CN116973493A - 一种基于硼亲和色谱的精氨酸二甲基化肽段富集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于硼酸亲和色谱的精氨酸二甲基化肽段富集方法。首先,利用二酮类化合物选择性地封闭全蛋白质酶解液中无修饰与单甲基化修饰的精氨酸侧链胍基;然后,将邻二羰基类化合物与硼亲和色谱材料同时加入肽段溶液中,利用硼亲和色谱材料选择性地捕获由邻二羰基类化合物与二甲基化精氨酸残基反应生成的顺式邻二醇中间体,从而实现精氨酸二甲基化肽段的富集。本方法结合质谱检测及软件分析可规模化鉴定蛋白质中的精氨酸二甲基化修饰位点。与传统的免疫亲和富集法相比,本发明具有富集特异性高,鉴定效果好以及实验成本低等优势。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质组学研究方向甲基化蛋白质组学技术领域,具体涉及精氨酸二甲基化肽段的富集方法。
技术背景
蛋白质精氨酸甲基化是一种非常重要的蛋白质翻译后修饰,在很多生理过程的调控中发挥着重要的作用,比如RNA加工、转录调控、信号转导、DNA修复以及蛋白质间的相互作用等等。虽然精氨酸甲基化对生物体有非常重要的调控作用,但它对精氨酸侧链胍基本身理化性质的改变有限,这使得高效富集精氨酸甲基化肽段较为困难。精氨酸甲基化的修饰类型主要有三种,分别为单甲基化、非对称型二甲基化以及对称型二甲基化,针对这三类甲基化修饰,人们开发了一系列抗体(Geoghegan V.et al.Nature communications,2015,6(1):1-8;Musiani D.et al.Science signaling,2019,12(575):eaat8388.)。但相比之下,抗体更擅长于富集精氨酸单甲基化肽段,而精氨酸二甲基化肽段的富集效果较差。此外,基于抗体的富集方法在单次实验中便需要十毫克的蛋白样品量;同时,抗体价格十分昂贵,抗体生产的批次重现性也往往存在问题。因此,开发成本低、效果好的精氨酸二甲基化肽段富集方法十分重要。
2003年,Lindner等人(Leitner A.et al.Journal of mass spectrometry,2003,38(8):891-899.)报道精氨酸残基可以与2,3-丁二酮反应生成顺势邻二羟基结构,而这一结构又可以和硼酸进一步反应形成稳定的五元环结构。利用这一原理,该课题组(Foettinger A.et al.Journal of Chromatography A,2005,1079(1-2):187-196.)成功通过硼亲和色谱实现了含精氨酸肽段的富集。除了丁二酮之外,精氨酸残基还可以特异性地与1,2-环己二酮(Smith E.L.Methods in enzymology.Academic Press,1977,47:156-161.)反应,生成不可逆的产物。
基于不同甲基化程度的精氨酸残基的反应活性不同,本发明使用二酮类化合物(如1,2-环己二酮)封闭非修饰和单甲基化修饰的精氨酸残基,再利用邻二羰基类化合物和二甲基化精氨酸侧链胍基可反应形成顺式邻二醇结构以及硼亲和色谱可富集含此结构的化合物,首次开发出了一种高选择性的精氨酸二甲基化肽段富集方法,有效地克服了抗体富集过程中存在的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种富集特异性好、富集回收率高的基于利用二羰基类化合物、硼亲和色谱和邻二羰基类化合物的精氨酸二甲基化肽段富集方法,并且克服基于抗体的免疫亲和富集策略中样品使用量过大、实验成本高的缺点。
本发明公开了一种基于硼亲和色谱的精氨酸二甲基化肽段富集方法,使用二酮类化合物选择性地与蛋白质酶解肽段或肽段混合物上无修饰与修饰有单个甲基基团的精氨酸侧链胍基反应,从而降低这两类胍基基团的化学反应活性;然后利用邻二羰基类化合物特异性地在修饰有两个甲基基团的精氨酸侧链胍基上修饰一个顺式邻二醇基团,并同时使用修饰有硼酸基团的色谱材料捕获此顺式邻二醇基团,从而实现精氨酸二甲基化肽段的特异性富集。
1.所述方法中蛋白质酶解肽段的获取过程包括蛋白质样品酶解,得到蛋白酶解液;加入氨基封闭试剂反应;除盐、干燥,得到肽段混合物;
具体过程为:
(a)1mg蛋白质样品分散于0.2~2mL摩尔浓度为10~200mM的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲水溶液或三乙胺碳酸盐缓冲水溶液中,缓冲水溶液的pH在7.0~9.0之间;加入蛋白酶酶解分散于缓冲液中的蛋白质样品,得到蛋白酶解液;
(b)蛋白酶解液中加入氨基封闭试剂进行反应;反应结束后,对样品进行除盐操作,随后使用真空冷冻干燥法将样品冻干,得到肽段混合物A;
2.所述方法中步骤1-(a)所述的蛋白质样品来源包括动物细胞、植物细胞、动物组织、植物组织或其他来源中的一种或两种以上;优选,实验室可培养的动物癌细胞来源的蛋白质样品;
步骤1-(a)所述的蛋白酶为胰蛋白酶、赖氨酰内切酶、梭菌蛋白酶、金黄色葡萄球菌V8蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶B等蛋白酶中的一种或两种以上蛋白酶组合,但不局限于这些酶中的一种或两种以上,步骤1-(a)所述酶解的条件为:蛋白酶与蛋白质样品的质量比在1:10-1:100之间,酶切时长为1~24h,羧肽酶B的酶切温度为37~55℃,其他蛋白酶的酶切温度为20~37℃;
优选,先使用胰蛋白酶酶切,再使用梭菌蛋白酶切,最后使用羧肽酶B进一步酶切,三种蛋白酶与蛋白质样品的质量比均在1:20-1:100范围内;前两步酶切的反应温度均为35~37℃,反应时长为14~16h;第三步酶切的反应温度为47~50℃,反应时长为1.5~2h。
3.所述方法中步骤1-(b)所述的氨基封闭试剂为氰基硼氢化钠与甲醛的组合,但不局限于这类与氨基反应的试剂,步骤1-(b)所述反应的条件为:步骤1-(a)获得的蛋白酶解液中加入20~200μL摩尔浓度为0.3-1.0M的氰基硼氢化钠和20~200μL质量浓度为1~10%甲醛水溶液,反应温度为20~40℃,反应时间为0.2~2h。
4.所述方法中步骤1-(b)所述的除盐采用的是C18微球填充的固相微萃取柱或是Waters公司开发的HLB填料填充的固相微萃取柱。
5.在所述方法1-4的基础上,精氨酸二甲基化肽段的富集步骤为:
(1)取100μg肽段混合物(A)复溶于50~100μL摩尔浓度为100~400mM的氢氧化钠水溶液中,加入二酮类化合物进行反应;反应结束后,使用浓度为0.05~12M的盐酸水溶液调节溶液pH至约5~9之间,得肽段混合物B;
(2)在肽段混合物B中加入100~250μL摩尔浓度为25~50mM的三乙胺碳酸盐缓冲液,缓冲液的pH在10~11之间,再加入摩尔浓度为0.1~1M氯化钠水溶液至氯化钠终浓度为40~100mM,最后再加入邻二羰基类化合物和5~80μL修饰有硼酸基团的色谱材料,放置于10~25℃反应0.5~2h;反应结束后,过滤收集色谱材料,使用摩尔浓度为5~25mM的三乙胺碳酸盐缓冲液清洗色谱材料3~6次,每次使用溶液的体积为20~100μL,缓冲液的pH在9.6~10.2之间;最后,使用酸性水溶液对吸附在色谱填料上的肽段进行洗脱,之后使用真空冷冻干燥法将洗脱液冻干,得到粗提的精氨酸二甲基化肽段;
(3)取5~20μL强阳离子交换色谱填料制备的固相微萃取柱,用洗脱缓冲液清洗柱体2~6次,每次使用溶液的体积为5~40μL;再用上样缓冲液清洗柱体2~6次,每次使用溶液的体积为5~40μL;将粗提的精氨酸二甲基化肽段复溶于40~100μL的上样缓冲液中,并将其上样至固相微萃取柱中,再用除杂缓冲液清洗柱体2~6次,每次使用溶液的体积为5~20μL;最后,用40~100μL的洗脱缓冲液洗脱吸附在柱上的肽段,得到洗脱产物;将洗脱产物放置于20~37℃中孵育0.4~2h,随后将其冻干,得到精氨酸二甲基化肽段。
6.所述方法中步骤5-(1)所述的二酮类化合物为1,2-环己二酮,但不局限于这种与无修饰或单甲基化修饰的精氨酸侧链胍基发生反应的试剂,步骤5-(1)所述反应的条件为:在复溶的肽段混合物A中加入1,2-环己二酮至1,2-环己二酮的终浓度为10~40mM,反应温度为30~40℃,反应时间为0.5~2h。
7.所述方法中步骤5-(2)所述的邻二羰基类化合物为丙酮醛,但不局限于这种可与精氨酸侧链胍基反应生成顺式邻二醇结构的试剂,步骤5-(2)所述反应的具体条件为:1~5μL质量浓度10~40%的丙酮醛水溶液被投入到反应体系中;
步骤5-(2)所述的修饰有硼酸基团的色谱填料为硼酸基团、不同间隔臂以及琼脂糖材料组合而成的色谱材料,间隔臂的类型包括苯、氨基苯、羧基苯中的一种或两种以上、长度为3~12个原子的碳链等基团或基团组合;
优选,修饰有m-氨基苯硼酸的琼脂糖色谱填料。
8.所述方法中步骤5-(2)所述的酸性水溶液包括体积浓度0.01~0.2%的甲酸水溶液、体积浓度0.01~0.2%的三氟乙酸水溶液、1~10mM的盐酸水溶液、1~10mM硫酸水溶液或1~10mM硝酸水溶液中的一种或两种以上,洗脱肽段所用酸性水溶液的体积为250~500μL。
9.所述方法中:
步骤5-(3)所述的上样缓冲液为有机溶剂与缓冲盐水溶液按照一定比例混合而成的溶液;有机溶剂类型包括甲醇、乙醇、乙腈等试剂中的一种或两种以上的试剂组合,但不局限于这些有机溶剂中的一种或两种以上,有机溶剂在上样缓冲液中的体积浓度在10~30%之间;缓冲盐水溶液中缓冲盐的类型包括磷酸二氢钾,磷酸二氢钠中的一种或两者的组合,但不局限于这些缓冲盐中的一种或两种以上;缓冲盐在水溶液中的摩尔浓度为5~15mM,缓冲盐水溶液的pH在2.0~3.0之间;
步骤5-(3)所述的除杂缓冲液为有机溶剂与酸性水溶液按照一定比例混合而成的溶液;有机溶剂类型包括甲醇、乙醇、乙腈等试剂中的一种或两种以上的试剂组合,但不局限于这些有机溶剂中的一种或两种以上,有机溶剂在除杂缓冲液中的体积浓度在10~30%之间;酸性水溶液中酸的类型包括三氟乙酸,乙酸或甲酸,但不局限于这些酸中的一种或两种以上,酸在酸性水溶液中的体积浓度在0.005~0.1%之间;
步骤5-(3)所述的洗脱缓冲液为有机溶剂与碱性水溶液按照一定比例混合而成的溶液;有机溶剂类型包括甲醇、乙醇、乙腈等试剂中的一种或两种以上的试剂组合,但不局限于这些有机溶剂中的一种或两种以上,有机溶剂在洗脱缓冲液中的体积浓度在10~30%之间;碱性水溶液中碱的类型包括氨、单甲基氨、二甲基氨、三甲基氨或三乙基氨,但不局限于这些碱中的一种或两种以上,碱在碱性水溶液中的质量浓度在0.5~2%之间。
本方法结合质谱检测及软件分析可规模化鉴定蛋白质中的精氨酸二甲基化修饰位点。与传统的免疫亲和富集法相比,本发明具有富集回收率高、富集特异性高、鉴定结果好以及实验成本低等优势。
本发明具有如下特性:
1.实验所需的蛋白样品量很低。相比免疫亲和富集需要高达10mg的蛋白样品,本方法所需蛋白用量小于0.5mg。
2.富集特异性高。使用液质联用分析富集所得的肽段,本方法鉴定到的精氨酸二甲基化肽段数目占总肽段鉴定数目的比例高达20~50%,而免疫亲和富集法的富集特异性小于15%。
3.可以同时富集非对称型精氨酸二甲基化肽段和对称型精氨酸二甲基化肽段。
4.实验成本低。免疫亲和富集法所用的抗体价格昂贵,而本方法所用的化学试剂价格便宜。
附图说明
图1为所述一种基于硼亲和色谱的精氨酸二甲基化肽段富集方法的实验流程图。CHD为1,2-环己二酮的简称。
图2为使用本方法从合成肽段混合物中富集精氨酸二甲基化肽段的效果测试。四幅图均为肽段的MALDI质谱谱图。本实验使用了四条合成肽段,其序列均为GGNFSGRGGFGGS,但是四条肽段序列第七位精氨酸残基(R)所带的修饰不同,分别为无修饰、单甲基化修饰、非对称型二甲基化修饰以及对称型二甲基化修饰。四条肽段的N末端氨基首先被二甲基标记(使得它们在MALDI谱图中的质荷比分别为1184、1198、1212和1218),随后将这些肽段按照一定的比例混合。(A)无修饰、单甲基化修饰以及非对称型二甲基化修饰的合成肽段按照2:2:1的比例混合。(B)无修饰、单甲基化修饰以及对称型二甲基化修饰的合成肽段按照2:2:1的比例混合。(C)使用本方法处理(A)所述的合成肽段混合物后所得的产物。(D)使用本方法处理(B)所述的合成肽段混合物后所得的产物。
图3为使用本方法从牛血清白蛋白的胰蛋白酶酶解液中富集精氨酸二甲基化肽段的效果测试。四幅图均为肽段的MALDI质谱谱图。牛血清白蛋白被胰蛋白酶酶切后,将其与合成精氨酸二甲基化肽段按照100:1的质量比混合,随后将肽段上所有的伯胺基团二甲基标记。本实验使用了两条合成精氨酸二甲基化肽段,肽段序列均为GGNFSGRGGFGGSR,但是两条肽段序列第七位精氨酸残基上的二甲基化修饰不同,其中一条为非对称型二甲基化,另一条为对称型二甲基化。在伯胺基团被二甲基标记之后,两条肽段在MALDI谱图中的质荷比分别为1368和1374。(A)酶解牛血清白蛋白所得肽段与非对称型精氨酸二甲基化肽段混合所得产物,肽段混合物上的伯胺基团全部被二甲基标记。(B)酶解牛血清白蛋白所得肽段与对称型精氨酸二甲基化肽段混合所得产物,肽段混合物上的伯胺基团全部被二甲基标记。(C)使用本方法富集(A)所述肽段混合物中的精氨酸二甲基化肽段。由于精氨酸二甲基化肽段C末端无修饰精氨酸残基与1,2-环己二酮反应,故非对称型精氨酸二甲基化肽段在MALDI谱图中的最终质荷比为1462。(D)使用本方法富集(B)所述肽段混合物中的精氨酸二甲基化肽段。由于精氨酸二甲基化肽段C末端无修饰精氨酸残基与1,2-环己二酮反应,故对称型精氨酸二甲基化肽段在MALDI谱图中的最终质荷比为1468。
图4为使用不同方法所鉴定到的Jurkat T细胞中的精氨酸二甲基化位点的数量。除了使用本方法,本图还对比了两种基于抗体的富集方法,两种抗体分别可以识别非对称型二甲基化精氨酸(aDMA)和对称型二甲基化精氨酸(sDMA)。图中所示的RG和RGG序列类型为甲基化位点处于RG和RGG序列上。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1
一种基于硼亲和色谱的精氨酸二甲基化肽段富集方法用于富集合成肽段混合物中的精氨酸二甲基化肽段。
(1)取四条合成肽段(序列均为GGNFSGRGGFGGSR,但第七位精氨酸残基的修饰不同,分别是无修饰、单甲基化、非对称型二甲基化以及对称型二甲基化)各100μg,分别溶解于200μL 100mM的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液(pH 7.65)。随后,向四份肽段溶液中各加入2μg羧肽酶B,放置于50℃中孵育2h以切除C末端的精氨酸残基。酶切结束后,对于对称型精氨酸二甲基化肽段溶液,加入8μL质量浓度4%的氘代甲醛水溶液和8μL 0.6M氘代氰基硼氢化钠水溶液;对于其他三条肽段,加入8μL质量浓度4%的甲醛水溶液和8μL0.6M氰基硼氢化钠水溶液,然后将四组溶液放置于25℃中反应1h。随后,向四组溶液中各加入20μL1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH 7.0)以淬灭反应,并将样品除盐冻干。
(2)分别将四条二甲基化标记的肽段复溶于水中,至终浓度为0.5μg/μL。分别取2μg精氨酸无修饰肽段、2μg精氨酸单甲基化肽段以及1μg非对称型精氨酸二甲基化肽段加入到50μL200mM的氢氧化钠水溶液中,再加入0.5M环己二酮至终浓度为20mM。另配置相同的反应溶液一份,但是将非对称精氨酸二甲基化肽段换位对称型精氨酸二甲基化肽段。混匀后,将溶液放置在37℃中孵育40min。反应结束后,加入400mM盐酸调溶液pH到7.0左右,并加入50μL 100mM氯化钠水溶液、125μL 25mM三乙胺碳酸盐缓冲液(pH 10.2-10.4)、1.54μL质量浓度40%的丙酮醛溶液和40μL修饰有m-氨基苯硼酸的琼脂糖微球(Sigma公司生产,货号为A8312)。琼脂糖微球在加入之前,先用体积浓度0.1%的甲酸水溶液洗三次,每次使用的溶液体积为微球体积的三倍;再用10mM三乙胺碳酸盐缓冲液(pH 10.0)洗三次,每次使用的溶液体积为微球体积的三倍。将上述物质混匀后,放置到15℃中孵育1h。反应结束后,将溶液滤掉,用50μL 10mM三乙胺碳酸盐缓冲液(pH 10.0)洗涤微球,洗涤重复四次。吸附在微球上的肽段用0.1%甲酸水溶液洗脱,每次用50μL,共洗脱5次。然后,合并洗脱液,并将其冻干。最后,用碱性溶液(体积比:70%氨水/30%乙腈,氨水质量浓度为1%)将其复溶,再将其放在室温中静置1h。
(3)使用MALDI质谱检测富集前后样品中肽段的种类,所检测样品的类型如附图说明2所述,检测结果如图2所示。结合图2(A)和图2(C)所示,本方法成功从含有无修饰和单甲基化修饰精氨酸残基的肽段混合物中富集到了非对称型精氨酸二甲基化肽段;而结合图2(B)和图2(D)所示,本方法成功从含有无修饰和单甲基化修饰精氨酸残基的肽段混合物中富集到了对称型精氨酸二甲基化肽段。
实施例2
一种基于硼亲和色谱的精氨酸二甲基化肽段富集方法从牛血清白蛋白的胰蛋白酶酶解液中富集合成的精氨酸二甲基化肽段。
(1)将100μg牛血清白蛋白溶解于100μL裂解液(于水中100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸、6M盐酸胍、10mM三(2-羧乙基)膦和40mM氯代乙酰胺,pH 7.4)中,将其加热至100℃反应5min,以使其蛋白上所有半胱氨酸残基烷基化。待样品冷却后,使用10-KDa超滤管过滤溶液。超滤结束后,保留超滤膜上的蛋白,丢弃滤掉的溶液,并在滤膜上加入与裂解水溶液等体积的100mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸溶液(pH 7.9)。随后,向溶液中加入1μg胰蛋白酶,放置于37℃下孵育16h。
(2)酶切结束后,再次使用10-KDa超滤管超滤溶液,并收集滤液。按照上述方法制备两份牛血清白蛋白的胰蛋白酶酶解液,分别加入1μg附图说明3所述两条合成精氨酸二甲基化肽段(两条合成肽段均未经任何处理)。按照实施例1的步骤(1)中所述方法,使用甲醛和氰基硼氢化钠对酶解液中所有肽段的伯胺基团进行二甲基标记(过程和条件同实施例1的步骤(1)),随后,将其除盐并冻干。其中,混有对称型与非对称型精氨酸二甲基化肽段的酶解液所用的标记试剂不同,前者全部用氘代试剂,后者全部用非氘代试剂。
(3)将肽段复溶于50μL 200mM NaOH水溶液中,然后按照实施例1的步骤(2)中所述方法富集精氨酸二甲基化肽段(过程和条件同实施例1的步骤(2))。
(4)使用MALDI质谱检测富集前后样品中的肽段种类,所检测样品的类型如附图说明3所述,检测结果如图3所示。结合图3(A)和图3(C)所示,本方法可以从牛血清白蛋白的胰蛋白酶酶解液中富集非对称型精氨酸二甲基化肽段;而结合图3(B)和图3(D)所示,本方法可以从牛血清白蛋白的胰蛋白酶酶解液中富集对称型精氨酸二甲基化肽段。
实施例3
一种基于硼亲和色谱的精氨酸二甲基化肽段富集方法用于Jurkat T细胞中精氨酸二甲基修饰位点的鉴定。
(1)向1e7个Jurkat T细胞中加入250μL裂解液(6M盐酸胍,100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸,pH=8.5)、5μL 0.5M三(2-羧乙基)膦和20μL 0.5M氯代乙酰胺,在100℃下反应5min。待冰浴冷却后,使用超声波细胞破碎仪裂解细胞,裂解得到的蛋白酶解液在100℃下继续反应5min,之后在4℃下8000rpm离心30min去除细胞碎片。向离心得到的上清中加入等体积4℃纯水,再加入8倍体积-20℃丙酮,混匀后放置于-20℃下过夜。
(2)在4℃下,2000rpm离心蛋白样品15min,去除上清,加入-20℃体积浓度为80%的丙酮洗涤沉淀两次,室温下晾置10min去除丙酮。在蛋白沉淀中加入400μL 100mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液(PH=7.9),然后超声将其分散均匀,并加入一定量的胰蛋白酶(蛋白:酶=50:1),使其在37℃下酶解蛋白16h。反应结束后,酶解液在100℃下孵育10min用于灭活胰蛋白酶;待酶解液冷却后,加入400μL缓冲液(100mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸,10mM二硫苏糖醇,0.4mM乙二胺四乙酸,pH=7.65)和8.5μL0.5M氯化钙水溶液,混匀后加入梭菌蛋白酶(酶的用量与胰蛋白酶相同),37℃下继续酶解16h。酶解结束后,加入32μL0.5M氯代乙酰胺水溶液,100℃下反应10min使梭菌蛋白酶变性并消耗剩余二硫苏糖醇;待溶液冷却后,加入羧肽酶B(与胰蛋白酶用量相同),50℃下酶解2h。
(3)加入90μL1M 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸水溶液、80μL 0.6M氰基硼氢化钠水溶液和80μL质量浓度为4%的甲醛水溶液,混匀后在30℃和1500rpm下反应1h。反应结束后,加入200μL 1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH=7.0)继续反应30min;此后,加入TFA至1%(V/V)将溶液酸化,高转速离心去除产生的气泡;最后,用HLB除去样品中的盐分,用nanodrop测其中肽段浓度,按100μg每管分装冻干样品。
(4)将100μg肽段复溶于50μL 200mM氢氧化钠水溶液中,加入0.5M 1,2-环己二酮至终浓度为20mM,在37℃下反应40min。反应结束后,加入0.4M盐酸回调溶液pH至中性附近,再加入125μL 25mM三乙胺碳酸盐缓冲液(pH 10.2)、50μL 100mM氯化钠溶液、40μL修饰有m-氨基苯硼酸的琼脂糖微球材料(Sigma公司生产,货号A8312)以及1.54μL质量浓度40%的丙酮醛溶液,15℃以及1500rpm条件下反应1h。在琼脂糖微球加入前,按照实施例1步骤(2)所述过程和条件对其进行清洗。反应结束后,将悬浮液转移至自制tip中,过滤去除溶液,再用50μL 10mM三乙胺碳酸盐缓冲液(pH10.0)清洗微球,清洗重复4次。最后用250μL体积浓度0.1%的甲酸水溶液洗脱富集的肽段,每次用50μL,每两次操作间隔5min;洗脱完成后,合并所有洗脱液,并将其冻干保存。
(5)将冻干后的肽段复溶于60μL 80%磷酸盐缓冲液(5mM磷酸二氢钾,pH=2.7)/20%乙腈(V/V)。将5μL强阳离子交换色谱填料加入自制tip柱中,用70%氨水溶液(质量浓度1%的氨水)/30%乙腈(V/V)清洗柱体3次,每次使用的溶液体积为20μL;再用80%磷酸盐缓冲液(5mM磷酸二氢钾,pH=2.7)/20%乙腈(V/V)清洗柱体6次,每次使用溶液的体积为20μL。随后,将60μL肽段溶液分三次上样,再用15μL 70%三氟乙酸水溶液(体积浓度0.01%的三氟乙酸水溶液)/30%乙腈(V/V)清洗柱体。最后,用20μL 70%氨水溶液(质量浓度1%的氨水)/30%乙腈(V/V)洗脱肽段,洗脱重复3次。合并所有洗脱液,并将其放置于室温1h,最后再将其冻干保存。
(6)重复上述实验三次,分别将冻干样品复溶于15μL体积浓度0.1%甲酸水溶液,并用LC-MS对样品进行检测。所得质谱文件采用蛋白质组学分析软件Maxquant进行数据检索,平均单针质谱分析可鉴定到273个精氨酸二甲基化位点。重复上述实验六次,每两个样品合并为一个样品,则平均单针质谱分析可鉴定到313个精氨酸二甲基化位点。本案例同时使用抗体方法富集精氨酸二甲基化肽段,所使用的是Cell Signaling Technology公司针对非对称型二甲基化精氨酸(aDMA)和对称型二甲基化精氨酸(sDMA)开发的抗体富集试剂盒(货号分别为13474和13563),使用方法为试剂盒说明书所述方法。如图4所示,相比抗体方法,本方法可以鉴定到更多的精氨酸二甲基化位点。此外,本方法特别擅长于鉴定处于RG和RGG序列上的精氨酸二甲基化位点,相比抗体方法,其鉴定数量可提高一倍。
Claims (10)
1.一种基于硼亲和色谱的精氨酸二甲基化肽段富集方法,其特征在于:
使用二酮类化合物选择性地与蛋白质酶解肽段或肽段混合物上无修饰与修饰有单个甲基基团的精氨酸侧链胍基反应,从而降低这两类胍基基团的化学反应活性;然后利用邻二羰基类化合物特异性地在修饰有两个甲基基团的精氨酸侧链胍基上修饰一个顺式邻二醇基团,并同时使用修饰有硼酸基团的色谱材料捕获此顺式邻二醇基团,从而实现精氨酸二甲基化肽段的特异性富集。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,蛋白质酶解肽段的获取过程包括蛋白质样品酶解,得到蛋白酶解液;加入氨基封闭试剂反应;除盐、干燥,得到肽段混合物;
具体过程为:
(a)1mg蛋白质样品分散于0.2~2mL摩尔浓度为10~200mM的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲水溶液或三乙胺碳酸盐缓冲水溶液中,缓冲水溶液的pH在7.0~9.0之间;加入蛋白酶酶解分散于缓冲液中的蛋白质样品,得到蛋白酶解液;
(b)蛋白酶解液中加入氨基封闭试剂进行反应;反应结束后,对样品进行除盐操作,随后使用真空冷冻干燥法将样品冻干,得到肽段混合物A。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤(a)所述的蛋白质样品来源包括动物细胞、植物细胞、动物组织、植物组织或其他来源中的一种或两种以上;优选,实验室可培养的动物癌细胞来源的蛋白质样品;
步骤(a)所述的蛋白酶为胰蛋白酶、赖氨酰内切酶、梭菌蛋白酶、金黄色葡萄球菌V8蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶B等蛋白酶中的一种或两种以上蛋白酶组合,但不局限于这些酶中的一种或两种以上,步骤(a)所述酶解的条件为:蛋白酶与蛋白质样品的质量比在1:10-1:100之间,酶切时长为1~24h,羧肽酶B的酶切温度为37~55℃,其他蛋白酶的酶切温度为20~37℃;
优选,先使用胰蛋白酶酶切,再使用梭菌蛋白酶切,最后使用羧肽酶B进一步酶切,三种蛋白酶与蛋白质样品的质量比均在1:20-1:100范围内;前两步酶切的反应温度均为35~37℃,反应时长为14~16h;第三步酶切的反应温度为47~50℃,反应时长为1.5~2h。
4.如权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤(b)所述的氨基封闭试剂为氰基硼氢化钠与甲醛的组合,但不局限于这类与氨基反应的试剂,步骤(b)所述反应的条件为:步骤(a)获得的蛋白酶解液中加入20~200μL摩尔浓度为0.3-1.0M的氰基硼氢化钠和20~200μL质量浓度为1~10%甲醛水溶液,反应温度为20~40℃,反应时间为0.2~2h。
5.如权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤(b)所述的除盐采用的是C18微球填充的固相微萃取柱或是Waters公司开发的HLB填料填充的固相微萃取柱。
6.如权利要求1-5任一所述的方法,其特征在于,该方法的步骤为:
(1)取100μg肽段混合物(A)复溶于50~100μL摩尔浓度为100~400mM的氢氧化钠水溶液中,加入二酮类化合物进行反应;反应结束后,使用浓度为0.05~12M的盐酸水溶液调节溶液pH至约5~9之间,得肽段混合物B;
(2)在肽段混合物B中加入100~250μL摩尔浓度为25~50mM的三乙胺碳酸盐缓冲液,缓冲液的pH在10~11之间,再加入摩尔浓度为0.1~1M氯化钠水溶液至氯化钠终浓度为40~100mM,最后再加入邻二羰基类化合物和5~80μL修饰有硼酸基团的色谱材料,放置于10~25℃反应0.5~2h;反应结束后,过滤收集色谱材料,使用摩尔浓度为5~25mM的三乙胺碳酸盐缓冲液清洗色谱材料3~6次,每次使用溶液的体积为20~100μL,缓冲液的pH在9.6~10.2之间;最后,使用酸性水溶液对吸附在色谱填料上的肽段进行洗脱,之后使用真空冷冻干燥法将洗脱液冻干,得到粗提的精氨酸二甲基化肽段;
(3)取5~20μL强阳离子交换色谱填料制备的固相微萃取柱,用洗脱缓冲液清洗柱体2~6次,每次使用溶液的体积为5~40μL;再用上样缓冲液清洗柱体2~6次,每次使用溶液的体积为5~40μL;将粗提的精氨酸二甲基化肽段复溶于40~100μL的上样缓冲液中,并将其上样至固相微萃取柱中,再用除杂缓冲液清洗柱体2~6次,每次使用溶液的体积为5~20μL;最后,用40~100μL的洗脱缓冲液洗脱吸附在柱上的肽段,得到洗脱产物;将洗脱产物放置于20~37℃中孵育0.4~2h,随后将其冻干,得到精氨酸二甲基化肽段。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述的二酮类化合物为1,2-环己二酮,但不局限于这种与无修饰或单甲基化修饰的精氨酸侧链胍基发生反应的试剂,步骤(1)所述反应的条件为:在复溶的肽段混合物A中加入1,2-环己二酮至1,2-环己二酮的终浓度为10~40mM,反应温度为30~40℃,反应时间为0.5~2h。
8.如权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤(2)所述的邻二羰基类化合物为丙酮醛,但不局限于这种可与精氨酸侧链胍基反应生成顺式邻二醇结构的试剂,步骤(2)所述反应的具体条件为:1~5μL质量浓度10~40%的丙酮醛水溶液被投入到反应体系中;
步骤(2)所述的修饰有硼酸基团的色谱填料为硼酸基团、不同间隔臂以及琼脂糖材料组合而成的色谱材料,间隔臂的类型包括苯、氨基苯、羧基苯中的一种或两种以上、长度为3~12个原子的碳链等基团或基团组合;
优选,修饰有m-氨基苯硼酸的琼脂糖色谱填料。
9.如权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤(2)所述的酸性水溶液包括体积浓度0.01~0.2%的甲酸水溶液、体积浓度0.01~0.2%的三氟乙酸水溶液、1~10mM的盐酸水溶液、1~10mM硫酸水溶液或1~10mM硝酸水溶液中的一种或两种以上,洗脱肽段所用酸性水溶液的体积为250~500μL。
10.如权利要求6所述的方法,其特征在于,
步骤(3)所述的上样缓冲液为有机溶剂与缓冲盐水溶液按照一定比例混合而成的溶液;有机溶剂类型包括甲醇、乙醇、乙腈等试剂中的一种或两种以上的试剂组合,但不局限于这些有机溶剂中的一种或两种以上,有机溶剂在上样缓冲液中的体积浓度在10~30%之间;缓冲盐水溶液中缓冲盐的类型包括磷酸二氢钾,磷酸二氢钠中的一种或两者的组合,但不局限于这些缓冲盐中的一种或两种以上;缓冲盐在水溶液中的摩尔浓度为5~15mM,缓冲盐水溶液的pH在2.0~3.0之间;
步骤(3)所述的除杂缓冲液为有机溶剂与酸性水溶液按照一定比例混合而成的溶液;有机溶剂类型包括甲醇、乙醇、乙腈等试剂中的一种或两种以上的试剂组合,但不局限于这些有机溶剂中的一种或两种以上,有机溶剂在除杂缓冲液中的体积浓度在10~30%之间;酸性水溶液中酸的类型包括三氟乙酸,乙酸或甲酸,但不局限于这些酸中的一种或两种以上,酸在酸性水溶液中的体积浓度在0.005~0.1%之间;
步骤(3)所述的洗脱缓冲液为有机溶剂与碱性水溶液按照一定比例混合而成的溶液;有机溶剂类型包括甲醇、乙醇、乙腈等试剂中的一种或两种以上的试剂组合,但不局限于这些有机溶剂中的一种或两种以上,有机溶剂在洗脱缓冲液中的体积浓度在10~30%之间;碱性水溶液中碱的类型包括氨、单甲基氨、二甲基氨、三甲基氨或三乙基氨,但不局限于这些碱中的一种或两种以上,碱在碱性水溶液中的质量浓度在0.5~2%之间。
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