CN110658270A - 一种定量分析小分子和蛋白质激酶相互作用的方法 - Google Patents

一种定量分析小分子和蛋白质激酶相互作用的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于稳定同位素标记和质谱的小分子与蛋白质激酶相互作用区域和强度的定量分析方法。对有孵育和没有孵育小分子的蛋白质激酶分别进行赖氨酸残基稳定同位素标记差异标记，等质量混合后对蛋白质激酶样品酶解并通过液质联用分析检测。通过酶解肽段稳定同位素标记的定量比值判断小分子与蛋白质激酶相互作用的具体区域和强度。该方法快速简单、稳定高效，为研究小分子与蛋白质激酶的相互作用区域和强度提供了有效手段。

Description

一种定量分析小分子和蛋白质激酶相互作用的方法
技术领域
本发明基于质谱的方法探究蛋白质激酶和小分子的相互作用，一种基于稳定同位素标记和质谱的小分子与蛋白质激酶相互作用区域和强度的定量分析方法。
背景技术
传统探究蛋白质激酶和小分子相互作用的方法主要是晶体衍射和核磁共振的方法，这些方法受到蛋白质大小、溶解度、纯度的限制，并且分析通量低。近年来，基于质谱的蛋白质激酶和小分子相互作用的分析方法具有灵敏度高、通量高、样品要求低等特点，已经成为传统分析方法的重要补充(文献：Zinn,N.；Hopf,C.；Drewes,G.；Bantscheff,M.,Massspectrometry approaches to monitor protein–drug interactions.Methods 2012,57(4),430-440.)。氢氘交换质谱根据氢氘交换速率的不同判断小分子与蛋白质激酶的结合位点，但该方法需要严格控制低温并且有“回交”现象的产生(Gallagher,E.S.；Hudgens,J.W.,Mapping Protein-Ligand Interactions with Proteolytic Fragmentation,Hydrogen/Deuterium Exchange-Mass Spectrometry.Methods Enzymol 2016,566,357-404.)。活性质谱(Native MS)能直接得到蛋白质激酶及其结合的小分子的化学计量数，但是无法得到结合位点的信息(Waterbeemd,M.；Lossl,P.；Gautier,V.；et al,Simultaneousassessment of kinetic,site-specific,and structural aspects of enzymaticprotein phosphorylation.Angew Chem Int Edit 2014,53(36),9660-4.)。限制性蛋白酶解通过蛋白质激酶与小分子结合前后限制性酶切区域和效率差异可得到相互作用位点和强度信息，但是该方法需要严格控制酶解条件(Piazza,I.；Kochanowski,K.；Cappelletti,V.；et al,A Map of Protein-Metabolite Interactions Reveals Principles ofChemical Communication.Cell 2018,172(1-2),358-372.)。此外，许多共价标记方法也被开发出来用于研究蛋白质激酶和小分子的相互作用。交联质谱可以得到空间上邻近的蛋白质的结构信息，但更多的是用于研究蛋白质之间的相互作用(Liu,F.；Rijkers,D.T.；Post,H.；Heck,A.J.,Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linkingmass spectrometry.Nat methods 2015,12(12),1179-84.)，活性分子探针靶向蛋白质的活性中心位点，但只能对结合上的位点进行分析(Backus,K.M.；Correia,B.E.；Lum,K.M.；Forli,S.；et al,Proteome-wide covalent ligand discovery in native biologicalsystems.Nature 2016,534(7608),570-4.)，根据结合小分子前后蛋白质热稳定性不同可以用于高通量筛选药物的靶向蛋白底物，但无法得到结合位点的信息(Savitski,M.M.；Reinhard,F.B.；Franken,H.；et al,Proteomics.Tracking cancer drugs in livingcells by thermal profiling of the proteome.Science 2014,346(6205),1255784.)，以上这些共价标记方法所用的共价标记试剂尺寸大、标记难，标记后会改变蛋白质的电荷状态导致蛋白质结构改变甚至活性散失。Zhou等人提出的二甲基化活性共价标记方法因为二甲基化试剂尺寸小，能对蛋白质的表面以及内部都进行结构特异性标记，并且标记上的甲基能保持赖氨酸残基的带电状态，维持蛋白活性(Zhou,Y.；Wu,Y.；Yao,M.；et al,Probing the Lysine Proximal Microenvironments within Membrane ProteinComplexes by Active Dimethyl Labeling and Mass Spectrometry.Anal Chem 2016,88(24),12060-12065.)。我们将稳定同位素二甲基化的定量方法用于研究蛋白质激酶和小分子的相互作用，这个定量分析的策略用于研究相互作用的方法迄今还未报道。
发明内容
本发明的目的在于开发一种基于稳定同位素标记和质谱的定量方法表征小分子与蛋白质激酶相互作用区域和强度。通过稳定同位素二甲基化试剂得到稳定同位素重标和轻标的比值来判断小分子与激酶相互作用的区域和强度。
本发明的技术方案为：
对孵育和未孵育小分子的蛋白质激酶分别进行赖氨酸残基稳定同位素差异标记，将等质量(按孵育前蛋白质激酶的质量)混合后对蛋白质激酶样品进行酶解并通过液质联用分析检测酶解肽段同位素比值得到小分子与蛋白质激酶的相互作用区域和作用强度。采用稳定同位素标记试剂甲醛(CH2O)、氘代甲醛(CD2O)和C13氘代甲醛(13CD2O)以及催化剂氰基硼氢化钠(NaBH3CN)和氘代氰基硼氢化钠(NaBD3CN)，对赖氨酸进行二甲基化标记。将标记后的等质量的蛋白质激酶样品混合，经过变性和酶解得到肽段混合样品，通过液质联用分析得到含有赖氨酸的酶解肽段的轻重同位素比值。当赖氨酸所在肽段同位素比值在0.8-1.2之间(包括0.8和1.2)，则该赖氨酸所处区域并未与激酶有明显相互作用；当赖氨酸所在肽段同位素的比值小于0.8，大于1.2时，则该赖氨酸所在区域与激酶有显著相互作用，并且，当比值越偏离1，相互作用的强度越强。
本发明提供但不限于下述色谱质谱条件检测稳定性同位素标记的酶解肽段的方法。
液相色谱仪：Thermo Accela 600；
色谱柱：C18填料填装的毛细管柱(75μm内径,15cm长)；
流动相：水(A)和乙腈(B)；
梯度洗脱程序：0-2min，1％B-10％B；2-92min，10％B-35％；92-95min，35％B-80％B；95-105min，80％B；105-120min，0％B；
流速：300nL/min；
进样量：10μL；
质谱仪：Thermo LTQ-Orbitrap Velos；
离子传输毛细管：250℃；
喷雾电压：1.8kV；
归一化碰撞能量：35％；
采用数据依赖模式进行采集，包含一次全扫描(m/z 350-1800)；
分辨率：60000(m/z 400)；
动态排除设置为：重复次数为1，重复容忍时间为30s，动态排除时间为120s。
本发明的有益效果为：
通过稳定同位素标记和质谱的定量方法，可以得到小分子与蛋白质激酶的作用区域和作用强度的信息。将其应用于研究Aurora A激酶和ATP竞争型小分子抑制剂VX689的相互作用，可以发现赖氨酸位点162、271和309所在区域与激酶有强烈相互作用。并且，将Aurora A激酶的氨基酸序列第309位赖氨酸突变为任意其他氨基酸，会降低抑制剂对该蛋白质激酶的抑制效率。该方法有助于研究小分子和蛋白质激酶相互作用机理，并为抑制剂的设计提供一种新的思路。
附图说明
图1是Aurora A激酶(2μM)和VX689(5μM)孵育后，各赖氨酸位点标记比值(重标/轻标)随标记时间的变化曲线。
图2是极光激酶蛋白Aurora A(2μM)和不同浓度的VX689孵育后，各赖氨酸位点标记比值(重标/轻标)随抑制剂浓度的变化曲线。
图3是野生型(WT)和突变型(K309A)极光激酶蛋白Aurora A(2μM)和不同浓度的VX689的对激酶底物Histone H3的磷酸化程度分子印迹图。
图4是根据稳定同位素标记和质谱定量的方法得到的K162位点的标记比值变化曲线和根据分子印迹方法得到的Aurora A激酶活性曲线的对比图。
图5是本发明的原理图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进一步说明，但并不局限于此。
实施例1基于稳定性同位素标记和质谱的人源极光激酶Aurora A蛋白与ATP竞争型抑制剂VX689的相互作用分析
将Aurora A激酶(终浓度2μM)溶解在50mM HEPES缓冲液中，蛋白质激酶样品分成等质量的两份，一份与抑制剂VX689(根据实验目的调整浓度)在室温下孵育20min，一份保持不变，然后在NaBH3CN(终浓度5mM)催化下，往蛋白质激酶-小分子溶液和蛋白质激酶溶液各自分别加入CD2O和CH2O(终浓度均为5mM)进行重标和轻标稳定同位素标记，反应特定时间后，加入碳酸氢铵(终浓度5mM)中止反应。然后，将轻重标记蛋白质样品混合，采用糜蛋白酶按酶：蛋白＝1：50在30℃下酶解5h。加入10％(体积分数)三氟乙酸使溶液成酸性(pH＝3)。肽段样品经C18 SPE除盐后用于液质联用分析。
为了考察了不同标记反应时间对Aurora A激酶与VX689相互作用所引起的赖氨酸标记效率的变化，VX689的终浓度为5μM，反应时间为3min，8min和15min。此外，还将AuroraA激酶与不同浓度的VX689孵育(终浓度为：0.1，0.3，0.5，0.8，1.0，2.0，5.0μM)孵育，观察定量标记比值与抑制剂浓度的关系。
将得到的质谱采集原始*.raw文件使用MaxQuant(版本1.5.3.30)进行处理，数据库是Aurora A激酶的序列文件(从网站www.uniprot.org下载)。甲硫氨酸(M)氧化和蛋白N端乙酰化作为可变修饰，糜蛋白酶chymotrypsin酶切，并设5个漏切位点。母离子的质量偏差容忍度为20ppm，碎片离子的质量偏差容忍度为0.5Da。肽段定量分析模式为：在肽段的赖氨酸(K)上设置轻/重二甲基修饰(24/28Da)。
如图1，通过时间曲线得到当2μM Aurora A激酶与5μM VX689孵育时，所鉴定到的赖氨酸位点分成了两部分，一部分赖氨酸位点轻重同位素标记比值依旧维持在1附近，如K171、K227、K326等，另一部分赖氨酸的比值(重标/轻标)远小于1，如K162、K271和K309。这说明抑制剂VX689在浓度为5μM时可以与Aurora A激酶发生有效的相互作用，并引起赖氨酸位点162、271、309的变化。
如图2，通过浓度曲线发现随着抑制剂浓度从0.1μM升高到1μM，K162、K271和K309三个位点的标记比值(重标/轻标)不断降低，当VX689浓度达到1μM以上，其比值基本保持不变。其它赖氨酸位点K227、K326等的标记比值(重标/轻标)在整个抑制剂浓度变化区间(0.1μM-5μM)都基本维持在1左右。以上结果说明1μM VX689抑制剂已经能够与2μM Aurora A激酶发生充分相互作用，进一步提高抑制剂浓度对于抑制效率并没有显著提高。与标记反应时间考察的结果一致，VX689在浓度为与Aurora A激酶发生有效的相互作用的赖氨酸位点是162、271、309。并且，此方法还能用于考察相互作用的强度，当VX689的浓度越高，与Aurora A结合强度越强，定量标记的比值就远离1。
实施例2 K309突变对极光激酶Aurora A蛋白和抑制剂VX689相互作用的影响
将极光激酶蛋白A(Aurora A)的第309位赖氨酸(K)位点随机突变成丙氨酸(A)，改变VX689的浓度，观察野生型蛋白(WT，2μM)和突变型蛋白(K309A，2μM)对激酶底物组蛋白Histone H3(终浓度1.2μM)的磷酸化水平，从而考察不同VX689浓度下，Aurora A激酶的活性变化。
从图3的分子印记图中可以看出，当VX689达到1.2μM，激酶底物Histone H3不能被野生型Aurora A磷酸化，而该浓度不足以抑制突变型Aurora A的活性，需要更大浓度的抑制剂(到2.5μM)才能达到对突变型Aurora A的活性的抑制。
上述结果说明远离ATP结合域的K309位点在抑制剂结合Aurora A激酶时会发生变化，该位点为设计别构抑制剂提供了另一种设计思路。
实施例3稳定同位素标记和质谱定量的方法与分子印迹法在探究激酶活性曲线中的比较，并计算各自的IC50值。
根据图2的K162，K271和K309同位素标记比值随浓度变化的曲线可以得到VX689对Aurora A激酶的IC50值为0.4-0.6μM。将K162的曲线与图3通过分子印迹图得到野生型Aurora A激酶活性曲线(即通过磷酸化的Histone H3条带的深浅定量)进行对比。结果如图4所示，可以发现，二者的曲线基本一致，经过模拟计算，得到K162曲线和激酶活性曲线中VX689对Aurora A激酶的IC50值都是0.4μM。因此，通过稳定同位素标记和质谱定量的方法得到的同位素标记比值不仅能反应相互作用强度得到小分子对蛋白质激酶的IC50值，而且与分子印迹方法得到的结果一致。

Claims (8)

1.一种定量分析小分子和蛋白质激酶相互作用的方法，具体为基于稳定同位素标记和质谱的小分子与蛋白质激酶相互作用区域和强度的方法，其特征在于：对孵育和未孵育小分子的蛋白质激酶分别进行赖氨酸残基稳定同位素差异标记，等质量(按孵育前蛋白质激酶的质量)混合后对蛋白质激酶样品进行酶解并通过液质联用分析检测酶解肽段同位素比值得到小分子与蛋白质激酶的相互作用区域和作用强度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
分别采用稳定同位素标记试剂甲醛(CH2O)、氘代甲醛(CD2O)和C13氘代甲醛(13CD2O)中不同的一种，以及催化剂氰基硼氢化钠(NaBH3CN)和氘代氰基硼氢化钠(NaBD3CN)中的一种，对赖氨酸进行二甲基化标记；标记后等质量混合，经过变性和酶解得到肽段混合样品，通过液质联用分析得到含有赖氨酸的酶解肽段的轻重同位素比值。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
当赖氨酸所在肽段同位素比值为0.8-1.2(包括0.8和1.2)，则认定该赖氨酸所处区域并未与激酶有明显相互作用；当赖氨酸所在肽段同位素的比值小于0.8或大于1.2时，则该赖氨酸所在区域与激酶有显著相互作用，并且，当比值越偏离1，相互作用的强度越强。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
小分子指的是分子量100-2000的能抑制任一一种蛋白质激酶活性(但不失去活性)的不含有伯胺基团的有机物(优先选择已用于药物临床实验的有机物药物)；蛋白质激酶(蛋白激酶)指的是能对蛋白质底物进行磷酸化的蛋白质。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：
包括以下步骤：
(1)将蛋白质激酶溶解在pH 4.5-9.5的HEPES或者TEAB缓冲液中使其终浓度为0.01-100μg/μL；将此蛋白质激酶溶液分成等质量的两份；一份不做处理，一份加入小分子并与小分子孵育得到蛋白质激酶-小分子溶液；孵育条件是4-30℃孵育10-120min；
(2)向上述步骤(1)得到的蛋白质激酶溶液中和蛋白激酶-小分子溶液中分别加入稳定同位素二甲基化试剂；选择二甲基化试剂甲醛(CH2O)、氘代甲醛(CD2O)和C13氘代甲醛(13CD2O)中的两种各自分别加入上述两种溶液，使二甲基化试剂的终浓度是0.01-100mmol/L；并分别加入催化剂，当二甲基化试剂使用甲醛或氘代甲醛时加入氰基硼氢化钠(NaBH3CN)，当二甲基化试剂采用C13氘代甲醛时加入氘代氰基硼氢化钠(NaBD3CN)，催化剂的终浓度是0.01-100mmol/L，在4-60℃下反应1-200min；
(3)向上述步骤(2)得到的溶液中分别加入带有铵根离子的溶液(如碳酸氢铵溶液或氨水中的一种或两种)，使铵根离子终浓度为100-1000mmol/L；
(4)将上述(3)得到的两种溶液混合后加入蛋白酶酶解，在10-60℃下酶解0.1-100h；
(5)对上述(4)得到的溶液加入三氟乙酸和/或甲酸使溶液的pH＝3，随后进行液相色谱分离和质谱检测；
(6)对上述(5)得到的质谱数据进行数据库检索，得到重标与轻标的比值，根据比值来判断小分子和激酶的相互作用。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：在蛋白质激酶浓度一定的情况下改变小分子的浓度，改变的范围从摩尔比0.0001-10000(小分子：蛋白质激酶)，分别进行同位素差异标记和质谱定量分析，通过相互作用位点的同位素标记比值随浓度的变化曲线，可以定量评估不同浓度的小分子对蛋白质激酶活性的抑制效率，并得到小分子对蛋白质激酶的IC50值。
7.根据权利要求书1所述的方法，将其应用于Aurora A激酶与ATP竞争型小分子VX689的相互作用分析，发现赖氨酸位点162、271和309所在区域与蛋白质激酶有强烈相互作用。
8.根据权利要求书1-7任一所述的方法，其特征在于：
将Aurora A蛋白质激酶的氨基酸序列第309位赖氨酸突变为任意其他氨基酸，可降低小分子VX689对该蛋白质激酶的抑制效率。
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