CN114599971A - 肽纯化配制物和方法 - Google Patents

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Abstract

描述用于从生物样品中纯化肽的改善配制物和用于从生物样品(例如，细胞和组织)中纯化肽的方法和试剂盒，以及纯化的肽(例如，衍生自蛋白质消化物的多肽)在质谱(例如，LC‑MS)应用中的用途。

Description

肽纯化配制物和方法
技术领域
描述用于从生物样品中纯化肽的配制物和用于从生物样品中纯化肽(例如，衍生自蛋白质消化物的多肽)的方法和试剂盒，以及纯化的肽在下游应用如质谱中的用途。
背景技术
质谱(MS)为用于分析包括翻译后修饰的蛋白质以及其氨基酸序列的强大工具。制备用于MS分析的蛋白质样品的典型方法为首先用酶(例如，胰蛋白酶、Lys-C等)消化蛋白质以产生较小肽片段的混合物，并且随后在LC-MS系统上分析片段以萃取定性和/或定量蛋白质组学信息(本文称为“自下而上”蛋白质组学工作流程)。在典型的“自下而上”蛋白质组学工作流程中，蛋白质通常需要在消化之前从生物样品中萃取。生物样品(例如，组织、培养的细胞和生物流体)为复杂的基质，其含有各种小分子、碳水化合物、脂质、核酸、盐、肽和蛋白质。许多这些组分原产于生物样品，而一些在样品制备期间添加以改善蛋白质的溶解度、对蛋白质/肽引入期望的化学修饰，或在蛋白质消化期间维持蛋白水解活性的最佳pH。重要的是在LC-MS分析之前从样品基质中去除尽可能多的非肽物种，以防止色谱干扰、电离抑制和LC管道组件的堵塞。这个净化步骤通常称为“样品脱盐”。传统上，此程序为使用固相萃取(SPE)色谱在反相树脂上执行的，其中首先将样品酸化，并且然后在水溶液中加载到树脂上。一旦将样品加载到树脂上，就用水溶液洗涤树脂以去除小的亲水性分子和离子。肽通过疏水性相互作用仍然与树脂结合，并且用含有有机溶剂的酸性溶液(例如，50％乙腈水溶液)洗脱。这种脱盐方法的缺点为疏水性分子如脂质和去污剂也与树脂结合并且与肽样品共同洗脱。结果，肽样品被疏水性分子污染，这可导致数据质量差并且损坏LC设备。因此，需要改善的配制物、替代的固定相和脱盐溶液配制物以及用于从生物样品中纯化蛋白质和肽的方法，由此蛋白质和肽对于通过LC-MS进行高质量分析而言为足够纯的。
发明内容
在一方面，本文公开用于纯化包括肽的样品的方法和试剂盒。样品包括生物来源的样品、合成制备的样品以及其组合。在一些实施例中，肽包括2-50个氨基酸残基。在一些实施例中，样品包括两种或更多种肽。在一些实施例中，样品为消化的蛋白质或多肽。样品可另外包括盐、去污剂、脂质、小的中性分子或其组合。样品可另外包括一种或多种污染物。污染物可为亲水性污染物，如中性污染物、阴离子污染物或其组合。在一些实施例中，样品包括疏水性污染物，如脂质或去污剂。在一些实施例中，亲水性污染物为盐、核酸或碳水化合物。在一些实施例中，样品包括单价阳离子污染物，如铵、钠、钾、三(羟甲基)氨基甲烷(tris)、羟胺、乙醇胺、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)(PIPES)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸(EPPS)、甘氨酸、质量标签或其组合。在一些实施例中，单价阳离子污染物为或包括质量标签或其衍生物。
在另一方面，提供纯化样品(例如，生物样品)的方法，其包括：
(a)在酸性条件下使生物样品与疏水性聚合物基阳离子交换材料接触，使得样品与阳离子交换材料结合，其中样品包括：(i)肽，和(ii)单价阳离子污染物和/或疏水性污染物；
(b)用酸性溶液洗涤阳离子交换材料，其中酸性溶液包括大于20％(v/v)的挥发性有机溶剂、水和挥发性盐，使得肽保留在阳离子交换材料上并且从阳离子交换材料中去除单价阳离子和/或疏水性污染物；和
(c)用碱性或中性溶液从阳离子交换材料中洗脱保留的肽，其中碱性或中性溶液包括挥发性有机溶剂、水和选自挥发性碱、挥发性盐以及其组合的挥发性化合物。
在又另一方面，提供纯化样品(例如，生物样品)的方法，其包括：
(a)在酸性条件下使生物样品与疏水性聚合物基阳离子交换材料接触，使得样品与阳离子交换材料结合，其中样品包括：(i)肽、(ii)单价阳离子污染物和/或疏水性污染物，和(iii)亲水性污染物；
(b)用第一酸性溶液洗涤阳离子交换材料，其中第一酸性溶液包括大于20％(v/v)的挥发性有机溶剂、水和挥发性盐，使得肽保留在阳离子交换材料上并且从阳离子交换材料中去除单价阳离子和/或疏水性污染物；
(c)用第二酸性溶液洗涤阳离子交换材料，其中第二酸性溶液包括20％或更少(v/v)的挥发性有机溶剂、水和挥发性酸，其中肽保留在阳离子交换材料上并且去除亲水性污染物；和
(d)用碱性或中性溶液从阳离子交换材料中洗脱保留的肽，其中碱性或中性溶液包括挥发性有机溶剂、水和选自挥发性碱、挥发性盐以及其组合的挥发性化合物。
在又另一方面，提供纯化样品(例如，生物样品)的方法，其包括：
(a)在酸性条件下使生物样品与疏水性聚合物基阳离子交换材料接触，使得样品与阳离子交换材料结合，其中生物样品包括：(i)肽、(ii)单价阳离子污染物和/或疏水性污染物，和(iii)亲水性污染物；
(b)用第一酸性溶液洗涤阳离子交换材料，其中第一酸性溶液包括20％或更少(v/v)的挥发性有机溶剂、水和挥发性酸，使得肽保留在阳离子交换材料上并且从阳离子交换材料中去除亲水性污染物；
(c)用第二酸性溶液洗涤阳离子交换材料，其中第二酸性溶液包括大于20％(v/v)的挥发性有机溶剂、水和挥发性盐，其中肽保留在阳离子交换材料上并且从阳离子交换材料中去除单价阳离子和/或疏水性污染物；和
(d)用碱性或中性溶液从阳离子交换材料中洗脱保留的肽，其中碱性或中性溶液包括挥发性有机溶剂、水和选自挥发性碱、挥发性盐以及其组合的挥发性化合物。
在本文公开的方法中的任一个中，样品可在pH 1-5下与疏水性聚合物基阳离子交换材料接触；阳离子交换材料可在pH 1-5下洗涤；和/或样品可在大于pH 5(例如，5-11)下从阳离子交换材料中洗脱。在某些方法中，保留的肽可用碱性或中性溶液从阳离子交换材料中洗脱，其中碱性或中性溶液包括挥发性有机溶剂、水和挥发性盐。在某些实施例中，本文公开的方法可另外包括在使生物样品与阳离子交换材料接触之前，用蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶或Lys-C)处理生物样品以产生肽。
在又另一方面，提供用于纯化包括肽的生物样品的试剂盒。试剂盒可包括：(a)疏水性聚合物基阳离子交换材料；(b)包括挥发性盐、水和大于20％(v/v)的挥发性有机溶剂的酸性溶液；(c)包括挥发性碱、水和挥发性有机溶剂的中性或碱性溶液；和(d)使用试剂盒纯化生物样品的说明。
在又另一方面，提供用于纯化包括肽的生物样品的试剂盒。试剂盒可包括：(a)疏水性聚合物基阳离子交换材料；(b)包括大于20％(v/v)的挥发性有机溶剂、挥发性盐和水的酸性溶液，(c)包括20％或更少(v/v)的挥发性有机溶剂、挥发性盐和水的酸性溶液；(d)包括挥发性碱、水和挥发性有机溶剂的中性或碱性溶液；和(e)使用试剂盒纯化生物样品的说明。
在本文提供的方法和试剂盒中的任一个中，疏水性聚合物基阳离子交换材料可为磺化二乙烯基苯聚苯乙烯、磺化聚二乙烯基苯或磺化二乙烯基苯/聚苯乙烯/吡咯烷酮树脂。在一些实施例中，挥发性盐可包括挥发性酸和挥发性碱。举例来说，挥发性酸可为甲酸、乙酸、三氟乙酸或三氯乙酸。挥发性碱的代表性实例包括三甲胺、氨、三乙胺、哌啶和丁胺。在本文提供的方法和试剂盒中的任一个中，挥发性有机溶剂可为乙腈、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丙酮或其组合。
附图说明
图1为使用多种洗涤溶液的肽纯化方法的示意图。
图2示出用TMT试剂标记并且用含有0.1％甲酸的洗涤B溶液(图2A)、含有0.1％(v/v)甲酸和0.1％(v/v)三乙胺的洗涤B溶液(图2B)，以及含有0.5％(v/v)甲酸和0.5％(v/v)三乙胺的洗涤B溶液(图2C)净化的HeLa细胞蛋白质消化物的MS(总离子)色谱图。色谱图的加框区域示出由于TMT衍生离子(淬灭和水解)产生的信号。
图3A示出来自用于在净化后对肽产率进行视觉和光谱评估的定量比色肽测定的一系列图像。HeLa细胞蛋白质消化物用TMT试剂标记并且用含有0.1％甲酸的洗涤B溶液(A)、含有0.1％(v/v)甲酸和0.1％(v/v)三乙胺的洗涤B溶液(B)，以及含有0.5％(v/v)甲酸和0.5％(v/v)三乙胺的洗涤B溶液(C)净化。图3B为比较使用上述洗涤溶液处理的样品的肽产率的条形图。由于存在残留TMT试剂，用洗涤B溶液(A)净化的样品产生的信号为用包括TEA的缓冲液处理的样品的信号的五倍以上。
图4A示出从用不同洗涤溶液洗涤的TMT标记的肽样品的LC-MS分析中获取的MS/MS光谱的数量。图4B示出从用不同洗涤溶液洗涤的TMT标记的肽样品的LC-MS分析中识别的肽光谱匹配(PSM)的数量。图4C示出从用不同洗涤溶液洗涤的TMT标记的肽样品的LC-MS分析中识别的独特肽的数量。图4D示出从用不同洗涤溶液洗涤的TMT标记的肽样品的LC-MS分析中识别的蛋白质组的数量。
图5A示出从用不同洗涤溶液洗涤的不同肽样品量的LC-MS分析中识别的蛋白质组。图5B示出从用不同洗涤溶液洗涤的不同肽样品量的LC-MS分析中识别的独特肽。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。本文中所提及的所有专利、申请、公布申请和其它公开都以全文引用的方式并入。如果此部分中阐述的定义与以引用的方式并入本文中的专利、申请、公布的申请和其它公开中阐述的定义相反或以其它方式不一致，那么此部分中阐述的定义优先于以引用的方式并入本文中的定义。
如本文所用，“一(a)”或“一(an)”意味着“至少一个”或“一或多个”。
如本文所用，除非上下文另外明确规定，否则术语“约”在用于描述数值时涵盖所述数值的至多±15％的范围。
虽然组合物和方法是以“包含”各种组分或步骤(解释为意味“包括但不限于”)的形式描述的，但组合物和方法也可“基本上由各种组分和步骤组成”或“由各种组分和步骤组成”，此类术语应该被解释为定义基本上封闭的成员群组。
如本文所用，“生物样品”指代血液学、细胞学和组织学样本，如细胞、细胞培养物、单一细胞生物体(例如酵母和细菌)、3D细胞培养物(例如球体和类器官)、组织、整个生物体(例如苍蝇或蠕虫)、无细胞萃取物或流体样品(例如血液、血清、血浆或痰液)。生物样品可指代已经通过过滤和/或离心处理的样品并且可包括细胞培养物的上清液和均质化的组织或破碎的细胞。组织样本可为任何类型的神经、上皮、肌肉或结缔组织，包括器官组织。组织样本可为新鲜的、冷冻的、固定的或使用常见的组织学技术保存的。生物样品可来自植物或动物(例如人类、小鼠、苍蝇、蠕虫、鱼、蛙、真菌等)。
如本文所用，“纯化(purifying)”或“纯化(purification)”指代制备纯或基本上纯形式的肽、多肽或蛋白质。纯化还指代从样品中去除污染物，包括源自样品的污染物或在样品处置期间引入的污染物。特别地，本文提供用于从生物样品中去除疏水性、亲水性和阳离子污染物的配制物和方法。如果非肽和非多肽化合物如通过质谱和/或UV/vis光谱测量的基本上已被去除(即，肽为高于检测水平的唯一分析物)，那么认为肽或多肽样品为纯的或基本上纯的。如果样品中纯化的肽和多肽的水平为至少70％，更优选至少80％，那么认为样品为纯的或基本上纯的。在一些实施例中，纯化的肽和多肽的水平大于约80％；或大于约90％；或大于约95％。在一些实施例中，样品不包括污染物(即，纯化的肽和多肽的水平为100％)。如果样品呈液体形式，那么纯度水平根据重量/体积(w/v)百分比进行评估。如果样品呈固体(例如，冻干)形式，那么纯度水平根据重量/重量(w/w)百分比进行评估。
如本文所用，“肽”和“多肽”可互换使用，以指代由两个或更多个氨基酸残基形成的聚合物链，其中氨基酸残基对通过肽键共价键合。如本文所用，肽包括2-50个氨基酸。肽可包括翻译后或其它类型的修饰，包括但不限于磷酸化、糖化、糖基化和甲基化。如本文所用，“肽”可指代单一肽化合物或两种或更多种肽化合物的混合物。如本文所用，“肽”可通过一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基的缩合反应化学合成。如本文所用，“肽”还可通过使用蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶、Lys-C、AspN或GluC)或选择性水解蛋白质酰胺键的化学反应消化蛋白质来生成。肽还可在N端、C端和/或侧链处具有一个或多个电荷或潜在带电基团(取决于pH)。在用蛋白水解酶消化后，蛋白质将产生携带至少一个电荷的肽，并且肽通常将携带至少两个正电荷。因为肽在N端、C端和/或侧链处包括一个或多个电荷或潜在带电基团，所以一种或多种阳离子和/或一种或多种阴离子典型地与肽或多肽缔合以保持化合物的静电中性。抗衡离子的代表性实例包括碱金属离子、碱土金属离子、卤化物、硫酸盐、碳酸盐、磷酸盐和乙酸盐。
如本文所用，“质量标签”和“串联质量标签”可互换使用，以指代含有可通过质谱分析区分的一种或多种稳定同位素的化学标记试剂。“质量标签”也指代化学结构相同但稳定同位素或同位素体数量不同的一组试剂。“质量标签”也可指代化学结构相同并且稳定同位素数量相同但在化学结构内分布不同的一组试剂，其在质谱仪中气相裂解后可通过质量来区分。如本文所用，“质量标签”另外指代可用于共价标记两个或更多个样品中的分子的一组试剂。两个或更多个样品可组合成一个样品以用于质谱分析。在一些实施例中，“质量标签”可用于共价标记衍生自生物样品的核酸、肽、碳水化合物、脂质或其它小分子。
描述用于纯化衍生自生物样品如组织、细胞和生物流体的肽和蛋白水解消化物的方法、配制物和试剂盒。一般而言，本文描述从衍生自生物样品的肽中去除污染物的方法和配制物。衍生自生物样本的样品可含有各种疏水性、亲水性和离子污染物。污染物可源自生物样品本身或在生物样品的处理期间引入。所描述的方法实施一系列洗涤步骤以从样品中去除不需要的污染物。与已知纯化方法相比，本文公开的方法和相关联的洗涤溶液的特别优点为可从样品中去除疏水性和亲水性单价阳离子污染物两者(不论来源如何)。因此，可提供足够不含污染物的高纯度肽。分离的肽适用于苛刻的下游应用和需要极纯样品的测定(例如，LC-MS)。从生物样品中去除不期望的碎片和组分(例如，盐、脂肪、脂质、糖等)可防止对仪器的损坏并且改善MS蛋白质组学数据的质量(例如，通过去除不需要的离子)。举例来说，当用于LC-MS应用时，根据本方法纯化的肽可使色谱干扰、电离抑制和液相色谱(LC)管道组件的堵塞降到最低。此外，污染物的去除可通过降低气相中样品的复杂性来改善LC-MS肽和蛋白质的识别率，从而减少电荷状态(例如M+、M+2、M+3等)和/或电荷物种(例如M+Na、M+2Na等)。改善的LC-MS光谱质量还可在使用数据库搜索、光谱库匹配或从头测序进行数据分析期间改善肽和蛋白质的识别率。
所描述的方法和配制物改善实施标准反相和阳离子交换色谱树脂的现有纯化方法。如上文所讨论，反相脱盐方法的缺点为疏水性分子如脂质和去污剂可通过疏水性相互作用仍然与树脂结合。在用含有有机溶剂的酸性溶液从树脂中洗脱结合肽时，疏水性分子也可洗脱并且由此污染肽样品。为了解决与使用反相树脂从生物样品中纯化肽相关联的一些缺点，强阳离子交换树脂可用作肽样品净化的反相方法的替代品。
在使用阳离子交换树脂的一种代表性方法中，将样品酸化并且加载到水溶液中的阳离子交换树脂上。亲水性阴离子和中性物种通过树脂，而所有阳离子和疏水性物种分别通过离子交换或疏水性相互作用仍然与树脂结合。然后用低离子强度的第一酸性水溶液(例如，0.1％甲酸水溶液)洗涤树脂以从树脂基质中去除任何过量亲水性阳离子。接着用具有相同离子强度和酸度但带有有机溶剂组分(例如，含0.1％甲酸的70％乙腈)的溶液洗涤树脂。第二洗涤溶液去除通过疏水性相互作用与树脂结合的中性和阴离子疏水性物种(例如，脂质、去污剂等)。在用第二洗涤溶液处理后，只有来自样品的阳离子物种仍然与树脂结合(例如，原子阳离子，如钠、各种小/大的胺和肽)。然后用含有有机溶剂组分的碱性溶液洗脱肽，以在高pH下消除任何疏水性相互作用，以使肽上的羧酸基团离子化并且降低氨基对树脂的亲和力。此外，优选的是洗脱溶液的离子强度足以(例如，0.1％(v/v)或更大)与肽氨基竞争阳离子交换结合位点。代表性洗脱溶液可包括氨或三甲胺(TEA)在30％或更高的乙腈(ACN)有机溶剂中的组合。
本文重要的是要注意，用胰蛋白酶进行蛋白水解消化产生的所有肽在低pH下于N端处和C端的赖氨酸/精氨酸残基处含有至少两个正电荷。单价和二价阳离子两者都可仍然与阳离子交换树脂结合，但二价阳离子肽比具有单个正电荷的阳离子物种对强阳离子交换树脂的亲和力更高。结果，不期望的非肽阳离子与肽一起从树脂中洗脱。为了解决这个问题，本文描述改善的方法和洗涤溶液，其从树脂中去除非肽单电荷阳离子物种，同时去除通过疏水性相互作用与树脂结合的中性和阴离子疏水性物种(例如，脂质、去污剂等)。出乎意料的是，通过在酸性pH条件下优化具有各种挥发性盐配制物的洗涤溶液的离子强度，可以同时使不期望的阳离子的去除增到最大，同时维持肽在树脂上的保留。因此，与从生物样品中纯化肽的现有方法相比，所描述的配制物和方法提供显著改善。
在一方面，提供从生物样品中分离高纯度肽的方法，其中分离的肽基本上不含污染物。方法包括一系列洗涤步骤以去除可污染纯化肽样品的不需要的物种。树脂的洗涤指代其中用于色谱的固定相树脂或其它固体材料通过液体流动相组分接触的程序。色谱载体的洗涤可通过温育和/或将树脂与洗涤缓冲液混合来完成。洗涤也可通过使用离心、真空、重力、正压或其它手段使洗涤缓冲液以柱形式通过树脂来完成。与已知纯化方法相比，本文公开的方法的特别优点为可从肽样品中去除疏水性和亲水性单阳离子污染物两者。纯化的肽足够纯以用于受益于极纯样品的另外的下游测定和应用中的研究。下游应用的实例包括但不限于蛋白质印迹、免疫沉淀/纯化、配体受体结合测定、NMR光谱、比色和荧光定性和定量测定以及LC-MS分析。举例来说，发现由改善的方法产生的肽纯度可显著提高与LC-MS分析相关的样品质量指标(例如，肽和蛋白质识别、采样成功率等)。
本文所描述的方法在纯化含有用质量标签标记的肽的样品以用于肽和蛋白质样品的比较(即，相对定量)分析的情况下提供特别优点。举例来说，肽样品(在净化之前或之后)可用胺反应性串联质量标签(TMT)试剂在N端和赖氨酸残基侧链处进行标记。TMT试剂为在低pH下的非挥发性单价阳离子。然而，样品中过量TMT试剂可干扰比色和基于MS的测定。本文公开的方法提供从样品中去除过量TMT试剂。去除TMT试剂引起显著减少基于MS的分析中的光谱干扰，并且减少样品肽产率的定量比色测定测量中的干扰，从而引起改善肽和蛋白质识别号。
生物样品可包括肽(例如，由蛋白质或多肽的消化产生的肽)，以及来自生物样品的残留组分和/或样品处理中剩余的物种。污染物可包括亲水性和/或疏水性物种，以及带电物种。举例来说，生物样品可被盐、去污剂、脂质、核酸和其它类型的小分子(例如，碳水化合物、代谢物、核苷酸等)污染。样品可包括阳离子和/或阴离子物种。在一些实施例中，样品可包括单价和/或二价阳离子物种。在其它实施例中，除了单价和/或二价阳离子物种之外，样品还包括亲水性污染物(例如，中性或离子物种)。亲水性污染物的实例包括但不限于盐、核酸和碳水化合物。单价阳离子污染物的代表性实例包括铵、钠、钾、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、羟胺、乙醇胺、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)(PIPES)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸(EPPS)和甘氨酸。
在某些实施例中，蛋白质消化物或肽可用质量标签或其它标记试剂衍生，例如胺-、巯基-、羧基-和羰基-反应性串联质量标签(TMT)试剂(可从马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific；Waltham,MA)获得)、iTRAQ试剂(可从马萨诸塞州弗雷明汉的SCIEX(SCIEX；Framingham,MA)获得)、N,N-二甲基亮氨酸(di-Leu)试剂、组合质量标签、荧光染料、生物素化试剂等)。用质量标签或其它标记试剂进行标记可将污染物引入样品中，例如以过量未反应的标记试剂的形式。对于用质量标签(例如，TMT)或其它标记试剂标记的蛋白质消化物或肽样品，在纯化前的样品可包括残留质量标签，以及用于标记和淬灭反应的组分(例如，缓冲盐)。污染物可为未反应的质量标签或标记。可替代地，污染物可在标记反应期间形成。在一些实施例中，污染物为在标记肽或蛋白质消化物的过程期间形成的标记或质量标签的衍生物。在一些实施例中，质量标签衍生物可呈单价阳离子的形式。举例来说，质量标签如TMT的单价阳离子衍生物可包括例如未反应的TMT试剂的NHS酯、通过质量标签水解形成的TMT试剂的酸衍生物；和在质量标签与胺或含胺化合物反应后形成的TMT的酰胺衍生物。
方法的一个实施例用于通过用单一溶液洗涤与纯化树脂结合的样品来纯化生物样品如肽或蛋白质消化物以去除单价阳离子和疏水性污染物。处理的生物样品可含有疏水性组分，如有助于蛋白质溶解的外部引入的去污剂和典型地引入以维持蛋白质的pH和溶解特性的缓冲盐。在对样品蛋白质进行蛋白水解消化后，去除这些污染物对于通过质谱和其它分析技术实现最佳分析至关重要。在一种代表性方法中，将样品在酸性条件下(例如，pH约1-5)加载到疏水性聚合物基阳离子交换材料上。典型地，柱内含有阳离子交换材料以便于样品的处置和处理。在酸性条件下，样品可与阳离子交换材料结合。在方法的下一步中，阳离子交换材料用酸性溶液(例如，pH约1-5)洗涤。在某些实施例中，pH为约2-4。酸性溶液可包括水和一种或多种挥发性组分，如挥发性有机溶剂和挥发性盐。挥发性盐可包括挥发性酸(例如，甲酸、乙酸、三氟乙酸或三氯乙酸)和挥发性碱(例如，三甲胺、氨、三乙胺、哌啶或丁胺)。典型地，酸性溶液可包括20％或更大(v/v)的挥发性有机溶剂(例如，乙腈、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇或丙酮)。举例来说，酸性溶液可包括约20％-40％；40％-60％；60％-80％；或大于80％(v/v)的挥发性有机溶剂。酸性溶液可另外包括挥发性盐。可调节溶液中挥发性盐的量以将pH维持在期望的水平。举例来说，为了将溶液的pH维持在约1-5，挥发性盐的浓度可在约0.01％至约1.0％(v/v)的范围内。在一些实施例中，酸性溶液包括水、60％或更大(v/v)的挥发性有机溶剂(例如，乙腈、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇或丙酮)和约0.1％至1.0％(v/v)的挥发性盐(例如，包括挥发性酸组分如甲酸、乙酸和/或三氟乙酸和挥发性碱如氨、三乙胺和/或哌啶的盐)，使得溶液的pH维持在约pH 2-4。在一些实施例中，可使用一种或多种挥发性酸或挥发性碱。在用酸性溶液处理后，肽保留在阳离子交换材料上并且可从阳离子交换材料中去除单价阳离子和/或疏水性污染物。然后可用碱性或中性溶液从阳离子交换材料中洗脱保留的肽。碱性或中性溶液可包括挥发性有机溶剂和水的组合。在某些实施例中，洗脱溶液包括20％或更大(v/v)的挥发性有机溶剂(例如，20％-40％；40％-60％；60％-80％；或大于80％(v/v))。典型地，碱性或中性溶液的pH为5或更大。在某些实施例中，溶液的pH大于7；大于8；大于9；大于10；或大于11。此外，如本文所述，碱性或中性溶液可包括挥发性碱和/或挥发性盐。可调节洗脱溶液中挥发性盐的量以将pH维持在期望的水平。为了将洗脱溶液的pH维持在5或更大，挥发性盐的浓度可在约0.01％至约1.0％(v/v)的范围内。在一些实施例中，洗脱溶液包括40％或更大(v/v)的挥发性有机溶剂(例如，乙腈、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇或丙酮)和约0.01％至1.0％(v/v)的挥发性盐(例如，包括挥发性酸组分如甲酸、乙酸和/或三氟乙酸和挥发性碱如氨、三乙胺和/或哌啶的盐，使得溶液的pH维持在约pH8-12。
本文提供的一种示例性方法用于纯化生物样品，如肽或蛋白质消化物。方法包括用一种以上的溶液洗涤与树脂结合的样品，以首先去除疏水性和单阳离子污染物，并且然后随后去除亲水性污染物。举例来说，样品可含有高浓度的防腐剂如碳水化合物，其在没有充分去除的情况下可对MS对样品的下游分析造成显著干扰水平。有效去除这类污染物典型地需要使用包括20％或更少(v/v)的挥发性有机溶剂的洗涤溶液。因此，对于某些样品，包括多种洗涤溶液以从样品中去除亲水性、疏水性和离子污染物可为有利的。在实施多种洗涤溶液的一种代表性方法中，将包括肽的样品加载到阳离子交换材料上，如本文所公开的。然后用第一酸性溶液(pH约2-4)洗涤材料。在一些实施例中，第一酸性溶液包括20％或更少(v/v)的挥发性有机溶剂、水和挥发性酸。在一些实施例中，第一酸性溶液包括10％-20％；或5％-10％；或1％-5％；或少于1％(v/v)的挥发性有机溶剂。在一些实施例中，第一酸性溶液包括少于5％(v/v)的挥发性有机溶剂和约0.01％至0.5％(v/v)的挥发性酸(例如，甲酸、乙酸、三氟乙酸或三氯乙酸)，使得溶液的pH维持在约pH 2-4。用第一酸性溶液处理从阳离子交换材料中去除亲水性污染物，但又允许肽仍然保留在阳离子交换材料上。然后用第二酸性溶液(例如，pH约1-5)洗涤阳离子交换材料，以从阳离子交换材料中去除单价阳离子和/或疏水性污染物，同时肽保持与阳离子交换材料结合。第二酸性溶液可包括水和一种或多种挥发性组分，如挥发性有机溶剂(例如(例如，乙腈、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇或丙酮)和挥发性盐(例如，由挥发性酸如甲酸和挥发性碱如三甲胺形成的盐)。典型地，第二酸性溶液包括20％或更大(v/v)的挥发性有机溶剂。举例来说，酸性溶液可包括约20％-40％；40％-60％；60％-80％；或大于80％(v/v)的挥发性有机溶剂。在一些实施例中，酸性溶液包括大于60％(v/v)的挥发性有机溶剂和约0.01％至1.0％(v/v)的挥发性盐，使得溶液的pH维持在约pH 2-4。可使用碱性或中性溶液从阳离子交换材料中洗脱保留的肽，如本文所公开的。
使用本文公开的配制物和方法从生物样品中分离纯肽的代表性方法在图1中说明。参考图1，肽纯化工作流程100涉及使用本领域技术人员熟知的方法来消化生物样品以提供含有消化的生物材料(例如，细胞、组织、核酸、蛋白质、多肽、脂质、碳水化合物等)和一种或多种污染物，如盐、去污剂、脂质和其它小的中性分子的粗消化物样品110。通过添加足以将pH降低至1-4的纯净或稀释的酸溶液来酸化消化的样品110。然后将消化的样品110转移到疏水性聚合物基阳离子交换材料115上(步骤1)。可在配备有出口端口117的净化柱116内含有阳离子交换材料。可在离心管118内含有柱。含有净化柱的离心管可在真空下离心以允许来自样品的组分120(例如，消化的生物材料)流过柱116中含有的树脂115。对阳离子交换材料115具有很小或没有亲和力的组分120流过阳离子交换材料，通过端口117流出，并且收集在离心管118中。将第一酸性溶液(洗涤溶液A)施加到阳离子交换材料并且在真空下离心，从而通过阳离子交换材料洗涤亲水性污染物(例如，中性和阴离子组分)130，同时阳离子和疏水性物种(例如，肽和/或消化的蛋白质)保留在阳离子交换材料115上(步骤2)。丢弃亲水性污染物130。将第二酸性溶液(洗涤溶液B)施加到阳离子交换材料并且在真空下将柱离心以从树脂115中去除疏水性(例如，中性、阴离子和单价阳离子)和亲水性单价阳离子污染物140(步骤3)。二价阳离子物种保留在阳离子交换材料上，而单价阳离子和/或疏水性污染物140通过在真空下离心从阳离子交换材料中去除。因为通过酶消化多肽或蛋白质产生的肽具有至少两个正电荷(即，二价阳离子)，所以在步骤3之后肽保留在阳离子交换材料115上。然后用碱性或中性溶液从阳离子交换材料中洗脱肽(步骤4)以提供纯化的肽溶液150。纯化的肽溶液150可任选地被干燥(例如，通过冻干)(步骤5)，以提供足够纯以用于另外的下游应用的干燥的肽160。
方法的一个实施例涉及通过用一种以上的溶液洗涤与纯化树脂结合的样品来纯化生物样品如肽或蛋白质消化物以在疏水性和单价阳离子污染物之前去除亲水性污染物。在又另一种方法中，将含有肽的样品加载到阳离子交换材料上，如本文所公开的。然后用第一酸性溶液洗涤阳离子交换材料，其中第一酸性溶液包括大于20％(v)的挥发性有机溶剂、水和挥发性盐，使得含肽化合物保留在阳离子交换材料上并且从阳离子交换材料中去除单价阳离子和/或疏水性污染物。
第一酸性溶液可包括水和一种或多种挥发性组分，如挥发性有机溶剂和挥发性盐。典型地，第一酸性溶液包括20％或更大(v/v)的挥发性有机溶剂。举例来说，酸性溶液可包括约20％-40％；40％-60％；60％-80％；或大于80％(v/v)的挥发性有机溶剂。在一些实施例中，酸性溶液包括大于60％(v/v)的挥发性有机溶剂和约0.01％至1.0％(v/v)的挥发性盐，使得溶液的pH维持在约pH 2-4。接着使用第二酸性溶液洗涤阳离子交换材料。在某些实施例中，第二酸性溶液包括20％或更少(v/v)的挥发性有机溶剂、水和挥发性酸。用第二酸性溶液处理去除亲水性污染物，但又允许肽仍然在阳离子交换材料上。在一些实施例中，第二酸性溶液包括20％或更少(v/v)的挥发性有机溶剂、水和挥发性酸。在一些实施例中，第一酸性溶液包括10％-20％；或5％-10％；或1％-5％；或少于1％(v/v)的挥发性有机溶剂。在一些实施例中，第一第二溶液包括少于5％(v/v)的挥发性有机溶剂和约0.01％至0.5％(v/v)的挥发性酸，使得溶液的pH维持在约pH 2-4。可使用碱性或中性溶液从阳离子交换材料中洗脱保留的肽，如本文所公开的。
在另一方面，本文提供的方法另外包括用标记试剂(例如，质量标签)标记蛋白质消化物或肽的步骤。添加组分(例如，缓冲盐、淬灭剂和残留标记试剂)以便于用质量标签标记蛋白质、蛋白质消化物和肽可另外将污染物引入生物样品中，从而可降低LC-MS数据的质量和/或损坏色谱柱和泵。有利地，本文提供的配制物和方法可去除在标记过程期间引入的污染物，以提供用质量标签或基本上不含这类污染物的其它标记试剂标记的肽，并且适合使用LC-MS系统进行分析。本文提供的方法可从样品中去除过量TMT试剂，从而引起显著减少基于MS的分析中的光谱干扰，减少样品肽产率的定量比色测定测量中的干扰(因为TMT试剂干扰这些测定类型)，并且减少这些材料在LC-MS仪器组件上的物理沉积和积累，从而最终延长仪器系统的高灵敏度并且引起改善肽和蛋白质识别号。
质量标签包括例如串联质量标签试剂，如TMT和TMTPRO标记试剂，其可商购自马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技。在某些实施例中，蛋白质消化物在肽净化之前用质量标签进行标记。在其它实施例中，肽可在肽净化后用TMT试剂标记。
因此，本文提供另外包括用TMT试剂标记蛋白质消化物或纯化的肽的方法。用TMT试剂标记蛋白质消化物的代表性方法包括将溶解在弱碱性(例如pH 7.5-9)缓冲(例如100mM TEAB或HEPES)溶液中的蛋白质消化物与溶解在有机溶剂(例如乙腈)中的TMT试剂组合，在室温下温育混合物；并且然后使用含有伯胺(例如羟胺)的溶液淬灭标记反应。
用TMT试剂标记纯化的肽的代表性方法包括将干燥的肽样品溶解在弱碱性(例如pH 7.5-9)缓冲(例如100mM TEAB或HEPES)溶液中。然后将溶解的肽样品与溶解在乙腈中的TMT试剂组合并且在室温下温育。用含有羟胺的溶液淬灭标记反应。一旦淬灭，标记的样品就用TFA(pH<3)酸化并且脱盐。
本文提供的方法实施固相萃取树脂。萃取树脂可包括疏水性聚合物基阳离子交换材料。这类材料为本领域技术人员所熟知，并且各种阳离子交换树脂可用于实践所公开的方法。合适的疏水性聚合物基阳离子交换材料的代表性实例包括磺化二乙烯基苯聚苯乙烯、磺化聚二乙烯基苯树脂、磺化聚二乙烯基苯/聚苯乙烯树脂和磺化聚二乙烯基苯/聚苯乙烯树脂。可商购的疏水性聚合物基阳离子交换材料的代表性实例包括分别可从马萨诸塞州米尔福德的沃特斯公司(Waters Corporation(Milford,MA))和马萨诸塞州贝德福德的赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific(Bedford,MA))获得的Oasis MCX和POROS XS强阳离子交换树脂。在一些实施例中，萃取树脂可包括阳离子交换材料的组合。在某些实施例中，纯化树脂为阳离子交换材料的物理共混物。在某些实施例中，萃取树脂可为或包括由单体例如二乙烯基苯或苯乙烯和吡咯烷酮单体的组合形成的共聚物。在一些实施例中，阳离子交换材料为吡咯烷酮和磺化单体如二乙烯基苯或磺化聚二乙烯基苯的共聚物。在某些实施例中，具有或不具有强阳离子交换特性的其它类型的疏水性和/或亲水性树脂(例如，C18树脂、非磺化聚二乙烯基苯/聚苯乙烯树脂、二氧化硅、琼脂糖、琼脂糖凝胶等)可与疏水性聚合物基阳离子交换材料组合(例如，作为物理共混物)，如本文所公开的。在某些实施例中，萃取树脂为强阳离子交换材料(例如，如本文所公开的磺化单体)和亲水性和/或疏水性树脂的组合。在某些实施例中，亲水性和/或疏水性树脂的结合模式与强阳离子交换材料的结合模式相同。
固相萃取(SPE)树脂可呈磁性颗粒(例如，珠子)的形式。举例来说，SPE树脂可由另外包括磁性材料的聚合物材料构成。对含有与磁性聚合物颗粒结合的分析物的样品施加磁场允许在不使用离心或过滤的情况下分离分析物。“磁性”在本文中意指聚合物颗粒含有超顺磁性晶体。因此，磁性聚合物颗粒为可磁性置换的，但不是可永久磁化的。用于制备磁性聚合物颗粒的许多方法为已知的，其中大量涉及由预先形成的磁性氧化铁例如磁铁矿制备含磁赤铁矿或磁铁矿的聚合物颗粒。磁性聚合物颗粒可在本文公开的肽纯化方案中实施，可在广泛范围的自动化平台上轻松自动化。
本文提供的洗涤溶液利用一种或多种挥发性组分，如有机溶剂、碱和盐。挥发性组分特别有用，因为它们可在真空下很容易地蒸发，而不向样品中引入额外污染物。挥发性组分也很有用，因为它们与基于电喷雾电离的质谱分析兼容。可用于所公开的方法中的挥发性有机溶剂的代表性实例包括但不限于乙腈、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇和丙酮。在一些情况下，挥发性有机溶剂的组合可用于所公开的方法中。可用于所公开的方法中的挥发性盐的代表性实例可包括挥发性酸和/或挥发性碱。合适的挥发性碱包括例如三甲胺(TEA)、氨、哌啶和丁胺。合适的挥发性酸包括例如甲酸、乙酸、三氟乙酸和三氯乙酸。在某些实施例中，挥发性盐包括挥发性碱和挥发性酸，如乙酸铵、甲酸铵、三氟乙酸铵、甲酸三乙铵、乙酸三乙铵、三氟乙酸三乙铵或碳酸氢铵)。
本文另外提供用于纯化包括肽的生物样品的试剂盒。试剂盒可用于分离衍生自生物样品如细胞或组织的肽。肽可通过蛋白质或多肽的消化生成。
在一方面，提供试剂盒以对细胞(例如，培养的哺乳动物细胞)、生物流体(例如，血浆或血清)和组织执行有效和可重复处理以用于蛋白质组学MS分析和其它类型的测定。试剂盒可包括预配制的缓冲液、MS级酶混合物、肽净化(板和柱)和优化的时间有效方案，以生成与LC-MS分析兼容的肽样品。使用本文提供的试剂盒和方法可在几个小时内(例如，少于四小时)制备纯化的肽样品，从而显著减少与现有试剂盒和方法相关联的标准处理时间。可使用所公开的方法和试剂盒处理约1μg至约10mg或更大的蛋白质样品，以提供高产率的纯化的肽样品。在一些实施例中，试剂盒可用于处理在约0.5mg至约2mg范围内的蛋白质样品。
本文提供的试剂盒可包括预配制的缓冲液、MS级酶(例如，核酸酶、用于半胱氨酸修饰的还原/烷基化溶液和用于蛋白质消化的胰蛋白酶/Lys-C蛋白酶混合物)，以及生成MS兼容肽样品的方案。此外，试剂盒可包括肽净化板或小瓶和溶液，以制备不含去污剂的肽样品，用于直接LC-MS分析或另外的样品处理，如等压标签(例如，TMTTM试剂)标记、磷酸肽富集或分馏(例如，高pH反相分馏)。在某些实施例中，本文提供的试剂盒可包括如本文所述的一种或多种洗涤溶液和一种或多种额外组分，例如裂解溶液、通用核酸酶、还原溶液、烷基化溶液、酶复原溶液、胰蛋白酶/Lys-C蛋白酶混合物、酶、消化停止溶液和洗脱溶液。
用于纯化源自生物的肽的试剂盒的代表性实例包括：(a)疏水性聚合物基阳离子交换材料；(b)包括挥发性盐、水和大于20％(v/v)的挥发性有机溶剂的酸性溶液；(c)包括挥发性碱、水和挥发性有机溶剂的中性或碱性溶液；和(d)使用试剂盒纯化生物样品的说明。
用于纯化源自生物样品的肽的试剂盒的另一实例包括：(a)疏水性聚合物基阳离子交换材料；(b)包括大于20％(v/v)的挥发性有机溶剂、挥发性盐和水的酸性溶液；(c)包括20％或更少(v/v)的挥发性有机溶剂、挥发性盐和水的酸性溶液；(d)包括挥发性碱、水和挥发性有机溶剂的中性或碱性溶液；和(e)使用试剂盒纯化生物样品的说明。
包括以下实例以展现本发明的某些实施例。本领域技术人员应该理解，以下实例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中很好地起作用的技术，因此可认为是构成用于其实践的优选模式。然而，根据本公开，所属领域的技术人员应了解，在不脱离本发明的范围的情况下，可对所公开的特定实施例作出许多改变，且仍获得相同或类似结果。
实例
除非另外指示，否则本文中所提供的实例利用以下材料和通用方法。额外材料从以下伊利诺伊州罗克福德的赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific(Rockford,IL))或注明的商业来源获得。
实例1
纯化TMT标记的肽
以下方案描述纯化用TMT试剂标记的肽的方法。肽可衍生自生物样品(例如培养的细胞、组织、纯化的蛋白质、血清或血浆)的蛋白水解消化物，并且如实例3所述进行处理直到在真空离心后获得干燥肽。可替代地，C18或另一种反相固相萃取净化材料可用于在真空离心前对样品进行脱盐。将干燥的肽溶解在合适的缓冲液(例如100mM TEAB pH 8.5或100mM HEPES pH 8.0)中。肽来自用TMT试剂标记的不同样品。对于100μg肽样品，使用含0.4-0.8mg TMT试剂的40μL乙腈在室温下标记样品1小时。通过添加8μL 5％羟胺停止反应并且温育5分钟。TMT标记的肽样品在组合成一个样品之前或之后使用1-10％甲酸酸化至pH2-4。然后将组合样品加载到含有50-100mg疏水性聚合阳离子交换材料的净化柱上，如本文所公开的。一旦加载，柱就以1,000rpm离心10分钟。添加如本文所述的3mL酸性洗涤缓冲液，并且柱以2,000rpm离心2分钟以去除亲水性污染物(例如，中性和阴离子组分)。添加如本文所述的3mL第二酸性洗涤缓冲液并且柱以2,000rpm离心2分钟。再次添加3mL第二酸性洗涤缓冲液并且以2,000rpm离心2分钟以去除疏水性(例如，中性、阴离子和单价阳离子)和亲水性单价阳离子污染物。将如本文所述的3mL洗脱溶液添加到柱中并且以2,000rpm离心2分钟以收集净化的肽样品。使用真空离心机干燥肽样品。样品可再悬浮于100-500μL 0.1％甲酸水溶液中以用于LC-MS分析。任选地，肽产率和浓度可使用定量肽测定如PierceTM定量比色肽测定评估。对于LC-MS分析，用0.1％甲酸水溶液将1-10μg肽调节至0.1-1μg/uL。使用Thermo ScientificTM DionexTM UltimateTM 3000 Nano LC系统分离一式三份蛋白质消化物样品(每次注射1μg)，所述系统使用50cm C18 Thermo Scientific EASY-SprayTM柱，其中乙腈梯度在85分钟内为3％至28％，在30分钟内为28％至45％，流速为300纳升/分钟，在Thermo ScientificTM FusionTM TrbridTM质谱仪上使用最高速度数据相关采集方法。使用120K的分辨率以4e5的目标值和50毫秒的最大注射时间获取MS光谱。使用CID NCE 35、1e5的目标值和50毫秒的最大注射时间生成MS/MS光谱。使用HCD NCE 60以50K的分辨率、1e5的目标值和105毫秒的最大注射时间生成MS/MS/MS光谱。LC-MS数据使用Thermo ScientificTMProteome DiscovererTM 2.3软件中的
Figure BDA0003607005500000151
HT搜索引擎使用静态半胱氨酸碘乙酰胺化(C)、动态氧化(M)、TMT6plex或TMTpro(K，N-项)和脱酰胺(N，Q)修饰进行分析。针对Uniprot人类蛋白质数据库搜索数据并且使用1％蛋白质FDR阈值过滤结果(参见图2A-图2C和图3A-图3B)。与标准缓冲液(仅FA)相比，使用含有挥发性盐(TEA和FA)的改善酸性洗涤缓冲液有效地去除MS色谱图开始时过量淬灭和水解TMT试剂。此外，通过使用比色肽测定测量的背景信号的减少也证实去除过量TMT试剂。LC-MS分析的准确肽测量需要去除与过量TMT试剂相关的背景信号。
实例2
从生物样品中纯化TMT试剂标记的蛋白质消化物
以下方案描述从生物样品(例如，培养的细胞、组织、纯化的蛋白质、血清或血浆)中分离肽的方法。使用本领域熟知的方法从生物样品中萃取、还原和烷基化蛋白质。然后使用胰蛋白酶和Lys-C蛋白酶在合适的缓冲液(例如100mM TEAB pH 8.5或100mM HEPESpH8.0)中的混合物消化还原和烷基化的蛋白质。蛋白质消化物来自用TMT试剂标记的不同样品。对于10μg肽样品，使用含0.04-0.08mg TMT试剂的20μL乙腈在室温下标记样品15分钟至1小时。通过添加1-4μL 5％羟胺停止反应并且温育5分钟。TMT标记的肽样品在组合成一个样品之前或之后使用1-10％甲酸酸化至pH 2-4。TMT标记的肽样品根据以下方法纯化。将组合样品转移到含有疏水性聚合阳离子交换材料的干燥肽净化柱，如本文所公开的。一旦加载，柱就以1,000rpm离心10分钟。添加如本文所述的300μL酸性洗涤缓冲液，并且柱以2,000rpm离心2分钟以去除亲水性污染物(例如，中性和阴离子组分)。添加如本文所述的300μL第二酸性洗涤缓冲液并且柱以2,000rpm离心2分钟。再次添加300μL第二酸性洗涤缓冲液并且以2,000rpm离心2分钟以去除疏水性(例如，中性、阴离子和单价阳离子)和亲水性单价阳离子污染物。将如本文所述的300μL洗脱溶液添加到柱中并且以2,000rpm离心2分钟以收集净化的肽样品。使用真空离心机干燥肽样品。样品可再悬浮于100μL 0.1％甲酸水溶液中以用于LC-MS分析。任选地，肽产率和浓度可使用定量肽测定如PierceTM定量比色肽测定评估。对于LC-MS分析，用0.1％甲酸水溶液将1-10μg肽调节至0.1-1μg/uL。使用ThermoScientificTM DionexTM UltimateTM 3000 Nano LC系统分离一式三份蛋白质消化物样品(每次注射1μg)，所述系统使用50cm C18 Thermo Scientific EASY-SprayTM柱，其中乙腈梯度在85分钟内为3％至28％，在30分钟内为28％至45％，流速为300纳升/分钟，在ThermoScientificTM FusionTM TribridTM质谱仪上使用最高速度数据相关采集方法。使用120K的分辨率以4e5的目标值和50毫秒的最大注射时间获取MS光谱。使用CID NCE 35、1e5的目标值和50毫秒的最大注射时间生成MS/MS光谱。使用HCD NCE 60以50K的分辨率、1e5的目标值和105毫秒的最大注射时间生成MS/MS/MS光谱。LC-MS数据使用ThermoScientificTMProteome DiscovererTM 2.3软件中的
Figure BDA0003607005500000161
HT搜索引擎使用静态半胱氨酸碘乙酰胺化(C)、动态氧化(M)、TMT6plex或TMTpro(K，N-项)和脱酰胺(N，Q)修饰进行分析。针对Uniprot人类蛋白质数据库搜索数据并且使用1％蛋白质FDR阈值过滤结果。参见图4A-图4D。与标准洗涤缓冲液相比，使用改善的洗涤缓冲液去除过量TMT试剂和其它污染物，减少MS/MS扫描的总数，但增加通过LC-MS识别的肽光谱匹配(PSM)、独特肽和蛋白质组的总数。
实例3
从生物样品中纯化肽
以下方案描述从生物样品(例如，培养的细胞、组织、纯化的蛋白质、血清或血浆)的蛋白水解消化物中纯化肽的方法。使用本领域熟知的方法从生物样品中萃取、还原和烷基化蛋白质。然后使用胰蛋白酶和Lys-C蛋白酶的混合物消化还原和烷基化的蛋白质。通过添加1-10％甲酸停止蛋白质的消化，直到pH范围为2-4。将蛋白质消化物样品转移到含有5-10mg疏水性聚合阳离子交换材料的干燥肽净化柱，如本文所公开的。一旦加载，柱就以1,000rpm离心10分钟。添加如本文所述的300μL酸性洗涤缓冲液，并且柱以2,000rpm离心2分钟以去除亲水性污染物(例如，中性和阴离子组分)。添加如本文所述的300μL第二酸性洗涤缓冲液并且柱以2,000rpm离心2分钟。再次添加300μL第二酸性洗涤缓冲液并且以2,000rpm离心2分钟以去除疏水性(例如，中性、阴离子和单价阳离子)和亲水性单价阳离子污染物。将如本文所述的300μL洗脱溶液添加到柱中并且以2,000rpm离心2分钟以收集净化的肽样品。使用真空离心机干燥肽样品。样品可再悬浮于100μL 0.1％甲酸水溶液中以用于LC-MS分析。任选地，肽产率和浓度可使用定量肽测定如PierceTM定量比色肽测定评估。对于LC-MS分析，用0.1％甲酸水溶液将1-10μg肽调节至0.1-1μg/uL。使用Thermo ScientificTMDionexTM UltimateTM 3000Nano LC系统分离一式三份蛋白质消化物样品(每次注射1μg)，所述系统使用50cm C18 Thermo Scientific EASY-SprayTM柱，其中乙腈梯度在85分钟内为3％至28％，在30分钟内为28％至45％，流速为300纳升/分钟，在Thermo ScientificTM QExactiveTM Plus Hybrid Quadrupole-OrbitrapTM质谱仪上使用前20个数据相关采集方法。使用70K的分辨率以3e6的目标值和100毫秒的最大注射时间获取MS光谱。使用HCD NCE28以17.5K的分辨率、1e5的目标值和54毫秒的最大注射时间生成MS/MS光谱。LC-MS数据使用Thermo ScientificTM Proteome DiscovererTM 2.3软件中的
Figure BDA0003607005500000171
HT搜索引擎使用静态半胱氨酸碘乙酰胺化(C)、动态氧化(M)和脱酰胺(N，Q)修饰进行分析。针对Uniprot人类蛋白质数据库搜索数据并且使用1％蛋白质FDR阈值过滤结果。图5A和图5B示出根据使用具有0.1％甲酸和70％ACN的标准洗涤溶液(洗涤B)和改善的洗涤溶液(洗涤B+包括0.5％甲酸、0.5％三甲胺和70％ACN)制备的10μg和100μg Hela细胞裂解物样品的肽和蛋白质识别号的分析结果。如图5A和图5B所示，与标准洗涤溶液相比，使用去除额外污染物的改善的洗涤溶液识别更多的蛋白质和肽。
虽然已经在本文示出并描述了本发明的优选实施例，但是对本领域的普通技术人员而言应该显而易见是这样的实施例仅以举例方式提供。在不脱离本发明的情况下，所属领域的技术人员现在将意识到许多变型、变化和替代物。应理解，本文所描述的本发明的实施例的各个替代方案都可以用于实践本发明。以下条款和权利要求旨在限定本发明的范围以及由此覆盖在这些条款和权利要求和它们的等效物的范围内的方法和结构。实施例可以根据以下编号的条款：
1.一种纯化生物样品的方法，其包含：
(a)在酸性条件下使所述生物样品与疏水性聚合物基阳离子交换材料接触，使得所述样品与所述阳离子交换材料结合，其中所述样品包含：
(i)肽，和
(ii)单价阳离子污染物和/或疏水性污染物；
(b)用酸性溶液洗涤所述阳离子交换材料，其中所述酸性溶液包含大于20％(v/v)的挥发性有机溶剂、水和挥发性盐，使得所述肽保留在所述阳离子交换材料上并且从所述阳离子交换材料中去除所述单价阳离子和/或疏水性污染物；和
(c)用碱性或中性溶液从所述阳离子交换材料中洗脱保留的肽，其中所述碱性或中性溶液包含挥发性有机溶剂、水和选自挥发性碱、挥发性盐以及其组合的挥发性化合物。
2.一种纯化生物样品的方法，其包含：
(a)在酸性条件下使所述生物样品与疏水性聚合物基阳离子交换材料接触，使得所述样品与所述阳离子交换材料结合，其中所述样品包含：
(i)肽，
(ii)单价阳离子污染物和/或疏水性污染物，和
(iii)亲水性污染物；
(b)用第一酸性溶液洗涤所述阳离子交换材料，其中所述第一酸性溶液包含大于20％(v/v)的挥发性有机溶剂、水和挥发性盐，使得所述肽保留在所述阳离子交换材料上并且从所述阳离子交换材料中去除所述单价阳离子和/或疏水性污染物；
(c)用第二酸性溶液洗涤所述阳离子交换材料，其中所述第二酸性溶液包含20％或更少(v/v)的挥发性有机溶剂、水和挥发性酸，其中所述肽保留在所述阳离子交换材料上并且去除所述亲水性污染物；和
(d)用碱性或中性溶液从所述阳离子交换材料中洗脱保留的肽，其中所述碱性或中性溶液包含挥发性有机溶剂、水和选自挥发性碱、挥发性盐以及其组合的挥发性化合物。
3.一种纯化生物样品的方法，其包含：
(a)在酸性条件下使所述生物样品与疏水性聚合物基阳离子交换材料接触，使得所述样品与所述阳离子交换材料结合，其中所述生物样品包含：
(i)肽，
(ii)单价阳离子污染物和/或疏水性污染物，和
(iii)亲水性污染物；
(b)用第一酸性溶液洗涤所述阳离子交换材料，其中所述第一酸性溶液包含20％或更少(v/v)的挥发性有机溶剂、水和挥发性酸，使得肽保留在所述阳离子交换材料上并且从所述阳离子交换材料中去除所述亲水性污染物；
(c)用第二酸性溶液洗涤所述阳离子交换材料，其中所述第二酸性溶液包含大于20％(v/v)的挥发性有机溶剂、水和挥发性盐，其中所述肽保留在所述阳离子交换材料上并且从所述阳离子交换材料中去除所述单价阳离子和/或疏水性污染物；和
(d)用碱性或中性溶液从所述阳离子交换材料中洗脱保留的肽，其中所述碱性或中性溶液包含挥发性有机溶剂、水和选自挥发性碱、挥发性盐以及其组合的挥发性化合物。
4.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述亲水性污染物为中性污染物、阴离子污染物或其组合。
5.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述生物样品另外包含盐、去污剂、脂质、小的中性分子或其组合
6.根据前述条款中任一项所述的方法，其包含在pH 1至5下使所述样品与所述疏水性聚合物基阳离子交换材料接触。
7.根据前述条款中任一项所述的方法，其包含在pH 1至5下洗涤所述阳离子交换材料。
8.根据前述条款中任一项所述的方法，其包含在大于pH 5(例如，5至11)下从所述阳离子交换材料中洗脱所述样品。
9.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述单价阳离子污染物选自由以下组成的组：铵、钠、钾、三(羟甲基)氨基甲烷(tris)、羟胺、乙醇胺、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)(PIPES)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸(EPPS)、甘氨酸、质量标签以及其组合。
10.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述单价阳离子污染物为或包含质量标签或其衍生物。
11.根据前述条款中任一项所述的方法，其中疏水性污染物为脂质或去污剂。
12.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述亲水性污染物为盐、核酸或碳水化合物。
13.根据前述条款中任一项所述的方法，在使所述生物样品与所述阳离子交换材料接触之前，用蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶或Lys-C)处理所述生物样品以产生所述肽。
14.一种用于纯化包含肽的生物样品的试剂盒，其包含：
(a)疏水性聚合物基阳离子交换材料；
(b)包含挥发性盐、水和大于20％(v/v)的挥发性有机溶剂的酸性溶液；
(c)包含挥发性碱、水和挥发性有机溶剂的中性或碱性溶液；和
(d)使用所述试剂盒纯化所述生物样品的说明。
15.一种用于纯化包含肽的生物样品的试剂盒，其包含：
(a)疏水性聚合物基阳离子交换材料；
(b)包含大于20％(v/v)的挥发性有机溶剂、挥发性盐和水的酸性溶液，
(c)包含20％或更少(v/v)的挥发性有机溶剂、挥发性盐和水的酸性溶液；
(d)包含挥发性碱、水和挥发性有机溶剂的中性或碱性溶液；和
(e)使用所述试剂盒纯化所述生物样品的说明。
16.根据前述条款中任一项所述的方法或试剂盒，其中所述疏水性聚合物基阳离子交换材料为磺化二乙烯基苯聚苯乙烯、磺化聚二乙烯基苯或磺化二乙烯基苯/聚苯乙烯/吡咯烷酮树脂。
17.根据前述条款中任一项所述的方法或试剂盒，其中所述肽包含2至50个氨基酸残基。
18.根据前述条款中任一项所述的方法或试剂盒，其中所述挥发性盐包含挥发性酸和挥发性碱。
19.根据前述条款中任一项所述的方法或试剂盒，其中所述挥发性酸选自由以下组成的组：甲酸、乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸。
20.根据前述条款中任一项所述的方法或试剂盒，其中所述挥发性碱选自由以下组成的组：三甲胺、氨、三乙胺、哌啶和丁胺。
21.根据前述条款中任一项所述的方法或试剂盒，其中所述挥发性有机溶剂选自由以下组成的组：乙腈、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丙酮以及其组合。
21.根据前述条款中任一项所述的方法或试剂盒，其中所述样品包含两种或更多种肽。
22.根据前述条款中任一项所述的方法或试剂盒，其中所述样品为消化的蛋白质或多肽。
23.根据前述条款中任一项所述的方法，其包含用碱性或中性溶液从所述阳离子交换材料中洗脱保留的肽，其中所述碱性或中性溶液包含挥发性有机溶剂、水和挥发性盐。

Claims (24)

1.一种纯化生物样品的方法，其包含：
(a)在酸性条件下使所述生物样品与疏水性聚合物基阳离子交换材料接触，使得所述样品与所述阳离子交换材料结合，其中所述样品包含：
(i)肽，和
(ii)单价阳离子污染物和/或疏水性污染物；
(b)用酸性溶液洗涤所述阳离子交换材料，其中所述酸性溶液包含大于20％(v/v)的挥发性有机溶剂、水和挥发性盐，使得所述肽保留在所述阳离子交换材料上并且从所述阳离子交换材料中去除所述单价阳离子和/或疏水性污染物；和
(c)用碱性或中性溶液从所述阳离子交换材料中洗脱保留的肽，其中所述碱性或中性溶液包含挥发性有机溶剂、水和选自挥发性碱、挥发性盐以及其组合的挥发性化合物。
2.一种纯化生物样品的方法，其包含：
(a)在酸性条件下使所述生物样品与疏水性聚合物基阳离子交换材料接触，使得所述样品与所述阳离子交换材料结合，其中所述样品包含：
(i)肽，
(ii)单价阳离子污染物和/或疏水性污染物，和
(iii)亲水性污染物；
(b)用第一酸性溶液洗涤所述阳离子交换材料，其中所述第一酸性溶液包含大于20％(v/v)的挥发性有机溶剂、水和挥发性盐，使得所述肽保留在所述阳离子交换材料上并且从所述阳离子交换材料中去除所述单价阳离子和/或疏水性污染物；
(c)用第二酸性溶液洗涤所述阳离子交换材料，其中所述第二酸性溶液包含20％或更少(v/v)的挥发性有机溶剂、水和挥发性酸，其中所述肽保留在所述阳离子交换材料上并且去除所述亲水性污染物；和
(d)用碱性或中性溶液从所述阳离子交换材料中洗脱保留的肽，其中所述碱性或中性溶液包含挥发性有机溶剂、水和选自挥发性碱、挥发性盐以及其组合的挥发性化合物。
3.一种纯化生物样品的方法，其包含：
(a)在酸性条件下使所述生物样品与疏水性聚合物基阳离子交换材料接触，使得所述样品与所述阳离子交换材料结合，其中所述生物样品包含：
(i)肽，
(ii)单价阳离子污染物和/或疏水性污染物，和
(iii)亲水性污染物；
(b)用第一酸性溶液洗涤所述阳离子交换材料，其中所述第一酸性溶液包含20％或更少(v/v)的挥发性有机溶剂、水和挥发性酸，使得肽保留在所述阳离子交换材料上并且从所述阳离子交换材料中去除所述亲水性污染物；
(c)用第二酸性溶液洗涤所述阳离子交换材料，其中所述第二酸性溶液包含大于20％(v/v)的挥发性有机溶剂、水和挥发性盐，其中所述肽保留在所述阳离子交换材料上并且从所述阳离子交换材料中去除所述单价阳离子和/或疏水性污染物；和
(d)用碱性或中性溶液从所述阳离子交换材料中洗脱保留的肽，其中所述碱性或中性溶液包含挥发性有机溶剂、水和选自挥发性碱、挥发性盐以及其组合的挥发性化合物。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述亲水性污染物为中性污染物、阴离子污染物或其组合。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品另外包含盐、去污剂、脂质、小的中性分子或其组合
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包含在pH 1至5下使所述样品与所述疏水性聚合物基阳离子交换材料接触。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包含在pH 1至5下洗涤所述阳离子交换材料。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包含在大于pH 5(例如，5至11)下从所述阳离子交换材料中洗脱所述样品。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述单价阳离子污染物选自由以下组成的组：铵、钠、钾、三(羟甲基)氨基甲烷(tris)、羟胺、乙醇胺、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)(PIPES)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸(EPPS)、甘氨酸、质量标签以及其组合。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述单价阳离子污染物为或包含质量标签或其衍生物。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中疏水性污染物为脂质或去污剂。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述亲水性污染物为盐、核酸或碳水化合物。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，在使所述生物样品与所述阳离子交换材料接触之前，用蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶或Lys-C)处理所述生物样品以产生所述肽。
14.一种用于纯化包含肽的生物样品的试剂盒，其包含：
(a)疏水性聚合物基阳离子交换材料；
(b)包含挥发性盐、水和大于20％(v/v)的挥发性有机溶剂的酸性溶液；
(c)包含挥发性碱、水和挥发性有机溶剂的中性或碱性溶液；和
(d)使用所述试剂盒纯化所述生物样品的说明。
15.一种用于纯化包含肽的生物样品的试剂盒，其包含：
(a)疏水性聚合物基阳离子交换材料；
(b)包含大于20％(v/v)的挥发性有机溶剂、挥发性盐和水的酸性溶液，
(c)包含20％或更少(v/v)的挥发性有机溶剂、挥发性盐和水的酸性溶液；
(d)包含挥发性碱、水和挥发性有机溶剂的中性或碱性溶液；和
(e)使用所述试剂盒纯化所述生物样品的说明。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法或试剂盒，其中所述疏水性聚合物基阳离子交换材料为磺化二乙烯基苯聚苯乙烯、磺化聚二乙烯基苯或磺化二乙烯基苯/聚苯乙烯/吡咯烷酮树脂。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法或试剂盒，其中所述肽包含2至50个氨基酸残基。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法或试剂盒，其中所述挥发性盐包含挥发性酸和挥发性碱。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法或试剂盒，其中所述挥发性酸选自由以下组成的组：甲酸、乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法或试剂盒，其中所述挥发性碱选自由以下组成的组：三甲胺、氨、三乙胺、哌啶和丁胺。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法或试剂盒，其中所述挥发性有机溶剂选自由以下组成的组：乙腈、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丙酮以及其组合。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法或试剂盒，其中所述样品包含两种或更多种肽。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法或试剂盒，其中所述样品为消化的蛋白质或多肽。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包含用碱性或中性溶液从所述阳离子交换材料中洗脱保留的肽，其中所述碱性或中性溶液包含挥发性有机溶剂、水和挥发性盐。
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