CN108072555A - 一种蛋白质甲基化的分析处理方法及其应用 - Google Patents

一种蛋白质甲基化的分析处理方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108072555A
CN108072555A CN201611006806.7A CN201611006806A CN108072555A CN 108072555 A CN108072555 A CN 108072555A CN 201611006806 A CN201611006806 A CN 201611006806A CN 108072555 A CN108072555 A CN 108072555A
Authority
CN
China
Prior art keywords
methylates
analysis
protein
solution
processing method
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201611006806.7A
Other languages
English (en)
Inventor
叶明亮
王科云
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Original Assignee
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian Institute of Chemical Physics of CAS filed Critical Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority to CN201611006806.7A priority Critical patent/CN108072555A/zh
Publication of CN108072555A publication Critical patent/CN108072555A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/34Purifying; Cleaning
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/96Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation using ion-exchange

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明涉及一种蛋白质甲基化的分析处理方法,利用甲基化修饰的赖氨酸和精氨酸会抑制胰蛋白酶的酶切这一特性,发展了一种综合了重标甲硫氨酸细胞培养氨基酸稳定同位素标记(heavy methyl stable isotope labeling by amino acids in cell culture,hM‑SILAC),多酶酶切和强阳离子交换微柱(SCXtip)分离的样品处理方法,并将其应用于甲基化蛋白质组的规模化分析中。通过结合多酶酶切策略,有效的降低了非甲基化来源的漏切位点,并通过高pH范围的强阳离子交换色谱的分离策略,有效的克服了含有组氨酸的肽段的干扰。从而极大的提高了甲基化肽段的分离特异性。

Description

一种蛋白质甲基化的分析处理方法及其应用
技术领域
本发明属于蛋白质组学研究方向甲基化蛋白质组学技术领域,具体涉及蛋白质甲基化的分析处理方法及其应用。
背景技术
蛋白质的甲基化修饰是由S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)依赖的甲基转移酶催化产生的,是最常见的蛋白质翻译后修饰之一。甲基化修饰在很多的生理过程的调控中发挥着重要的调控作用。研究表明:蛋白甲基化可以调节目标蛋白分子内或分子间的相互作用;影响它们和RNA的亲和作用,从而影响着多种细胞进程,包括转录调节、细胞定位、核糖体装配、RNA加工、不均一核糖核酸核糖体蛋白(hnRNPs)的成熟、蛋白-蛋白相互作用、翻译的准确性、细胞核运输、蛋白核酸运输和代谢以及细胞内信号传导等。由于甲基化的多样性及复杂性,在蛋白质组学水平上鉴定甲基化位点仍然十分的困难,这主要是因为蛋白质中甲基的引入除了增加甲基化氨基酸残基的空间位阻和减少氨基酸残基的氢键作用力外,并没有显著改变氨基酸残基的净电荷或者等电点,这使得甲基化蛋白质/肽段的高效分离富集比较困难,极大的影响了分析的灵敏度。
发生甲基化修饰后的赖氨酸残基和精氨酸残基的碳端(C端)不容易被胰蛋白酶(trypsin)识别而导致漏切。因为甲基化修饰不会改变赖氨酸残基和精氨酸残基的带电性质,这些漏切肽段会比普通的酶切肽段多带一些正电荷,因而可以利用低pH范围的离线(off-line)SCX分离策略对这些甲基化肽段进行分离(文献1.Uhlmann,T.;Geoghegan,V.L.;Thomas,B.;Ridlova,G.;Trudgian,D.C.;Acuto,O.Mol Cell Proteomics 2012,11,1489-1499)。但是在低pH范围的SCX色谱分离条件下,非甲基化的漏切肽段和含有组氨酸的肽段也会多带一些正电荷,因而会对甲基化肽段的高效分离造成干扰。据报道,在甲基化肽段比较集中的SCX馏分中,含有组氨酸的肽段会占到了全部肽段的60-70%,极大的影响了分离的特异性。
本发明首次利用高pH范围的强阳离子交换色谱(strong cation exchangechromatography,SCX)分离的思路,借助于重标甲硫氨酸细胞培养氨基酸稳定同位素标记技术(heavy methyl stable isotope labelling by amino acids in cell culture,hM-SILAC)和多酶酶切技术,显著提高了鉴定的可信度,并降低了分离过程中非甲基化肽段的干扰,从而实现了甲基化蛋白质组学样品的高通量分析。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高通量的集SCXtip分离技术,重标甲硫氨酸细胞培养氨基酸稳定同位素标记技术和多酶酶切技术于一体的甲基化蛋白质组样品处理方法。
本发明提出的甲基化蛋白质组样品的综合分析方法,利用了甲基化修饰后的赖氨酸和精氨酸不容易被胰蛋白酶酶切而导致漏切这一特性,实现了基于SCXtip的甲基化蛋白质组学的分离和分析。
本发明采用的技术方案为:
一种蛋白质甲基化的分析处理方法:
(1)利用重标甲硫氨酸细胞培养氨基酸稳定同位素标记技术将蛋白质中的赖氨酸和精氨酸上的甲基化修饰基团进行重标标记;
(2)对步骤(1)得到的重甲基化修饰后的蛋白质进行多酶酶切处理,所述多酶为胰蛋白酶、赖氨酸酶和精氨酸酶;
(3)对步骤(2)得到的蛋白质酶解液进行离心辅助的基于强阳离子交换微柱(SCXtip)的甲基化肽段分离,微柱分离时,清洗剂为78%-82%乙腈,勃-罗二氏缓冲溶液(Britton&Robinson Universal Buffer,BRUB),清洗剂pH值为8.5-9.5,以降低组氨酸肽段的干扰,得到甲基化蛋白质组。
步骤(1)具体操作为,将细胞在含有重标甲硫氨酸的DMEM培养液中培养,得到的细胞于裂解液中超声辅助破碎。
所述勃-罗二氏缓冲溶液包括磷酸、硼酸和醋酸,勃-罗二氏缓冲溶液用氢氧化钠溶液调节pH值,所述多酶酶切处理是指向重甲基化修饰后的蛋白质中加入胰蛋白酶、赖氨酸酶和精氨酸酶进行酶解。
本发明所使用的细胞选自人源细胞,例如HepG2细胞、HeLa细胞和Jurkat细胞。
所述细胞培养的体系是含有0.2mM的L-Methionine-(methyl-13C,D3)的DMEM培养基,并加入10%的透析处理的胎牛血清;
所述细胞裂解液的体系是含有8M尿素,1%v/v聚乙二醇辛基苯基醚,65mM二硫苏糖醇,1mM苯甲基磺酰氟,1%v/v蛋白酶抑制剂,50mM Tris-Cl pH 7.5的缓冲溶液。
步骤(2)中多酶酶切处理的操作步骤为:向重甲基化修饰后的蛋白质中加入终浓度为10-20mM二硫苏糖醇,37-60℃水浴中1-3h,然后加入终浓度为20-40mM碘代乙酰胺,20-25℃避光反应40-60min,通过超滤辅助酶解策略将溶液置换为50mM碳酸氢铵,pH 8.0,按照蛋白:酶质量比为50:1加入胰蛋白酶(trypsin)和赖氨酸酶(lys-C),在37℃条件下酶解16小时,经超滤处理去除胰蛋白酶(trypsin)和赖氨酸酶(lys-C),然后添加10×活化溶液至1×,按照蛋白:酶质量比为50:1加入精氨酸酶(arg-C),在37℃条件下酶解16小时,其中活化溶液为50mM pH 7.6–7.9Tris-HCl,50mM二硫苏糖醇(DTT)和2mM乙二胺四乙酸(EDTA)。
所述氢氧化钠溶液用氢氧化钠溶解于水中制成;BRUB溶液的浓度为5mM,包括5mM磷酸,5mM硼酸和5mM醋酸,用1M氢氧化钠溶液调pH值为8.5-9.5。
步骤(3)中所述离心辅助中离心机的离心力为1000g-3000g;强阳离子交换微柱(SCXtip)为填充了强阳离子交换色谱材料的以脱脂棉为塞板的枪头。
步骤(3)具体操作为:按体积比计,将步骤(2)中得到的蛋白质上样到SCXtip中,利用200μL清洗液(78%-82%乙腈(优选为80%),勃-罗二氏缓冲剂,pH 8.5-9.5(优选为pH9))洗2-5次,以降低组氨酸肽段的干扰。分别利用200μL的一系列洗脱溶液来洗脱结合的甲基化多肽,洗脱溶液分别为60%乙腈,5mM勃-罗二氏缓冲剂(pH 9);60%乙腈,5mM勃-罗二氏缓冲剂(pH10);60%乙腈,5mM勃-罗二氏缓冲剂(pH 11);30%乙腈,5mM勃-罗二氏缓冲剂(pH 12);5mM勃-罗二氏缓冲剂(pH 12),1M氯化钠。分别收集各洗脱馏分并进行除盐处理,将所得甲基化肽段室温下冻干,得处理后的甲基化蛋白质组。
本发明还提供上述分析处理方法于分析鉴定翻译后修饰蛋白质组学甲基化位点中的应用:将步骤(3)得到甲基化蛋白质组复溶在三氟乙酸中进行RPLC-MS/MS分析。
所述三氟乙酸的pH值为2.0-2.3;优选为0.1%体积浓度的三氟乙酸。
本发明的有益效果为:
将该样品处理方法应用于甲基化蛋白质组学高效分析,可获取相应的甲基化位点的鉴定结果,该结果可以用于翻译后修饰蛋白质组学分析。
附图说明
下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明:
图1为蛋白质甲基化的综合分析方法的流程图。利用重标甲硫氨酸来标记甲基化位点,破碎细胞来提取蛋白,然后进行多酶酶切处理,待酶解完成后,利用装填有一定量强阳离子交换材料的微柱进行甲基化肽段的分离,并进行后续的质谱鉴定。
图2为甲基化位点的漏切情况的考察。未修饰(EIAQDF-K-TDLR),单甲基化(EIAQDF-K(Me1)-TDLR),二甲基化(EIAQDF-K(Me2)-TDLR)和三甲基化(EIAQDF-K(Me3)-TDLR)的肽段在trypsin的酶切处理后的MALDI图。可以发现,未修饰的赖氨酸的C端会被切断,而甲基化后的赖氨酸的C端不容易被酶切。
图3为SCXtip分离时不同洗脱条件下5个甲基化标肽(1:EIAQDF-K(Me1)-TDLR;2:EIAQDF-K(Me2)-TDLR;3:EIAQDF-K(Me3)-TDLR;4:SG-R(Me1)-GGNFGFGDSR;5:N-R(Me2S)-GAGGFGGGGGTR)的洗脱情况:(A)样品的直接分析;(B)上样流穿液的分析;(C)90%乙腈,5mMBRUB(pH 9)的洗脱液的分析;(D)85%乙腈,5mM BRUB(pH 9)的洗脱液的分析;(E)80%乙腈,5mM BRUB(pH 9)的洗脱液的分析;(F)65%乙腈,5mM BRUB(pH 9)的洗脱液的分析;(G)30%乙腈,5mM BRUB(pH 12)的洗脱液的分析。可以发现,随着洗脱强度的增加,甲基化肽段会在80%乙腈,5mM BRUB(pH 9)的条件下被首先洗脱下来。
图4为hM-SILAC标记的HepG2细胞的甲基化蛋白质组的鉴定结果:(A)不同类型的赖氨酸甲基化位点之间的重叠(overlap)情况,(B)不同类型的精氨酸甲基化位点之间的重叠情况,(C)不同类型的甲基化修饰位点的鉴定数目以及(D)精氨酸甲基化位点和赖氨酸甲基化位点的序列特征。可以发现,我们这一分析策略可以鉴定到精氨酸和赖氨酸上的全部五种甲基化形式。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1
甲基化位点的漏切情况的考察:未修饰(EIAQDF-K-TDLR),单甲基化(EIAQDF-K(Me1)-TDLR),二甲基化(EIAQDF-K(Me2)-TDLR)和三甲基化(EIAQDF-K(Me3)-TDLR)的肽段溶解在50mM NH4HCO3(pH 8.0)中,按照蛋白:酶(50:1,w/w)的比例加入胰蛋白酶(trypsin),37℃孵育16小时,然后进行激光辅助离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF)分析。如图2所示,通过分析不同肽段在胰蛋白酶(trypsin)酶切处理后的质谱图,可以发现,未修饰的赖氨酸的C端会被完全切断,单甲基化修饰后的赖氨酸的碳端(C端)只有很小的比例会被酶切,而二甲基化和三甲基化修饰后的赖氨酸的C端不能被胰蛋白酶(trypsin)酶切。这一结果清楚的表明,发生甲基化修饰后的赖氨酸残基和精氨酸残基的碳端(C端)不容易被胰蛋白酶(trypsin)识别而导致漏切。因为甲基化修饰不会改变赖氨酸残基和精氨酸残基的带电性质,这些漏切肽段会比普通的酶切肽段多带一些正电荷,因而利用SCX色谱法可以对这些甲基化肽段进行分离。
实施例2
多酶酶切策略用于降低漏切位点的比例:向1mg从HepG2细胞中提取的蛋白样品中加入终浓度为10-20mM二硫苏糖醇(DTT),37-60℃水浴中1-3h,然后加入终浓度为20-40mM碘代乙酰胺(IAA),20-25℃避光反应40-60min。通过超滤辅助样品处理策略将溶液置换为50mM碳酸氢铵(pH 8.0)。将1mg处理后的蛋白样品均分为三份,第一组样品按照蛋白:酶(50:1,w/w)的比例加入胰蛋白酶(trypsin),37℃孵育16小时;第二组样品按照蛋白:酶(50:1,w/w)的比例加入胰蛋白酶(trypsin)和赖氨酸酶(lys-C),37℃孵育16小时;第三组按照蛋白:酶(50:1,w/w)的比例加入trypsin和赖氨酸酶(lys-C),37℃孵育16小时。经超滤处理去除胰蛋白酶(trypsin)和赖氨酸酶(lys-C),然后加入10×激活溶液(50mM Tris-HCl(pH 7.6–7.9),50mM二硫苏糖醇and 2mM乙二胺四乙酸)至1×,按照蛋白:酶的比例(50:1,w/w)加入精氨酸酶(arg-C),在37度条件下酶解16小时。
将所得甲基化肽段室温冻干,取2μg复溶在10μL 0.1%(v/v)三氟乙酸中进行RPLC-MS/MS分析,使用人数据库进行谱图搜索和数据处理后得到定性结果。
表1不同酶切方法的蛋白漏切率的分析结果
如表1所示,第三组通过多酶酶切策略(Trypsin/Lys-C/Arg-C)处理,可以将蛋白的总体漏切率降低到5%以下,与第一组(Trypsin)和第二组(Trypsin/Lys-C)相比,蛋白的漏切率显著的降低,因而极大的减轻SCX分离时的非甲基化肽段的干扰,可以提高甲基化肽段分离的特异性。
实施例3
“SCXtip”的分离条件的优化:利用甲基化标准肽段来考察SCXtip分离所需要的最佳分离条件。5个甲基化标肽(EIAQDF-K(Me1)-TDLR;EIAQDF-K(Me2)-TDLR;EIAQDF-K(Me3)-TDLR;SG-R(Me1)-GGNFGFGDSR;N-R(Me2S)-GAGGFGGGGGTR)溶解在60%(vol/vol)乙腈,40%(vol/vol)5mM BRUB(pH 2.5)溶液中,上样到SCXtip中,并依次用90%乙腈,5mM BRUB(pH9)溶液,85%乙腈,5mM BRUB(pH 9)溶液,80%乙腈,5mM BRUB(pH 9)溶液,65%乙腈,5mMBRUB(pH 9)溶液,30%乙腈,5mM BRUB(pH 12)溶液对SCXtip柱上结合的肽段进行洗脱,收集对应的洗脱溶液并进行MALDI-TOF质谱分析,从图3中,我们可以看出,在上样步骤的质谱图中,没有肽段的峰被看到,说明甲基化标肽全部保留在SCXtip上;当用不同的缓冲溶液去洗脱结合的肽段时,随着洗脱强度的增加,甲基化肽段首先在80%乙腈,5mM BRUB(pH 9)的洗脱液中被鉴定到,所以这一缓冲溶液被确定为去除非特异性吸附的清洗条件。
实施例4
“SCXtip”分离策略用于甲基化蛋白质组学的规模化分析:将HepG2细胞在含有0.2mM L-Methionine-(methyl-13C,D3)的DMEM培养基中培养至少八代;收取细胞并在裂解液(8M尿素,1%v/v聚乙二醇辛基苯基醚,65mM二硫苏糖醇,1mM苯甲基磺酰氟,1%v/v蛋白酶抑制剂,50mM Tris-Cl pH 7.5的缓冲溶液)中超声辅助破碎;向1mg重甲基化修饰后的蛋白质样品中加入终浓度为20mM二硫苏糖醇,37℃水浴中2h,然后加入终浓度为40mM碘代乙酰胺,25℃避光反应40min,通过超滤辅助酶解策略将溶液置换为50mM碳酸氢铵,pH 8.0,按照蛋白:酶质量比为50:1加入胰蛋白酶(trypsin)和赖氨酸酶(lys-C),在37℃条件下酶解16小时,经超滤处理去除胰蛋白酶(trypsin)和赖氨酸酶(lys-C),然后添加10×活化溶液(50mM pH 7.6–7.9Tris-HCl,50mM二硫苏糖醇和2mM乙二胺四乙酸)至1×,按照蛋白:酶质量比为50:1加入精氨酸酶(arg-C),在37℃条件下酶解16小时;通过离心辅助的基于SCXtip的甲基化肽段分离,微柱分离时,将1mg蛋白质组样品上样到填充了60mg强阳离子交换色谱材料的SCXtip中,利用200μL清洗液(80%乙腈,勃-罗二氏缓冲剂,pH 9)洗三次,以降低组氨酸肽段的干扰,分别利用200μL的一系列洗脱溶液来洗脱结合的甲基化多肽,洗脱溶液分别为60%乙腈,5mM BRUB(pH 9);60%乙腈,5mM BRUB(pH 10);60%乙腈,5mM BRUB(pH11);30%乙腈,5mM BRUB(pH 12);5mM BRUB(pH 12),1M氯化钠。分别收集各洗脱馏分并进行除盐处理,将所得甲基化肽段室温下冻干,得处理后的甲基化蛋白质组样品。将得到的甲基化肽段复溶在10μL 0.1%体积浓度的三氟乙酸中进行RPLC-MS/MS分析。使用人数据库进行谱图搜索和数据处理后得到定性结果。由图4所示,通过对HepG2细胞样品的分析,在三次技术重复中,成功的从3×1mg蛋白样品中鉴定到了768个甲基化位点上的887个的甲基化结果,覆盖了赖氨酸和精氨酸上面的全部5种甲基化类型,证明了这种分析方法具有很强的的适用性。
本发明为一种蛋白质甲基化的分析处理方法,利用甲基化修饰的赖氨酸和精氨酸会抑制胰蛋白酶的酶切这一特性,发展了一种综合了重标甲硫氨酸细胞培养稳定同位素氨基酸标记,多酶酶切和强阳离子交换微柱分离的样品处理方法,并将其应用于甲基化蛋白质组的分析。通过结合多酶酶切策略,有效的降低了非甲基化来源的漏切位点,并通过高pH梯度的强阳离子交换分离策略,有效的克服了含有组氨酸的肽段的干扰。从而极大的提高了甲基化肽段的分离特异性。这种样品处理方法为甲基化蛋白质组学的研究和发展,提供了一个新的方法和技术平台。

Claims (10)

1.一种蛋白质甲基化的分析处理方法,其特征在于:
(1)利用重标甲硫氨酸细胞培养氨基酸稳定同位素标记技术将蛋白质中的赖氨酸和精氨酸上的甲基化修饰基团进行重标标记;
(2)对步骤(1)得到的重甲基化修饰后的蛋白质进行多酶酶切处理,所述多酶为胰蛋白酶、赖氨酸酶和精氨酸酶;
(3)对步骤(2)得到的蛋白质酶解液进行离心辅助的基于强阳离子交换微柱(SCXtip)的甲基化肽段分离,微柱分离时,清洗剂为78%-82%乙腈,勃-罗二氏缓冲溶液(Britton&Robinson Universal Buffer,BRUB),清洗剂pH值为8.5-9.5,以降低组氨酸肽段的干扰,得到甲基化蛋白质组。
2.根据权利要求1所述的分析处理方法,其特征在于:
步骤(1)具体操作为,将细胞在含有重标甲硫氨酸的DMEM培养液中培养,得到的细胞于裂解液中超声辅助破碎。
3.根据权利要求1所述的分析处理方法,其特征在于:
所述勃-罗二氏缓冲溶液包括磷酸、硼酸和醋酸,勃-罗二氏缓冲溶液用氢氧化钠溶液调节pH值;
所述多酶酶切处理是指向重甲基化修饰后的蛋白质中加入胰蛋白酶、赖氨酸酶和精氨酸酶进行酶解。
4.根据权利要求2所述的分析处理方法,其特征在于:
所述细胞培养的体系是含有0.2mM的L-Methionine-(methyl-13C,D3)的DMEM培养基,并加入10%的透析处理的胎牛血清;
所述细胞裂解液的体系是含有8M尿素,1%v/v聚乙二醇辛基苯基醚,65mM二硫苏糖醇,1mM苯甲基磺酰氟,1%v/v蛋白酶抑制剂,50mM Tris-ClpH 7.5的缓冲溶液。
5.根据权利要求1所述的分析处理方法,其特征在于:
步骤(2)中多酶酶切处理的操作步骤为:向重甲基化修饰后的蛋白质中加入终浓度为10-20mM二硫苏糖醇,37-60℃水浴中1-3h,然后加入终浓度为20-40mM碘代乙酰胺,20-25℃避光反应40-60min,通过超滤辅助酶解策略将溶液置换为50mM碳酸氢铵,pH 8.0,按照蛋白:酶质量比为50:1加入胰蛋白酶(trypsin)和赖氨酸酶(lys-C),在37℃条件下酶解16小时,经超滤处理去除胰蛋白酶(trypsin)和赖氨酸酶(lys-C),然后添加10×活化溶液至1×,按照蛋白:酶质量比为50:1加入精氨酸酶(arg-C),在37℃条件下酶解16小时,其中活化溶液为50mM pH 7.6–7.9Tris-HCl,50mM二硫苏糖醇(DTT)和2mM乙二胺四乙酸(EDTA)。
6.根据权利要求3所述的分析处理方法,其特征在于:
所述氢氧化钠溶液用氢氧化钠溶解于水中制成;BRUB溶液的浓度为5mM,包括5mM磷酸、5mM硼酸和5mM醋酸,用1M氢氧化钠溶液调pH值至8.5-9.5。
7.根据权利要求1所述的分析处理方法,其特征在于:
步骤(3)中所述离心辅助中离心机的离心力为1000g-3000g;强阳离子交换微柱(SCXtip)为填充了强阳离子交换色谱材料的以脱脂棉为塞板的枪头。
8.根据权利要求1所述的分析处理方法,其特征在于:
步骤(3)具体操作为:将步骤(2)中得到的蛋白质上样到SCXtip中,利用200μL清洗液洗2-5次,所述清洗液为78%-82%乙腈,勃-罗二氏缓冲剂,pH 8.5-9.5,以降低组氨酸肽段的干扰,再分别利用200μL的一系列洗脱溶液来洗脱结合的甲基化多肽,洗脱溶液分别为60%乙腈,5mM勃-罗二氏缓冲剂,pH 9;60%乙腈,5mM勃-罗二氏缓冲剂,pH 10;60%乙腈,5mM勃-罗二氏缓冲剂,pH 11;30%乙腈,5mM勃-罗二氏缓冲剂,pH 12;5mM勃-罗二氏缓冲剂,pH12,1M氯化钠;分别收集各洗脱馏分并进行除盐处理,将所得甲基化肽段室温下冻干,得处理后的甲基化蛋白质组。
9.一种权利要求1所述分析处理方法于分析鉴定翻译后修饰蛋白质组学甲基化位点中的应用,其特征在于:将步骤(3)得到甲基化蛋白质组复溶在三氟乙酸中进行RP LC-MS/MS分析。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于:所述三氟乙酸的pH值为2.0-2.3;优选为0.1%体积浓度的三氟乙酸。
CN201611006806.7A 2016-11-16 2016-11-16 一种蛋白质甲基化的分析处理方法及其应用 Pending CN108072555A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611006806.7A CN108072555A (zh) 2016-11-16 2016-11-16 一种蛋白质甲基化的分析处理方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611006806.7A CN108072555A (zh) 2016-11-16 2016-11-16 一种蛋白质甲基化的分析处理方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108072555A true CN108072555A (zh) 2018-05-25

Family

ID=62162938

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611006806.7A Pending CN108072555A (zh) 2016-11-16 2016-11-16 一种蛋白质甲基化的分析处理方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108072555A (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109022609A (zh) * 2018-08-29 2018-12-18 天津商业大学 一种滑菇溯源的方法
CN109557193A (zh) * 2018-07-09 2019-04-02 中国检验检疫科学研究院 一种芝麻主要过敏原的质谱定性检测方法
CN109932444A (zh) * 2019-03-19 2019-06-25 北京泰德制药股份有限公司 一种糖蛋白多种电荷异构体翻译后修饰的评价方法
CN110658270A (zh) * 2018-06-29 2020-01-07 中国科学院大连化学物理研究所 一种定量分析小分子和蛋白质激酶相互作用的方法
CN111208244A (zh) * 2018-11-22 2020-05-29 中国科学院大连化学物理研究所 一种非抗体依赖的蛋白质甲基化修饰富集分析方法
CN111607004A (zh) * 2020-06-08 2020-09-01 中国科学院合肥物质科学研究院 一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法
CN112285265A (zh) * 2019-07-24 2021-01-29 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法及应用
CN112852914A (zh) * 2019-11-28 2021-05-28 中国科学院大连化学物理研究所 一种减弱肿瘤细胞耐药性的方法
CN114509521A (zh) * 2022-01-19 2022-05-17 南方科技大学 一种糖蛋白质组学样品前处理装置及方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6747273B2 (en) * 2001-05-18 2004-06-08 Mds Proteomics Inc. Methods of detecting protein arginine methyltransferase, and uses related thereto
CN102243218A (zh) * 2011-05-13 2011-11-16 复旦大学 体内终端氨基酸标记的定量蛋白质组学方法
CN102395886A (zh) * 2009-04-17 2012-03-28 玛丽女王和威斯菲尔德学院 用于对修饰的肽进行定量的方法
CN105277712A (zh) * 2014-07-25 2016-01-27 杭州景杰生物科技有限公司 一种鉴定赖氨酸ε-氨基侧链单甲基化修饰的方法
CN105738169A (zh) * 2014-12-09 2016-07-06 中国科学院大连化学物理研究所 一种蛋白质n-端富集方法
CN105866317A (zh) * 2016-03-31 2016-08-17 南方科技大学 集成蛋白质前处理和多肽高pH值反相分级的蛋白质组反应器及其应用
CN105950513A (zh) * 2016-06-02 2016-09-21 暨南大学 一种标记细菌的silac培养基及其制备方法与应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6747273B2 (en) * 2001-05-18 2004-06-08 Mds Proteomics Inc. Methods of detecting protein arginine methyltransferase, and uses related thereto
CN102395886A (zh) * 2009-04-17 2012-03-28 玛丽女王和威斯菲尔德学院 用于对修饰的肽进行定量的方法
CN102243218A (zh) * 2011-05-13 2011-11-16 复旦大学 体内终端氨基酸标记的定量蛋白质组学方法
CN105277712A (zh) * 2014-07-25 2016-01-27 杭州景杰生物科技有限公司 一种鉴定赖氨酸ε-氨基侧链单甲基化修饰的方法
CN105738169A (zh) * 2014-12-09 2016-07-06 中国科学院大连化学物理研究所 一种蛋白质n-端富集方法
CN105866317A (zh) * 2016-03-31 2016-08-17 南方科技大学 集成蛋白质前处理和多肽高pH值反相分级的蛋白质组反应器及其应用
CN105950513A (zh) * 2016-06-02 2016-09-21 暨南大学 一种标记细菌的silac培养基及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KEYUN WANG等: "Antibody-Free Approach for the Global Analysis of Protein Methylation", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
吴飞林 等: "蛋白质水解酶和样品预处理优化技术在蛋白质组学研究中的应用", 《生物工程学报》 *
李伟哲等: "非组蛋白甲基化修饰的研究进展", 《生物化学与生物物理进展》 *
邹家云 等: "两种胰蛋白酶酶解羊肌肉总蛋白样品的质谱分析", 《实验动物科学》 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110658270A (zh) * 2018-06-29 2020-01-07 中国科学院大连化学物理研究所 一种定量分析小分子和蛋白质激酶相互作用的方法
CN109557193A (zh) * 2018-07-09 2019-04-02 中国检验检疫科学研究院 一种芝麻主要过敏原的质谱定性检测方法
CN109557193B (zh) * 2018-07-09 2022-05-17 中国检验检疫科学研究院 一种芝麻主要过敏原的质谱定性检测方法
CN109022609A (zh) * 2018-08-29 2018-12-18 天津商业大学 一种滑菇溯源的方法
CN111208244A (zh) * 2018-11-22 2020-05-29 中国科学院大连化学物理研究所 一种非抗体依赖的蛋白质甲基化修饰富集分析方法
CN109932444A (zh) * 2019-03-19 2019-06-25 北京泰德制药股份有限公司 一种糖蛋白多种电荷异构体翻译后修饰的评价方法
CN112285265A (zh) * 2019-07-24 2021-01-29 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法及应用
CN112285265B (zh) * 2019-07-24 2022-02-01 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法及应用
CN112852914A (zh) * 2019-11-28 2021-05-28 中国科学院大连化学物理研究所 一种减弱肿瘤细胞耐药性的方法
CN112852914B (zh) * 2019-11-28 2023-01-13 中国科学院大连化学物理研究所 一种减弱肿瘤细胞耐药性的方法
CN111607004A (zh) * 2020-06-08 2020-09-01 中国科学院合肥物质科学研究院 一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法
CN111607004B (zh) * 2020-06-08 2023-09-08 中国科学院合肥物质科学研究院 一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法
CN114509521A (zh) * 2022-01-19 2022-05-17 南方科技大学 一种糖蛋白质组学样品前处理装置及方法
CN114509521B (zh) * 2022-01-19 2023-12-19 南方科技大学 一种糖蛋白质组学样品前处理装置及方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108072555A (zh) 一种蛋白质甲基化的分析处理方法及其应用
Pomastowski et al. Two-dimensional gel electrophoresis in the light of new developments
Wu et al. Protein extraction from plant tissues for 2DE and its application in proteomic analysis
Pieper et al. Characterization of the human urinary proteome: a method for high‐resolution display of urinary proteins on two‐dimensional electrophoresis gels with a yield of nearly 1400 distinct protein spots
Wang et al. A method for protein extraction from different subcellular fractions of laticifer latex in Hevea brasiliensis compatible with 2-DE and MS
Karch et al. Identification and quantification of histone PTMs using high-resolution mass spectrometry
EP2250186B1 (en) High pressure enzymatic digestion system for protein characterization
Kota et al. Advances in qualitative and quantitative plant membrane proteomics
Salvi et al. Purification and proteomic analysis of chloroplasts and their sub-organellar compartments
Frolov et al. Mining seed proteome: From protein dynamics to modification profiles
Beer et al. In-depth, reproducible analysis of human plasma using IgY 14 and SuperMix immunodepletion
Chan et al. Fractionation of peptides by strong cation-exchange liquid chromatography
Baracat-Pereira et al. Separomics applied to the proteomics and peptidomics of low-abundance proteins: Choice of methods and challenges-A review
Di Falco Mass spectrometry-based proteomics
Petersen et al. Functional proteomics of barley and barley chloroplasts–strategies, methods and perspectives
US20140156206A1 (en) Detection and Quantification of Polypeptides Using Mass Spectrometry
Patole et al. Plant proteomics: A guide to improve the proteome coverage
Michalski et al. Strategies for analysis of electrophoretically separated proteins and peptides
Winnik et al. Analysis of proteins using DIGE and MALDI mass spectrometry
Savary et al. Routine identity confirmation of recombinant proteins by MALDI-TOF mass spectrometry
CN108445221A (zh) 一种蛋白质甲基化的鉴定方法
Naldrett et al. Concentration and desalting of peptide and protein samples with a newly developed C18 membrane in a microspin column format
Cohen Amino Acid Analysis Using Pre-Column Derivatization with 6-Aminoquinolyl N-Hydroxysuccinimidyl Carbamate: Analysis of Hydrolyzed Proteins and Electroblotted Samples
WO2005052182A2 (en) A method of analyzing plasma membrane protein content of cells
EP2370452B1 (en) Process for extracting proteins from ffpe biological tissue samples

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180525

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication