CN112051342A - 一种代谢物蛋白互作检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于代谢物蛋白互作检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种代谢物蛋白互作检测方法。本发明提供一种代谢物蛋白互作检测方法，包括以下步骤：(1)总蛋白的提取：从样品中取10～40ug总蛋白，进行SDS‑PAGE电泳；(2)代谢物与蛋白的孵育：固定代谢小分子与总蛋白共同孵育为实验组；以总蛋白孵育为对照组，将两组分别进行孵育；(3)蛋白的酶解：将孵育后的实验组和对照组样本进行还原、烷基化以及胰酶酶解处理；(4)肽段收集和检测：利用C18 column分别收集实验组和对照组的肽段，利用液相色谱‑质谱联用仪对肽段进行检测分析。

Description

一种代谢物蛋白互作检测方法
技术领域
本发明涉及代谢物蛋白互作检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种代谢物蛋白互作检测方法。
背景技术
内源性代谢物小分子是胞内分子化合物的主要成分，并且各种代谢物分子在胞内浓度分布上具有较大差异。其所涉及的与多种多样的蛋白质的相互作用(无论是通过以产物/底物的形式参与酶促反应过程，或是以变构辅因子/配体的形式变构调控蛋白质)，已被证明可以控制生化反应中的物质能量代谢并且能通过信号传导来调节整个生理过程。因此，解析阐述生理条件下的代谢物-蛋白质相互作用能够揭示隐藏在疾病/健康状态下的分子理论基础，对于人类健康与医药发展至关重要。此外，疾病相关蛋白质的代谢调节剂还可能为潜在的治疗干预措施提供新的策略。
尽管研究者们已经发现了数量可观的代谢物-蛋白质相互作用，但基于代谢体系的复杂性以及缺乏有效的表征手段，只有其中的一小部分所涉及的相互作用网络被研究透彻。常见的用以表征代谢物-蛋白质相互作用的研究手段包括荧光光谱法、表面等离子体共振、等温滴定量热法、核磁共振法等，但大多数这样的研究手段均需要在分析之前对蛋白质/配体进行标记、蛋白质固载或者其他额外的操作，故而可能产生假阳性的代谢物-蛋白质互作研究结果。随着质谱技术的发展，高分辨质谱逐渐成为了代谢物-蛋白质相互作用的新型研究平台。Saghatelian等在体外异源表达了靶标蛋白，利用代谢组学的手段筛选了与该蛋白可能具有相互作用的代谢物，但存在材料吸附过程中产生非特异性吸附从而引入假阳性结果的可能。
发明内容
为了精确检测英托利匹特中抗氧剂BHT的含量，本发明提供了一种代谢物蛋白互作检测方法，包括以下步骤：
(1)总蛋白的提取：从样品中取10～40mg总蛋白，进行SDS-PAGE电泳；
(2)代谢物与蛋白的孵育：固定代谢小分子与总蛋白共同孵育为实验组；以总蛋白孵育为对照组，将两组分别进行孵育；
(3)蛋白的酶解：将孵育后的实验组和对照组样本进行还原、烷基化以及胰酶酶解处理；
(4)肽段收集和检测：利用C18 column分别收集实验组和对照组的肽段，利用液相色谱-质谱联用仪对肽段进行检测分析。
从样品中取100～1000mg总蛋白，这里蛋白的质量按照预先知晓的浓度计算得到，本领域常规采用BCA蛋白定量方法对样品进行总蛋白检测得到总蛋白浓度，通过换算后得到总蛋白质量进行SDS-PAGE电泳。
作为一种优选的技术方案，所述SDS-PAGE电泳过程为：向提取的总蛋白中取出10～40ug总蛋白样本，向其中加入1～10*loading Buffer，金属浴90～100℃变性5～20min，进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，电泳结束观察蛋白完整性。
作为一种更优选的技术方案，所述SDS-PAGE电泳过程为：向提取的总蛋白中取出20ug总蛋白样本，向其中5*loading Buffer，金属浴95℃变性10min，进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，电泳结束观察蛋白完整性；其中，Buffer：250mM Tris-HCl pH6.8；10％(w/v)SDS；0.5％(w/v)溴酚兰；50％(v/v)甘油；5％(w/v)β-巯基乙醇。
作为一种优选的技术方案，所述代谢小分子为ATP。
作为一种优选的技术方案，所述实验组中代谢小分子的加入量为：每1ug总蛋白加入0.33nmol代谢小分子。
作为一种优选的技术方案，对上述实验组和对照组均加入溶剂进行溶解后得到实验组待孵育样本和对照组待孵育样本，溶剂选自水、乙醇、乙酸乙酯、甲苯、四氢呋喃中的一种或多种；更优选为乙醇和水的混合物，混合比例可依据总蛋白的溶解程度来定，通常为乙醇和水体积比为2：1的混合；以1ug总蛋白的质量计，溶剂的加入量优选为1～10μl，更优选1～5μl；最优选为3μl。
作为一种优选的技术方案，所述孵育过程为：将待孵育样本转移至25℃水浴中，按照1:100(wt：wt)添加PK，25℃孵育5min后，转移样本至大于95℃的沸水中使PK完全灭活，在室温下冷却样本5min，加入100μl的2％脱氧胆酸钠(PH8.5)，200mM的碳酸氢铵。(备注：提取的总蛋白进行BCA蛋白定量后稀释蛋白浓度为1mg/mL，后续每支100ug的总蛋白体积为100μl)
作为一种更优选的技术方案，所述孵育过程为：将待孵育样本转移至25℃水浴中，按照1:100(wt：wt)添加PK，25℃孵育5min后，转移样本至大于95℃的沸水中使PK完全灭活，在室温下冷却样本5min，加入100μl的2％脱氧胆酸钠(H8.5)，200mM的碳酸氢铵。
作为一种优选的技术方案，孵育后的实验组和对照组通过蛋白质酶解过程产生小的肽段；在酶解之前首先将孵育后的实验组和对照组进行还原、烷基化处理。
作为一种优选的技术方案，所述孵育后的实验组和对照组分别进行还原处理，还原剂包括但不限于二硫苏糖醇、TCEP-2-甲酰乙基、2-巯基乙醇，此类还原剂可以在相对宽的浓度范围内存在，通常较好的使用浓度为1-15mM，更好的为1-12.5mM，尤其更好的为10mM。
其中作为还原剂，更优选二硫苏糖醇，二硫苏糖醇可用于将蛋白中的-SH基保持在还原态，此外二硫苏糖醇的加入，尤其是在脱氧胆酸钠和碳酸氢铵的缓冲溶液加入后进行添加，可有效还原蛋白半胱氨酸残基形成的分子内或分子间二硫键。
还原过程可以采用任何适合的方式，还原过程的反应温度通常可以是25～45℃，不排除在为获取较高的反应活性的情况下适当提高反应温度，但通常更适合本发明的反应温度可以为30～40℃，较好的反应温度为37℃。反应时间可根据反应程度进行调控。例如还原过程可以是：对实验组和对照组的样本分别加入二硫苏糖醇(浓度10mM)，并保持在37℃孵育30min。
作为一种优选的技术方案，在还原处理后，对实验组和对照组的样本分别进行烷基化处理，烷基化试剂包括但不限于碘乙酰胺、碘乙酸、B-丙内酯，此类烷基化试剂可以在相对宽的浓度范围内存在，通常较好的使用浓度为10-55mM，更好的为10-50mM，尤其更好的为40mM。
其中作为烷基化试剂，更优选碘乙酰胺，在二硫苏糖醇处理后的蛋白质由于存在大量的半胱氨酸和组氨酸，且存在的大量被二硫苏糖醇断开的巯基，而碘乙酰胺能将其修饰后防止游离的巯基再生成二硫键，导致标记效率不一致。
烷基化过程可以采用任何适合的方式，烷基化过程的反应温度通常可以是10～45℃，不排除在为获取较高的反应活性的情况下适当提高反应温度，但通常更适合本发明的反应温度可以为10～38℃，较好的反应温度为25℃。反应时间可根据反应程度进行调控。例如还原过程可以是：对已经过还原的实验组和对照组的样本分别加入碘乙酰胺(浓度40mM)，并保持在25℃孵育45min。
实验组和对照组样本在经过还原、烷基化处理后进行酶解处理，酶的种类可以是本领域常规使用的任一种酶，具体而言包括但不限于胰酶(测序级)；酶处理温度可以是25～45℃，较佳的是37℃；具体处理步骤例如可以是：将实验组和对照组分别按照1:50加入胰酶(wt：wt)，在水浴锅37℃过夜。
作为一种优选的技术方案，在(3)蛋白的酶解步骤之后，(4)肽段收集和检测之前还包括后处理步骤，即将孵育后的实验组和对照组样本进行还原、烷基化以及胰酶酶解处理后，进行后处理。
作为一种优选的技术方案，所述后处理步骤为：在酶解后的样本中加酸至PH值小于3，室温离心然后转移上清液到新的EP管中，再用酸洗涤下层悬浊液，离心收集上清液，重复洗涤离心步骤2～3次后混合上清液。
酸可以是有机酸，也可以是无机酸；有机酸包括但不限于：甲酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、乙酰乙酸、β-羟基丁酸、乳酸、丙酮酸、α-酮酸、乙酸、和挥发性脂肪酸。无机酸包括但不限于硫酸、盐酸、硝酸、氢氟酸、磷酸、三氟乙酸。优选地，酸为三氟乙酸、甲酸，三氟乙酸更优选为50％的三氟乙酸。50％的三氟乙酸可形成酸性环境，使在孵育过程中加入的脱氧胆酸钠形成白色沉淀。
作为一种优选的技术方案，利用C18 column分别收集实验组和对照组的肽段，其中，C18 column使用前需要用ACN洗涤，A液平衡两次；收集过程为：加入后处理得到的肽段上清液至C18 column中，采用B液洗脱肽段至新的EP管中，室温静置真空45℃挥发溶剂。其中，所述A液或B液选自水、乙腈、二甲基亚砜、二氯甲烷中的任一种以及0.1～0.3％v/v的缓冲液的混合。
作为一种优选的技术方案，所述液相色谱柱为C18类型的纳升级肽段分析柱。
作为一种优选的技术方案，所述样品母液和溶剂的体积比为1：(80-120)。
作为一种优选的技术方案，所述液相色谱洗脱剂由A液和B液组成，所述A液或B液选自水、乙腈、二甲基亚砜、二氯甲烷中的任一种以及0.1～0.3％v/v的缓冲液的混合。
作为一种优选的技术方案，所述缓冲液选自柠檬酸、甲酸、磷酸中的一种或多种。
作为一种优选的技术方案，所述液相色谱按照梯度程序洗脱，为2～5％B液洗脱110min，再以20～40％B液洗脱5min，再以70～90％B液洗脱0.1min，之后以5％B液洗脱至4.9min结束，总用时120min。
作为一种优选的技术方案，所述质谱采用正离子模式，一级扫描范围为350～1600Da，二级扫描范围依赖于一级母离子质荷比自动选择。
作为一种优选的技术方案，所述定性定量分析中固定修饰选择Carbamidomethyl(C)。
作为一种优选的技术方案，所述定性定量分析中可变修饰选择Oxidation(M)。
作为一种优选的技术方案，所述肽段假阳性率FDR<1％。
本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明的方法可以用来发生蛋白和代谢物的新的相互作用，也能发现代谢物的功能，比如代谢物他是不是会引起通路和信号传导的变化等等。此外，该技术提供了研究小分子代谢物作用机制的新方法，从新的角度阐述代谢物小分子功能，能够用来测试药物可以和哪些蛋白结合，结合在哪些位点上，这种结合过程是怎样改变蛋白的功能从而影响到蛋白的活性，以此来确定药物的作用靶标，所以该技术能促进新药的测试和开发，给制药行业的研究提供新的有效的工具。
附图说明
图1为样本1的质谱图；
图2为样本2的质谱图；
图3为样本3的质谱图；
图4为样本4的质谱图；
图5为样本5的质谱图；
图6为样本6的质谱图。
具体实施方式
为了精确检测英托利匹特中抗氧剂BHT的含量，本发明提供了一种代谢物蛋白互作检测方法，包括以下步骤：
(1)总蛋白的提取：从样品中取10～40ug总蛋白，进行SDS-PAGE电泳；
(2)代谢物与蛋白的孵育：固定代谢小分子与总蛋白共同孵育为实验组；以总蛋白孵育为对照组，将两组分别进行孵育；
(3)蛋白的酶解：将孵育后的实验组和对照组样本进行还原、烷基化以及胰酶酶解处理；
(4)肽段收集和检测：利用C18 column分别收集实验组和对照组的肽段，利用液相色谱-质谱联用仪对肽段进行检测分析。
在一些实施方式中，本发明所述检测方法通过以下详述实现：
1.仪器：EASY-nLC 1000超高压纳升级液相色谱(Thermo Scientific公司)；Orbitrap Fusion质谱仪(Thermo Scientific公司)；IKA振荡器；LX-100手掌式离心机(其林贝尔仪器)。
2.试剂：磷酸二氢钾(KH2PO4)，CNW；磷酸氢二钠(Na2HPO4)，江莱生物；蛋白酶K(PK)，生工生物A100706；Sodium deoxycholate(脱氧胆酸钠)，生工生物A100613；Iodoacetamide(碘乙酰胺)SIGMA SLBQ719V；Acetonitrile(ACN)，CNW4.000308.4000；Trypsin，PROMEGA V542A；Ammonium bicarbonate(碳酸氢铵)，生工生物A610032；DL-Dithiothreitol(二硫苏糖醇)，生工生物A62058；Trifluoroacetic Acid(TFA)，CNW4.018443.0500；Formic acid，CNW A177-50；双蒸水为本实验室用MilliQ纯水仪制备；甲酸(Fisher Scientific)，质谱纯；乙腈(Fisher Scientific)，质谱纯；纳升级肽段分析柱，Acclaim PepMap C18，75μm×250mm(Thermo Scientific公司)。
3.总蛋白的提取：从样品中取10～40ug总蛋白，进行SDS-PAGE电泳。
从样品中取100～1000ug总蛋白，这里蛋白的质量按照预先知晓的浓度计算得到，本领域常规采用BCA蛋白定量方法对样品进行总蛋白检测得到总蛋白浓度，通过换算后得到总蛋白质量进行SDS-PAGE电泳。
在一种优选的实施方式中，所述SDS-PAGE电泳过程为：向提取的总蛋白中取出10～40ug总蛋白样本，向其中加入1～10*loading Buffer，金属浴90～100℃变性5～20min，进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，电泳结束观察蛋白完整性，以确认从样品中有提取到蛋白。
在一种优选的实施方式中，所述SDS-PAGE电泳过程为：向提取的总蛋白中取出20ug总蛋白样本，向其中5*loading Buffer，金属浴95℃变性10min，进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，电泳结束观察蛋白完整性，以确认从样品中有提取到蛋白。
4.代谢物与蛋白的孵育：固定代谢小分子与总蛋白共同孵育为实验组；以总蛋白孵育为对照组，将两组分别进行孵育。
在一种优选的实施方式中，所述代谢小分子为ATP。
在一种优选的实施方式中，所述实验组中代谢小分子的加入量为：每1ug总蛋白加入0.33nmol代谢小分子。
在一种优选的实施方式中，对上述实验组和对照组均加入溶剂进行溶解后得到实验组待孵育样本和对照组待孵育样本，溶剂选自水、乙醇、乙酸乙酯、甲苯、四氢呋喃中的一种或多种；更优选为乙醇和水的混合物，混合比例可依据总蛋白的溶解程度来定，通常为乙醇和水体积比为2：1的混合；以1μg总蛋白的质量计，溶剂的加入量优选为1～10μl，更优选1～5μl；最优选为3μl。
在一种优选的实施方式中，所述孵育过程为：将待孵育样本转移至25℃水浴中，按照1:100(wt：wt)添加PK，25℃孵育5min后，转移样本至大于95℃的沸水中使PK完全灭活，在室温下冷却样本5min，加入100μl的2％脱氧胆酸钠(pH8.5)，200mM的碳酸氢铵。
在一种更优选的实施方式中，所述孵育过程为：将待孵育样本转移至25℃水浴中，按照1:100(wt：wt)添加PK，25℃孵育5min后，转移样本至大于95℃的沸水中使PK完全灭活，在室温下冷却样本5min，加入100μl的2％脱氧胆酸钠(pH8.5)，200mM的碳酸氢铵。
5.蛋白的酶解：将孵育后的实验组和对照组样本进行还原、烷基化以及胰酶酶解处理；
在一种优选的实施方式中，孵育后的实验组和对照组通过蛋白质酶解过程产生小的肽段；在酶解之前首先将孵育后的实验组和对照组进行还原、烷基化处理。
在一种优选的实施方式中，所述孵育后的实验组和对照组分别进行还原处理，还原剂包括但不限于二硫苏糖醇、TCEP-2-甲酰乙基、2-巯基乙醇，此类还原剂可以在相对宽的浓度范围内存在，通常较好的使用浓度为1-15mM，更好的为1-12.5mM，尤其更好的为10mM。
其中作为还原剂，更优选二硫苏糖醇，二硫苏糖醇可用于将蛋白中的-SH基保持在还原态，此外发明人意外发现二硫苏糖醇的加入，尤其是在脱氧胆酸钠和碳酸氢铵的缓冲溶液加入后进行添加，可有效还原蛋白半胱氨酸残基形成的分子内或分子间二硫键，可能是脱氧胆酸钠在碳酸氢铵的存在下能更好的溶解，从而使他的疏水链和蛋白质的疏水基团相互结合，降低了蛋白之间的疏水缔合，使蛋白上的极性基团裸露在外被二硫苏糖醇所充分还原。
还原过程可以采用任何适合的方式，还原过程的反应温度通常可以是25～45℃，不排除在为获取较高的反应活性的情况下适当提高反应温度，但通常更适合本发明的反应温度可以为30～40℃，较好的反应温度为37℃。反应时间可根据反应程度进行调控。例如还原过程可以是：对实验组和对照组的样本分别加入二硫苏糖醇(浓度10mM)，并保持在37℃孵育30min。
在一种优选的实施方式中，在还原处理后，对实验组和对照组的样本分别进行烷基化处理，烷基化试剂包括但不限于碘乙酰胺、碘乙酸、B-丙内酯，此类烷基化试剂可以在相对宽的浓度范围内存在，通常较好的使用浓度为10-55mM，更好的为10-50mM，尤其更好的为40mM。
其中作为烷基化试剂，更优选碘乙酰胺，在二硫苏糖醇处理后的蛋白质由于存在大量的半胱氨酸和组氨酸，且存在的大量被二硫苏糖醇断开的巯基，而碘乙酰胺能将其修饰后防止游离的巯基再生成二硫键，导致标记效率不一致，但过量的碘乙酰胺会导致一些蛋白的修饰，比如N-末端和赖氨酸的氨甲基化，从而影响蛋白的鉴定，所以合适的碘乙酰胺的浓度对蛋白质分析影响较大，因此为获得较好的结果，优选的碘乙酰胺的浓度为40mM。
烷基化过程可以采用任何适合的方式，烷基化过程的反应温度通常可以是10～45℃，不排除在为获取较高的反应活性的情况下适当提高反应温度，但通常更适合本发明的反应温度可以为10～38℃，较好的反应温度为25℃。反应时间可根据反应程度进行调控。例如还原过程可以是：对已经过还原的实验组和对照组的样本分别加入碘乙酰胺(浓度40mM)，并保持在25℃孵育45min。
实验组和对照组样本在经过还原、烷基化处理后进行酶解处理，酶的种类可以是本领域常规使用的任一种酶，具体而言包括但不限于胰酶(测序级)；酶处理温度可以是25～45℃，较佳的是37℃；具体处理步骤例如可以是：将实验组和对照组分别按照1:50加入胰酶(wt：wt)，在水浴锅37℃过夜。
在一种优选的实施方式中，在(3)蛋白的酶解步骤之后，(4)肽段收集和检测之前还包括后处理步骤，即将孵育后的实验组和对照组样本进行还原、烷基化以及胰酶酶解处理后，进行后处理。
在一种优选的实施方式中，所述后处理步骤为：在酶解后的样本中加酸至PH值小于3，室温离心然后转移上清液到新的EP管中，再用酸洗涤下层悬浊液，离心收集上清液，重复洗涤离心步骤2～3次后混合上清液。
酸可以是有机酸，也可以是无机酸；有机酸包括但不限于：甲酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、乙酰乙酸、β-羟基丁酸、乳酸、丙酮酸、α-酮酸、乙酸、和挥发性脂肪酸。无机酸包括但不限于硫酸、盐酸、硝酸、氢氟酸、磷酸、三氟乙酸。优选地，酸为三氟乙酸，更优选为50％的三氟乙酸。
发明人在研究中发现二硫苏糖醇由于在碱性条件下形成去质子化的硫醇根阴离子时会与蛋白质上巯基作用，而且在对蛋白质一般降解用到的脱氧胆酸钠只有在碱性条件下稳定存在，因此在考虑到脱氧胆酸钠对蛋白质检测的影响，用50％的三氟乙酸中和使其沉淀，浓度过大容易是蛋白质变性，因此在后续加入甲酸处理，一方面甲酸能协调酸度，另一方面甲酸更有利于与蛋白质巯基相接的二硫苏糖醇水解，得到想要的鉴定结果。
6.肽段收集：利用C18 column分别收集实验组和对照组的肽段。
在一种优选的实施方式中，利用C18 column分别收集实验组和对照组的肽段，其中，C18 column使用前需要用ACN洗涤，A液平衡两次；收集过程为：加入后处理得到的肽段上清液至C18 column中，采用B液洗脱肽段至新的EP管中，室温静置真空45℃挥发溶剂。其中，所述A液或B液选自水、乙腈、二甲基亚砜、二氯甲烷中的任一种以及0.1～0.3％v/v的缓冲液的混合。
7.利用液相色谱-质谱联用仪对肽段进行检测分析。
离子源喷雾电压为2.4kV，Orbitrap Fusion质谱仪加热毛细管设定为320℃，采用数据依赖模式自动在MS和MS/MS间切换采集。全扫描MS使用Orbitrap进行一级扫描，扫描范围为m/z 350-1600，分辨率设定为60,000(m/z 200处)。离子最大引入时间为50ms，自动增益控制(Automatic gain control,AGC)设定为1x106，随后在3s内使用高能碰撞解离(Higher energy C-trap dissociation,HCD)对符合串级(MS/MS)碎裂条件的母离子进行碎裂并用orbitrap进行扫描，扫描分辨率设定为15,000。扫描范围根据母离子质荷比自动控制，最低扫描范围固定为m/z＝110处，最高到2000。进行MS/MS的最低离子强度值设定为50,000。MS/MS时离子最大引入时间为100ms，AGC控制设定为1.0x105，母离子选择窗口设定为1.6Da。对于2、3、4电荷数的离子进行MS/MS采集，动态排除设定为每个母离子在10s内进行1次MS/MS，之后排除30s，30％的碰撞能量。
液相色谱条件：色谱柱：类型C18，规格250mm*75mm，孔径100A，粒径2um；流速：300nL/min；样品上样2μL，运行120min。
洗脱液组成：液相色谱洗脱剂由A液和B液组成，所述A液或B液选自水、乙腈、二甲基亚砜、二氯甲烷中的任一种以及0.1～0.3％v/v的缓冲液的混合；所述缓冲液选自柠檬酸、甲酸、磷酸中的一种或多种。
在一种更优选的实施方式中，所述洗脱剂由A液和B液组成，所述A液为水和0.1％v/v的甲酸的混合；所述B液为乙腈和0.1％v/v的甲酸的混合。
梯度洗脱程序：2～5％B液洗脱110min，再以20～40％B液洗脱5min，再以70～90％B液洗脱0.1min，之后以5％B液洗脱至4.9min结束，总用时120min。
在一种更优选的实施方式中，梯度洗脱程序为5％B液洗脱110min，再以30％B液洗脱5min，再以80％B液洗脱0.1min，之后以5％B液洗脱至4.9min结束，总用时120min。
质谱条件：离子模式：正离子模式；一级扫描范围：350-1600Da；二级扫描范围：依赖于一级母离子质荷比自动选择；毛细管温度：320℃；离子源电压：2400V；碎裂模式：HCD。
本申请发明人在研究的过程中发现在上述参数设置下，通过在特定的质谱条件、洗脱程序下能够很好的将差异肽段完全区分开，从而确保了之后能更好的对差异蛋白进行筛选。
8.定性定量分析：用MaxQuant进行搜索，根据搜索结果使用iBAQ算法进行分析。
MaxQuant是基于质谱(Ms)的蛋白质组学数据分析最常用的平台之一，目前认可度相对较高，可针对多种质谱数据，将质谱产生的raw文件转换得到相应的肽段和蛋白情况，从而进行下一步分析研究。
定性参数设置：MaxQuant版本号为1.6.5.0；固定修饰选择Carbamidomethyl(C)；可变修饰选择Oxidation(M)；一级质谱精度(peptide tol)：4.5ppm；二级质谱精度(MS/MStol)：20ppm；酶解时最大允许漏切的数目(Max missed cleavages)；Enzyme：Trypsin；Database：Uniprot-SwissProt数据库(种属Homo sapiens,2019-08-09,reviewed entries20432)；数据卡值：肽段及蛋白假阳性率(FDR)≤1％；蛋白最少匹配1条独有肽段(uniquepeptides)；肽段最少包含7个氨基酸。
定量参数设置：肽段取值方法(Protein ratio Type)：中位数(median)；定量的最少的unique peptide数(Minimum peptides)：1；标准化方法(Normalisation method)：iBAQ算法；差异倍数：>1.2倍。
iBAQ算法即intensity based absolute quantification。
实施例1
实施例1提供了一种ATP与未知蛋白的互作检测方法，具体步骤为：
S01生物液体提取总蛋白
a.取30-50μl的未知生物液体；
b.通过BCA蛋白定量方法对上述液体进行总蛋白检测，得到总蛋白浓度；(备注：)
c.提取出900ug总蛋白分成6个样本，每个样本取20ug总蛋白，加入5*loadingBuffer，金属浴95℃变性10min，后续进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，观察蛋白完整性较好可进行下一步；其中，Buffer：250mM Tris-HCl pH6.8；10％(w/v)SDS；0.5％(w/v)溴酚兰；50％(v/v)甘油；5％(w/v)β-巯基乙醇。S02代谢物ATP与蛋白的孵育
a.将上述的6个样本每3份分为一组，其中1组中均加入代谢小分子(每1ug总蛋白加入0.33nmol代谢小分子)，两组样本分别使用200μl的无水乙醇与100μl的纯水进行溶解，0.22uM的滤膜进行过滤保存；
b.之后转移样本至25℃水浴；
c.按照1:100添加PK，(wt：wt，现配现用)；
d.25℃孵育5min；
e.转移样本至大于95℃的沸水中，使PK完全灭活；
f.在室温下冷却样本5min；
g.加入100μl的2％脱氧胆酸钠(pH8.5)，200mM的碳酸氢铵。
S03胰酶酶解(变性的蛋白质进行还原、烷基化、胰酶酶解)
a.首先通过加入二硫苏糖醇(二硫苏糖醇终浓度10mM)，37℃孵育30min；
b.加入碘乙酰胺(终浓度40mM)室温避光孵育45min；
c.按照1:50加入胰酶(wt：wt)，在水浴锅37℃过夜；
d.酶解终止、沉淀，通过添加50％的TFA(终浓度2％)，添加甲酸使样本的pH值小于3(pH试纸进行检测)；
e.室温16000g离心10min，小心转移上清至新的EP管，使用200μl的2％TFA试剂两次进行洗涤下层悬浊液，并且重复离心步骤，混合三次收集的上清液得到肽段。
S04肽段收集
a.500μl的ACN洗涤C18 column；
b.500μl水(含0.1％FA)平衡两次；
c.加入肽段至C18 column；
d.500μl水(含0.1％FA)洗涤两次；
e.500μl的乙腈(含0.1％FA)洗脱肽段至新的EP管，室温静置2min；
f.真空45℃挥发溶剂，使用50μl体积的0.1％FA重悬肽段(使用0.1％的FA溶液进行肽段的复溶，准备进行后续的上机检测)。
S05质谱检测
a.质谱参数如下表：
Figure BDA0002673101890000121
b.Nano LC的洗脱条件及梯度：
A液成分：水，0.1％FA；B液成分：乙腈，0.1％FA
色谱柱：类型C18，规格250mm*75mm，孔径100A，粒径2um
流速：300nL/min；6个样品各上样2μL，运行6个2h液质联用分析；
c.Nano LC液相梯度：
Time(min) B液比例
0 5％
110 30％
115 80％
115.1 5％
120 Stop
Time(min) B液比例
S05质谱扫描完毕，得到质谱信号总图，横坐标是洗脱时间，纵坐标是峰强度，如附图1～6所示。
S06 MaxQuant软件搜库定性定量
质谱原始文件(raw文件)用MaxQuant(version 1.6.5.0,)进行搜索，搜索结束后，根据搜索结果MaxQuant软件使用iBAQ算法进行定量分析。
其中，定性参数设置如下：
Figure BDA0002673101890000131
定量参数设置如下：
Figure BDA0002673101890000141
结论：利用质谱检测技术进行肽段的检测分析后发现：实验组与对照组共能鉴定出3000～5000个蛋白质，其中差异蛋白质201种(即与特定代谢物相互作用的蛋白质)，对差异表达蛋白进行层次聚类分析并以热力图进行可视化，可以帮助我们发现差异表达蛋白在实验组间差异的变化模式；还可对差异表达蛋白进行GO注释富集分析、KEGG Pathway分析、蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络分析。实现对差异基因的功能、参与的信号通路的多方面分析。通过以上分析，可以理解特定小分子代谢物通过调节哪些信号通路，进而影响细胞的功能。
比较例1
比较例1提供了一种ATP与未知蛋白的互作检测方法，具体步骤同实施例1，不同之处在于：S03胰酶酶解a步中二硫苏糖醇替换为2-巯基乙醇。
结论：二硫苏糖醇和2-巯基乙醇相比，作用相似，但DTT的刺激性气味要小很多，毒性也比2-巯基乙醇低很多，且检测结果相对更好。利用质谱检测技术进行肽段的检测分析后发现：实验组与对照组共能鉴定出3000～5000个蛋白质，其中差异蛋白质上百种187种(即与特定代谢物相互作用的蛋白质)。
比较例2
比较例2提供了一种ATP与未知蛋白的互作检测方法，具体步骤同实施例1，不同之处在于：S03胰酶酶解b步中碘乙酰胺替换为碘乙酸。
结论：利用质谱检测技术进行肽段的检测分析后发现：实验组与对照组共能鉴定出差异蛋白质191种(即与特定代谢物相互作用的蛋白质)。
比较例3
比较例3提供了一种ATP与未知蛋白的互作检测方法，具体步骤同实施例1，不同之处在于：S03胰酶酶解d步中未添加甲酸进行pH的调节。
结论：利用质谱检测技术进行肽段的检测分析后发现：实验组与对照组共能鉴定出差异蛋白质上百种198种(即与特定代谢物相互作用的蛋白质)。

Claims (10)

1.一种代谢物蛋白互作检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)总蛋白的提取：从样品中取10～40ug总蛋白，进行SDS-PAGE电泳；
(2)代谢物与蛋白的孵育：固定代谢小分子与总蛋白共同孵育为实验组；以总蛋白孵育为对照组，将两组分别进行孵育；
(3)蛋白的酶解：将孵育后的实验组和对照组样本进行还原、烷基化以及胰酶酶解处理；
(4)肽段收集和检测：利用C18 column分别收集实验组和对照组的肽段，利用液相色谱-质谱联用仪对肽段进行检测分析。
2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述液相色谱柱为C18类型的纳升级肽段分析柱。
3.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述样品母液和溶剂的体积比为1：(80-120)。
4.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述液相色谱洗脱剂由A液和B液组成，所述A液或B液选自水、乙腈、二甲基亚砜、二氯甲烷中的任一种以及0.1～0.3％v/v的缓冲液的混合。
5.根据权利要求4所述检测方法，其特征在于，所述缓冲液选自柠檬酸、甲酸、磷酸中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述检测方法，其特征在于，所述液相色谱按照梯度程序洗脱，为2～5％B液洗脱110min，再以20～40％B液洗脱5min，再以70～90％B液洗脱0.1min，之后以5％B液洗脱至4.9min结束，总用时120min。
7.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述质谱采用正离子模式，一级扫描范围为350～1600Da，二级扫描范围依赖于一级母离子质荷比自动选择。
8.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述定性定量分析中固定修饰选择Carbamidomethyl(C)。
9.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述定性定量分析中可变修饰选择Oxidation(M)。
10.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述肽段假阳性率FDR<1％。
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