CN105738169A - 一种蛋白质n-端富集方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蛋白质N-端富集方法，包括：选择性胍基化标记、磷酸根标记、磷酸根亲和材料富集。蛋白质样品首先采用碱性磷酸酶去除磷酸化翻译后修饰，然后在强碱性条件下对蛋白侧链氨基进行选择性的胍基化标记封闭侧链氨基，剩余的蛋白末端氨基采用带有磷酸根的氨基活性试剂进行标记使末端带上磷酸根标签，对标记的蛋白进行酶解，最后采用磷酸根亲和富集材料吸附带有磷酸根标签的N-端肽段，从而得到蛋白质N-端。本发明的优点是高效的胍基化、磷酸根标记和亲和材料富集，使得蛋白N端的富集具有优异的富集效率与选择性。

Description

一种蛋白质N-端富集方法

技术领域

本发明涉及一种蛋白质N-端富集方法，实现蛋白N-端高效高选择性富集。

背景技术

蛋白质末端的修饰是生物体内常见的翻译后修饰之一，常见的N端乙酰化与信号肽剪切与蛋白质的稳定性、定位及活性相关。此外，生物体内蛋白的水解是体内最常见的翻译后修饰之一，促使蛋白产生新的末端，此类过程与细胞凋亡、趋化因子加工等众多生物学过程及生理机能密切相关。末端蛋白组学的建立也大大的促进了蛋白水解酶底物鉴定及位点分析等领域的发展。但是，蛋白的末端不具有如磷酸化糖基化等修饰可进行直接富集的靶标，因为，如何有效的区分末端肽段与酶解所产生的中间肽段进而实现末端肽段的有效富集，对于了解生物过程及寻找疾病的生物标志物都将起到重要作用。

蛋白末端的富集主要分为两大类，正向富集与反向富集。反向富集方法通过氨基活性颗粒或带有标签的氨基活性试剂去除中间肽段从而得到末端肽段(Molecular&CellularProteomics2012,11,832-842；NatureBiotechnology2010,28,281-288；)。由于中间肽段难以去除完全，限制了方法的选择性；此外，此类方法需要采用大量的材料键合或吸附中间肽段，从而引起大量的非特异性吸附，而造成末端肽段的丢失。正向富集通常在蛋白末端引入亲和标签，酶解后通过亲和标签实现蛋白N端富集(Cell2008,134,866–876；AnalyticalChemistry2013,85,6826-6832；ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences2009,106,19310-19315)，此类方法避免了大量材料的非特异性吸附所引起的末端丢失，但是通常在N端引入标签的效率低，限制了方法的富集效率。

为克服以上方法所存在的问题，我们选择了效率高且简易快速的标记方法于蛋白N端引入亲和标签，以实现蛋白质N末端的高效高选择性富集。发明内容

本发明发展了一种蛋白质N-端富集方法，标记效率高，选择性高。

为了实现该目的，本发明的技术方案是：

蛋白质样品去除自身的磷酸化翻译后修饰后，通过选择性的胍基化反应封闭蛋白质样品的侧链氨基，然后对蛋白剩余的N-端氨基进行磷酸根标记；对标记的蛋白进行酶解后，采用二氧化肽亲和富集带有磷酸根标签的N-末端肽段。

1)采用碱性磷酸酶酶切蛋白磷酸化修饰

取蛋白提取液于3000-10000Da超滤膜上，将背景溶液置换成1×蛋白金属磷酸酶(PMP)反应缓冲液(100mM氯化钠,50mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸,2mM二硫苏糖醇,pH7.5)，加入体积百分数为0.1％-1％蛋白酶抑制剂cocktail和终浓度为0.5-5mM氯化锰,混合均匀后加入λ蛋白磷酸酶(λ-PPase)，于25-50℃温育1-5h,得溶液A。

2)在强碱性条件下，选择性的对肽段侧链氨基进行胍基化

于超滤膜上，将溶液A进行变性、还原、烷基化后，采用氢氧化钠调节pH至9-12，加入终浓度为0.1-2MO-甲基异脲和终浓度为1-6M盐酸胍或尿素，于4-37℃振荡反应4-36h，得溶液B；

3)采用能与氨基反应且含磷酸根的试剂标记蛋白剩余的末端氨基

将溶液B的pH调节至6-9，加入终浓度为10-1000mM的磷酸根试剂，保持溶液中的尿素或盐酸胍终浓度为1-6M，于10-60℃振荡反应2-12h。将超滤膜上的溶液进行离心，采用10-100mM的碳酸氢铵进行溶液置换，以去除残余的试剂，得溶液C。

4)将蛋白进行酶解

于溶液C中加入蛋白水解酶，于25-37℃中孵育6-24h后除盐并冻干5)采用金属氧化物(二氧化钛，二氧化锆，三氧化铝)或固定化金属离子材料(固定化铁离子，锆离子，铝离子)富集标有磷酸根的N-端肽段

采用上样溶液将样品重溶后，上样至金属氧化物或固定化金属离子材料上，材料与蛋白的重量比为5-100，将材料采用不同的清洗溶液去除非特异性吸附后，采用洗脱溶液对富集到的标有磷酸根的N-端肽段进行洗脱，得到蛋白N-端。

其中上样溶液为：30-50％乙腈+0.1-5％三氟乙酸，其余为水；清洗溶液分别为：A：50％乙腈+0.1-5％三氟乙酸+50-200mMNaCl，其余为水；B：80％乙腈+0.1-5％三氟乙酸；C：30％乙腈+0.1-5％三氟乙酸；洗脱溶液：5％-15％氨水

本发明的有益效果为：

1、胍基化反应的效率高选择性高，从而避免了中间肽段的共富集和末端肽段的丢失；

2、磷酸化标记高效率促进N-端肽段得到有效的富集；

3、富集材料与磷酸根的高效相互作用，使蛋白质N-端肽段得到高效高选择性富集。

附图说明

图1蛋白N-末端富集流程；

图2(a)富集前胍基化与磷酸根标记的牛血清蛋白(BSA)胰蛋白酶酶解产物；

图2(b)富集后带有磷酸根标签的牛血清蛋白N-端肽段；

图2(c)富集前胍基化与磷酸根标记的溶菌酶胰蛋白酶酶解产物；

图2(d)富集后带有磷酸根标签的溶菌酶N-端肽段。

(十字星号标记处)表示蛋白质N-端肽段峰，肽段序列中的J代表胍基化的赖氨酸残基。

具体实施方式

实施例1

如图1所示，蛋白经过变性还原烷基化后，进行胍基化和磷酸化标记，将标记蛋白进行酶解，酶解产物采用亲和材料富集带有磷酸根的蛋白N-端肽段，从而得到蛋白N-端。

以牛血清蛋白和溶菌酶为样品，100μg蛋白溶于100μl6M盐酸胍，加入2μl100mM二硫苏糖醇，56℃变性还原1h后，加入2μl200mMIAA避光反应30min后，采用NaOH将溶液的pH调至10后，往溶液中加入O-甲基异脲进行胍基化，其中O-甲基异脲终浓度为1M，4℃振荡反应24h，反应完成后将溶液pH调回8，然后往溶液中加入DL-甘油醛-3-磷酸和氰基硼氢化纳进行磷酸根标记，其中DL-甘油醛-3-磷酸和氰基硼氢化纳的终浓度分别为12.5mg/ml和0.6M，于37℃反应12h。在以过程中均保持溶液中盐酸胍浓度为6M，防止蛋白的沉淀，并采用不含氨的缓冲液三乙二胺碳酸盐(pH8)。将以上溶液转移至3000Da的超滤膜上，采用50mM碳酸氢铵置换溶液，以去除残余的试剂。加入胰蛋白酶在膜上进行酶解，其中酶用量为样品质量的1/50(w/w)，温度为37℃，pH＝8，酶解12h。将酶解产物除盐并冻干。将冻干样品重溶于上样溶液50％乙腈+5％三氟乙酸中，加入二氧化钛颗粒，其中二氧化钛的用量为样品质量的20倍，室温振荡1h后，分别采用清洗溶液50％乙腈+5％三氟乙酸+100mM氯化钠，80％乙腈+5％三氟乙酸，30％乙腈+0.1％三氟乙酸洗去二氧化钛颗粒上的非特异性吸附，最后采用15％氨水洗脱颗粒上的特异性吸附的带有磷酸根的N-端肽段，收集上清，除盐，冻干，得到蛋白N-端肽段。

Claims (10)

1.一种蛋白质N-端富集方法，包括：

蛋白质样品去除自身的磷酸化翻译后修饰后，通过选择性的胍基化反应封闭蛋白质样品的侧链氨基，然后对蛋白剩余的N-端氨基进行磷酸根标记；对标记的蛋白进行酶解后，亲和富集带有磷酸根标签的N-末端肽段。

2.按照权利要求1所述的蛋白质样品去除自身的磷酸化，其特征在于：蛋白质样品去除自身的磷酸化翻译后修饰，取蛋白提取液于3000-10000Da超滤膜上，将背景溶液置换成1×蛋白金属磷酸酶(PMP)反应缓冲液，加入蛋白酶抑制剂cocktail和终浓度为0.5-5mM的氯化锰,混合均匀后,按蛋白质与酶质量比50:1加入λ蛋白磷酸酶(λ-PPase)，于25-50℃温育1-5h,得到溶液A；蛋白酶抑制剂Cocktail加入量占溶液A的体积百分数范围为0.1％-5％。

3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：选择性胍基化反应封闭蛋白质样品的侧链氨基，

于超滤膜上，往所述的溶液A中加入2-10M盐酸胍，10-100mM二硫苏糖醇，于25-70℃进行变性及二硫键的还原，反应30-120min后，加入20-200mM碘乙酰胺对游离的巯基进行烷基化，于室温避光反应10-120min后，采用氢氧化钠调节pH至9-12，加入O-甲基异脲和盐酸胍或尿素，于4-37℃振荡反应4-36h，得溶液B。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的O-甲基异脲的终浓度范围为0.1-2M，盐酸胍或尿素的终浓度范围为1-6M。

5.按照权利要求1或3所述的方法，其特征在于：所述的对蛋白剩余的N-端氨基进行磷酸根标记，其具体步骤如下，：

将所述的溶液B的pH调节至6-9，加入能与氨基反应且含磷酸根的试剂，保持溶液中的尿素或盐酸胍终浓度为1-6M，于10-60℃振荡反应2-12h；将超滤膜上的溶液进行离心，采用10-100mM的碳酸氢铵进行溶液置换，以去除残余的试剂，得到溶液C；

按蛋白质与酶的质量比50:1于溶液C中加入蛋白水解酶，25-37℃中孵育6-24h后除盐备用。

6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的能与氨基反应且含磷酸根的试剂的终浓度为10-1000mM；当采用带磷酸根的醛基试剂时，另加入终浓度10-600mM的氰基硼氢化纳。

7.按照权利要求1或5所述的方法，其特征在于：所述的亲和富集带有磷酸根标签的N-末端肽段具体步骤如下，将权利要求5所得的溶液上样到磷酸根亲和材料上，材料与蛋白重量比为5-100，吸附后，用清洗溶液去除非特异性吸附后，然后采用洗脱溶液对富集到的标有磷酸根的N-端肽段进行洗脱，并除盐冻干。

8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于：所述磷酸根亲和材料为：二氧化钛，二氧化锆，三氧化铝，固定化铁离子亲和材料，固定化铝离子亲和材料，固定化锆离子亲和材料中的一种；

所述的上样溶液为：体积浓度30-50％乙腈+0.1-5％三氟乙酸，其余为水；清洗溶液分别为体积浓度30-80％乙腈、体积浓度0.1-5％三氟乙酸的混合溶液；洗脱溶液为质量浓度5％-15％氨水。

9.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：采用的蛋白水解酶可为胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，木瓜蛋白酶，弹性蛋白酶，胃蛋白酶，或内肽酶Glu-C。

10.按照权利要求1所述的方法，其可用于简单及复杂样品中蛋白N-端的测序，蛋白异构体的鉴定，或水解酶水解底物及位点的鉴定。