻醉完成后，偏离麻醉剂注射的位置确定为肌肉取材部位，刀片划开皮肤及目标肌肉，用带齿镊子夹住划开位置，使用刀片切下10mm×5mm×5mm的肌肉块，并转移至用生理盐水湿润过的纱布上，将装有异戊烷的离心管置于液氮中预冷至底部结霜，将切下的肌肉块用镊子夹起后浸入预冷好的异戊烷中，匀速顺时针旋转40-60次，再将其迅速置于封口袋中并置于液氮中保存，使用冷冻切片机对冷冻的肌肉块进行切片；
(2)试剂配制：配制预孵育液、增强洗液、孵育液、氯化钴溶液及硫化铵溶液，备用；
(3)染色处理：室温下将切片置于预孵育液中处理3-5min,处理完后取出切片并置入增强洗液中洗15-30s,随后将切片浸入孵育液中37℃处理25-30min，再将切片浸入氯化钴溶液中处理3-5min,取出后先用自来水冲洗数次，再用双蒸水洗4次，随后将切片浸入硫化铵溶液中处理20-30s,流水冲洗，然后脱水封片。
2.根据权利要求1所述的一种ATP酶组织化学染色方法，其特征在于，步骤(1)中切片的厚度为5-10μm。
3.根据权利要求1所述的一种ATP酶组织化学染色方法，其特征在于，步骤(2)中的预制孵育液由如下原料混合而成：5mL预配液、8mL双蒸水及10mL 0.1M盐酸；其中预配液的组成为：乙酸钠1.94g、巴比妥钠2.94g、双蒸水100mL。
4.根据权利要求1所述的一种ATP酶组织化学染色方法，其特征在于，步骤(2)中的增强洗液的组成为：巴比妥钠0.4124g、氯化钙0.1998g、双蒸水100mL。
5.根据权利要求1至4任一项所述的一种ATP酶组织化学染色方法，其特征在于，步骤(2)中的孵育液的组成为：ATP 10mg、氯化钙缓冲液20mL、1mM Dtt水溶液100μ；其中氯化钙缓冲液的成份为：甘氨酸缓冲液15mL，1M氯化钙水溶液3mL，0.1M氢氧化钠水溶液7.8mL。
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