KR20220079844A - 펩티드 정제 제제 및 방법 - Google Patents

Abstract

생물학적 샘플로부터의 펩티드의 정제를 위한 개선된 제제 및 생물학적 샘플(예를 들어 세포 및 조직)로부터 펩티드를 정제하기 위한 방법 및 키트뿐만 아니라 질량 분석(예를 들어 LC-MS) 응용 분야에서의 정제된 펩티드(예를 들어 단백질 분해물로부터 유래된 폴리펩티드)의 용도가 기술된다.

Description

펩티드 정제 제제 및 방법

생물학적 샘플로부터의 펩티드의 정제를 위한 제제 및 생물학적 샘플로부터 펩티드(예를 들어 단백질 분해물로부터 유래된 폴리펩티드)를 정제하기 위한 방법 및 키트뿐만 아니라 질량 분석과 같은 다운스트림 응용 분야에서의 정제된 펩티드의 용도가 기술된다.

질량 분석(MS: Mass spectrometry)은 번역 후 변형을 포함한, 단백질과 이들의 아미노산 서열을 분석하기 위한 강력한 도구이다. MS 분석을 위한 단백질 샘플을 제조하는 전형적인 방법은 먼저 단백질을 효소(예를 들어 트립신, Lys-C 등)로 분해하여 더 작은 펩티드 단편의 혼합물을 생성한 다음, LC-MS 시스템 상에서 상기 단편을 분석하여 정성적 및/또는 정량적 단백질체 정보를 추출하는 것(본원에서 "상향식" 단백질체학 워크플로우("bottom-up" proteomics workflow)로 지칭됨)이다. 전형적인 "상향식" 단백질체학 워크플로우에서, 단백질은 일반적으로, 분해 전에 생물학적 샘플로부터 추출되어야 한다. 생물학적 샘플(예를 들어 조직, 배양된 세포 및 생물학적 유체)은 다양한 소분자, 탄수화물, 지질, 핵산, 염, 펩티드, 및 단백질을 함유하는 복잡한 매트릭스이다. 이들 성분 중 대부분은 해당 생물학적 샘플에 고유하며, 일부는, 단백질의 용해도를 개선하거나, 단백질/펩티드에 원하는 화학적 변형을 도입하거나, 또는 단백질 분해 동안 단백질 분해 활성을 위한 최적의 pH를 유지하기 위해, 샘플 제조 도중에 첨가된다. 크로마토그래피 간섭, 이온화 억제 및 LC 배관 성분의 막힘을 방지하기 위해 LC-MS 분석 전에 샘플 매트릭스로부터 비-펩티드(non-peptide) 종을 최대한 제거하는 것이 중요한다. 이 정화 단계는 일반적으로 "샘플 탈염"으로 알려져 있다. 전통적으로, 이 절차는 고체상 추출(SPE: solid phase extraction) 크로마토그래피를 사용하여 역상 수지 상에서 수행되며, 여기서 샘플은 먼저 산성화된 다음 수용액 중의 상기 수지 상에 로딩된다. 상기 샘플이 상기 수지에 로딩되고 나면, 상기 수지는 수용액으로 세척되어 작은 친수성 분자와 이온을 제거한다. 펩티드는 소수성 상호작용에 의해 상기 수지에 결합된 상태로 남아 있으며, 유기 용매를 함유하는 산성 용액(예를 들어 물 중의 50% 아세토니트릴)으로 용출된다. 이 탈염 방법의 단점은 지질 및 세제와 같은 소수성 분자도 상기 수지에 결합하여 상기 펩티드 샘플과 함께 공동-용출된다는 것이다. 결과적으로, 상기 펩티드 샘플은 상기 소수성 분자로 오염되어, 데이터 품질이 떨어지고 LC 장비가 손상될 수 있다. 따라서, 생물학적 샘플로부터 단백질 및 펩티드를 정제하기 위한 개선된 제제, 대안적인 고정상, 및 탈염 용액 제제 및 방법이 필요하며, 여기서, 이들에 의한 단백질 및 펩티드는 LC-MS에 의한 고품질 분석에 대해 충분히 순수하다.

일 양태에서, 펩티드를 포함하는 샘플을 정제하는 데 사용하기 위한 방법 및 키트가 본원에 개시된다. 상기 샘플은 생물학적 기원의 것들, 합성으로 제조된 것들 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 펩티드는 2 내지 50개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 샘플은 2개 이상의 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 샘플은 분해된 단백질 또는 폴리펩티드이다. 상기 샘플은 염, 세제, 지질, 작은 중성 분자, 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 상기 샘플은 하나 이상의 오염물을 추가로 포함할 수 있다. 상기 오염물은 친수성 오염물, 예를 들어 중성 오염물, 음이온성 오염물, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 샘플은 소수성 오염물, 예를 들어 지질 또는 세제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 친수성 오염물은 염, 핵산, 또는 탄수화물이다. 일부 실시형태에서, 상기 샘플은 1가 양이온성 오염물, 예를 들어 암모늄, 나트륨, 칼륨, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(tris), 하이드록실아민, 에탄올아민, HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), PIPES(피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), EPPS(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진프로판설폰산), 글리신, 질량 태그(mass tag), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 1가 양이온성 오염물은 질량 태그 또는 이의 유도체이거나 또는 이를 포함한다.

다른 양태에서, 샘플(예를 들어 생물학적 샘플)을 정제하는 방법이 제공되며, 이는,

(a) 상기 생물학적 샘플을 산성 조건 하에 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질과 접촉시켜, 상기 샘플이 상기 양이온 교환 물질에 결합하도록 하는 단계로서, 상기 샘플은 (i) 펩티드, 및 (ii) 1가 양이온성 오염물 및/또는 소수성 오염물을 포함하는, 단계;

(b) 상기 양이온 교환 물질을 20%(v/v) 초과의 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 염을 포함하는 산성 용액으로 세척하여, 상기 펩티드는 상기 양이온 교환 물질 상에 보유되도록 하고 상기 1가 양이온성 및/또는 소수성 오염물은 상기 양이온 교환 물질로부터 제거되도록 하는 단계; 및

(c) 알칼리성 또는 중성 용액을 사용하여 상기 양이온 교환 물질로부터, 보유된 펩티드를 용출시키는 단계로서, 상기 알칼리성 또는 중성 용액은 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 염기, 휘발성 염 및 이들의 조합으로부터 선택된 휘발성 화합물을 포함하는, 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서, 샘플(예를 들어 생물학적 샘플)을 정제하는 방법이 제공되며, 이는,

(a) 상기 생물학적 샘플을 산성 조건 하에 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질과 접촉시켜, 상기 샘플이 상기 양이온 교환 물질에 결합하도록 하는 단계로서, 상기 샘플은 (i) 펩티드, 및 (ii) 1가 양이온성 오염물 및/또는 소수성 오염물, 및 (iii) 친수성 오염물을 포함하는, 단계;

(b) 상기 양이온 교환 물질을 20%(v/v) 초과의 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 염을 포함하는 제1 산성 용액으로 세척하여, 상기 펩티드는 상기 양이온 교환 물질 상에 보유되도록 하고 상기 1가 양이온성 및/또는 소수성 오염물은 상기 양이온 교환 물질로부터 제거되도록 하는 단계;

(c) 상기 양이온 교환 물질을 20%(v/v) 이하의 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 산을 포함하는 제2 산성 용액으로 세척하는 단계로서, 상기 펩티드는 상기 양이온 교환 물질 상에 보유되고 상기 친수성 오염물은 제거되는, 단계; 및

(d) 알칼리성 또는 중성 용액을 사용하여 상기 양이온 교환 물질로부터, 보유된 펩티드를 용출시키는 단계로서, 상기 알칼리성 또는 중성 용액은 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 염기, 휘발성 염 및 이들의 조합으로부터 선택된 휘발성 화합물을 포함하는, 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서, 샘플(예를 들어 생물학적 샘플)을 정제하는 방법이 제공되며, 이는,

(a) 상기 생물학적 샘플을 산성 조건 하에 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질과 접촉시켜, 상기 샘플이 상기 양이온 교환 물질에 결합하도록 하는 단계로서, 상기 생물학적 샘플은 (i) 펩티드, (ii) 1가 양이온성 오염물 및/또는 소수성 오염물, 및 (iii) 친수성 오염물을 포함하는, 단계;

(b) 상기 양이온 교환 물질을 20%(v/v) 이하의 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 산을 포함하는 제1 산성 용액으로 세척하여, 상기 펩티드는 상기 양이온 교환 물질 상에 보유되도록 하고 상기 친수성 오염물은 상기 양이온 교환 물질로부터 제거되도록 하는 단계;

(c) 상기 양이온 교환 물질을 20%(v/v) 초과의 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 염을 포함하는 제2 산성 용액으로 세척하는 단계로서, 상기 펩티드는 상기 양이온 교환 물질 상에 보유되고 상기 1가 양이온성 및/또는 소수성 오염물은 상기 양이온 교환 물질로부터 제거되는, 단계; 및

(d) 알칼리성 또는 중성 용액을 사용하여 상기 양이온 교환 물질로부터, 보유된 펩티드를 용출시키는 단계로서, 상기 알칼리성 또는 중성 용액은 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 염기, 휘발성 염 및 이들의 조합으로부터 선택된 휘발성 화합물을 포함하는, 단계를 포함한다.

본원에 개시된 방법 중 임의의 것에서, 상기 샘플은 pH 1 내지 5에서 상기 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질과 접촉될 수 있고/거나; 상기 양이온 교환 물질은 pH 1 내지 5에서 세척될 수 있고/거나; 상기 샘플은 pH 5 초과(예를 들어 5 내지 11)에서 상기 양이온 교환 물질로부터 용출될 수 있다. 특정 방법에서, 보유된 펩티드는 알칼리성 또는 중성 용액을 사용하여 상기 양이온 교환 물질로부터 용출될 수 있고, 여기서 상기 알칼리성 또는 중성 용액은 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 염을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은, 상기 생물학적 샘플을 상기 양이온 교환 물질과 접촉시키기 전에, 상기 생물학적 샘플을 단백질 분해 효소(예를 들어, 트립신 또는 Lys-C)로 처리하여 상기 펩티드를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 양태에서, 펩티드를 포함하는 생물학적 샘플을 정제하기 위한 키트가 제공된다. 상기 키트는 하기를 포함할 수 있다: (a) 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질; (b) 휘발성 염, 물, 및 20%(v/v) 초과의 휘발성 유기 용매를 포함하는 산성 용액; (c) 휘발성 염기, 물 및 휘발성 유기 용매를 포함하는 중성 또는 알칼리성 용액; 및 (d) 상기 키트를 사용하여 상기 생물학적 샘플을 정제하기 위한 지침.

또 다른 양태에서, 펩티드를 포함하는 생물학적 샘플을 정제하기 위한 키트가 제공된다. 상기 키트는 하기를 포함할 수 있다: (a) 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질; (b) 20%(v/v) 초과의 휘발성 유기 용매, 휘발성 염, 및 물을 포함하는 산성 용액, (c) 20%(v/v) 이하의 휘발성 유기 용매, 휘발성 염, 및 물을 포함하는 산성 용액; (d) 휘발성 염기, 물, 및 휘발성 유기 용매를 포함하는 중성 또는 알칼리성 용액; 및 (e) 상기 키트를 사용하여 상기 생물학적 샘플을 정제하기 위한 지침.

본원에 제공된 방법 및 키트 중 임의의 것에서, 상기 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질은 설폰화 디비닐 벤젠 폴리스티렌, 설폰화 폴리디비닐 벤젠, 또는 설폰화 디비닐 벤젠/폴리스티렌/피롤리돈 수지일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 휘발성 염은 휘발성 산 및 휘발성 염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 휘발성 산은 포름산, 아세트산, 트리플루오르아세트산, 또는 트리클로로아세트산일 수 있다. 휘발성 염기의 대표적인 예는 트리메틸아민, 암모니아, 트리에틸아민, 피페리딘, 및 부틸아민을 포함한다. 본원에 제공된 방법 및 키트 중 임의의 것에서, 상기 휘발성 유기 용매는 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소-프로판올, 아세톤, 또는 이들의 조합일 수 있다.

도 1은 다수의 세척제 용액을 사용하는 펩티드 정제 방법의 개략도이다.
도 2는, TMT 시약으로 표지되고 0.1% 포름산을 함유하는 세척제 B 용액(도 2a), 0.1%(v/v) 포름산 및 0.1%(v/v) 트리에틸아민을 함유하는 세척제 B 용액(도 2b), 및 0.5%(v/v) 포름산 및 0.5%(v/v) 트리에틸아민을 함유하는 세척제 B 용액(도 2c)을 사용하여 정화된 HeLa 세포 단백질 분해물들의 MS (총 이온) 크로마토그램을 나타낸다. 크로마토그램의 박스 영역은 TMT 유래 이온(켄칭 및 가수분해됨)으로 인한 신호를 나타낸다.
도 3a는 정화 후 펩티드 수율의 시각적 및 분광학적 평가를 위한 정량적 비색 펩티드 분석의 일련의 이미지를 나타낸다. TMT 시약으로 표지되고 0.1% 포름산을 함유하는 세척제 B 용액 (A), 0.1%(v/v) 포름산 및 0.1%(v/v) 트리에틸아민을 함유하는 세척제 B 용액 (B), 및 0.5%(v/v) 포름산 및 0.5%(v/v) 트리에틸아민을 함유하는 세척제 B 용액 (C)을 사용하여 정화된 HeLa 세포 단백질 분해물들. 도 3b는 전술된 세척제 용액을 사용하여 처리된 샘플에 대한 펩티드 수율을 비교하는 막대 그래프이다. 잔류 TMT 시약의 존재로 인해, 세척제 B 용액 (A)으로 정화된 샘플은 TEA를 포함하는 완충제로 처리된 샘플로부터의 신호보다 5배가 넘는 신호를 생성하였다.
도 4a는 다양한 세척제 용액으로 세척된 TMT-표지된 펩티드 샘플의 LC-MS 분석으로부터 획득된 MS/MS 스펙트럼의 수를 나타낸다. 도 4b는 다양한 세척제 용액으로 세척된 TMT-표지된 펩티드 샘플의 LC-MS 분석으로부터 식별된 펩티드 스펙트럼 매치(PSM: peptide spectral match)의 수를 나타낸다. 도 4c는 다양한 세척제 용액으로 세척된 TMT-표지된 펩티드 샘플의 LC-MS 분석으로부터 식별된 고유한 펩티드의 수를 나타낸다. 도 4d는 다양한 세척제 용액으로 세척된 TMT-표지된 펩티드 샘플의 LC-MS 분석으로부터 식별된 단백질 군의 수를 나타낸다.
도 5a는 다양한 세척제 용액으로 세척된 다양한 펩티드 샘플 양의 LC-MS 분석으로부터 식별된 단백질 군을 나타낸다. 도 5b는 다양한 세척제 용액으로 세척된 다양한 펩티드 샘플 양의 LC-MS 분석으로부터 식별된 고유한 펩티드를 나타낸다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 특허, 출원, 공개된 출원 및 다른 간행물은 그 전체 내용이 인용되어 본원에 포함된다. 이 섹션에 제시된 정의가 원용에 의해 본원에 포함된 특허, 출원, 공개된 출원 및 다른 간행물에 제시된 정의와 모순되거나 또는 일치하지 않는 경우, 이 섹션에서 열거된 정의는 인용되어 본원에 포함된 정의에 우선한다.

본원에서 사용되는, 단수 표현은 "적어도 하나의" 또는 "하나 이상의"를 의미한다.

본원에서 사용되는, 용어 "약"은, 수치를 기술하기 위해 사용되는 경우, 문맥에서 달리 명시하지 않는 한, 그 수치의 최대 ± 15%의 범위를 포함한다.

조성물 및 방법이 다양한 성분 또는 단계를 "포함하는(comprising)" ("~을 포함하지만 이에 제한되지 않는"을 의미하는 것으로 해석됨) 것으로 기술되는 경우, 상기 조성물 및 방법은 또한 상기 다양한 성분 및 단계로 "본질적으로 구성(consist essentially of)"되거나 또는 "구성될(consist of)" 수 있으며, 이러한 용어는 본질적으로 폐쇄된-멤버 그룹을 정의하는 것으로 해석되어야 한다.

본원에서 사용되는, "생물학적 샘플"은, 혈액학적, 세포학적 및 조직학적 시료, 예를 들어 세포, 세포 배양물, 단세포 유기체(예를 들어 효모 및 박테리아), 3D 세포 배양물(예를 들어 스페로이드(spheroid) 및 오르가노이드(organoid)), 조직, 완전체 유기체(예를 들어 파리 또는 벌레), 세포-불포함 추출물, 또는 유체 샘플(예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장 또는 가래)을 지칭한다. 생물학적 샘플은 여과 및/또는 원심분리에 의해 처리된 샘플을 지칭할 수 있으며, 분해된 세포 또는 균질화된 조직 및 세포 배양물의 상청액을 지칭할 수 있다. 조직 시료는 임의의 유형의 신경, 표피, 근육, 또는 결합 조직일 수 있고, 이는 장기 조직을 포함한다. 조직 시료는 일반적인 조직학적 기술을 사용하여 보존되거나, 고정되거나, 동결되거나, 또는 신선할 수 있다. 생물학적 샘플은 식물 또는 동물(예를 들어, 인간, 마우스, 파리, 벌레, 물고기, 개구리, 진균 등) 유래일 수 있다.

본원에서 사용되는, "정제하는" 또는 "정제"는 순수한 또는 실질적으로 순수한 형태의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 제조를 지칭한다. 정제는 또한, 샘플로부터 유래하는 오염물 또는 샘플 취급 중에 도입되는 오염물을 포함한, 샘플로부터의 오염물의 제거를 지칭한다. 특히, 생물학적 샘플로부터 소수성, 친수성, 및 양이온성 오염물을 제거하기 위한 제제 및 방법이 본원에 제공된다. 펩티드 또는 폴리펩티드의 샘플은, 질량 분석 및/또는 UV/vis 분광법으로 측정했을 때, 비-펩티드 및 비-폴리펩티드(non-polypeptide) 화합물이 본질적으로 제거된 경우(즉, 펩티드가, 검출 수준보다 높은 유일한 피분석물인 경우), 순수하거나 실질적으로 순수한 것으로 간주된다. 샘플 내의 정제된 펩티드 및 폴리펩티드의 수준이 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%인 경우, 상기 샘플은 순수하거나 실질적으로 순수한 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 정제된 펩티드 및 폴리펩티드의 수준은 약 80% 초과; 또는 약 90% 초과; 또는 약 95% 초과이다. 일부 실시형태에서, 상기 샘플은 오염물을 포함하지 않는다(즉, 정제된 펩티드 및 폴리펩티드의 수준이 100%임). 상기 샘플이 액체 형태인 경우, 순도 수준은 중량/부피(w/v) 백분율로 평가된다. 상기 샘플이 고체(예를 들어, 동결건조된) 형태인 경우, 순도 수준은 중량/중량(w/w) 백분율로 평가된다.

본원에서 사용되는, "펩티드" 및 "폴리펩티드"는, 2개 이상의 아미노산 잔기로부터 형성된 중합체 사슬을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용되며, 여기서 아미노산 잔기 쌍은 펩티드 결합을 통해 공유 결합된다. 본원에서 사용되는, 펩티드는 2 내지 50개의 아미노산을 포함한다. 펩티드는 번역 후 변형, 또는 인산화, 당화, 글리코실화 및 메틸화를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 유형의 변형을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는, "펩티드"는 단일 펩티드 화합물 또는 2개 이상의 펩티드 화합물의 혼합물을 지칭할 수 있다. 본원에서 사용되는, "펩티드"는 한 아미노산의 카르복실기와 다른 아미노산의 아미노기의 축합 반응에 의해 화학적으로 합성될 수 있다. 본원에서 사용되는, "펩티드"는 또한, 단백질 분해 효소(예를 들어, 트립신, Lys-C, AspN 또는 GluC)를 사용하는 단백질의 분해, 또는 단백질 아미드 결합을 선별적으로 가수분해하는 화학 반응에 의해 생성될 수 있다. 펩티드는 또한, N-말단, C-말단 및/또는 측쇄에 하나 이상의 전하 또는 잠재적으로 하전된 기(pH에 따라 다름)를 가질 수 있다. 단백질 분해 효소로 분해될 때, 단백질은 적어도 하나의 전하를 보유하는 펩티드를 생성하고, 펩티드는 종종 적어도 2개의 양전하를 보유한다. 상기 펩티드는 N-말단, C-말단 및/또는 측쇄에 하나 이상의 전하 또는 잠재적으로 하전된 기를 포함하기 때문에, 하나 이상의 양이온 및/또는 하나 이상의 음이온이 전형적으로 상기 펩티드 또는 폴리펩티드와 결합되어 상기 화합물을 정전기적으로 중성으로 유지한다. 반대이온의 대표적인 예는 알칼리 금속 이온, 알칼리 토금속 이온, 할로겐화물, 황산염, 탄산염, 인산염, 및 아세트산염을 포함한다.

본원에서 사용되는, "질량 태그" 및 "탠덤 질량 태그(tandem mass tag)"는 질량 분광분석에 의해 구별될 수 있는 하나 이상의 안정한 동위원소를 함유하는 화학적 표지 시약을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. "질량 태그"는 또한, 동일한 화학 구조를 갖지만, 상이한 수의 안정한 동위원소 또는 이소토폴로그(isotopologue)를 갖는 시약들의 세트를 지칭한다. "질량 태그"는 또한, 동일한 화학 구조 및 동일한 수의 안정한 동위원소를 갖지만, 화학 구조 내의 다른 분포를 갖는 시약들의 세트를 지칭할 수 있으며, 이는 질량 분석기에서 기체상 단편화 후의 질량에 의해 구별될 수 있다. 본원에서 사용되는, "질량 태그"는 또한, 2개 이상의 샘플에서 분자를 공유 결합으로 표지하는 데 사용될 수 있는 시약들의 세트를 지칭한다. 질량 분광분석을 위해 상기 두 개 이상의 샘플이 하나의 샘플로 조합될 수 있다. 일부 실시형태에서, "질량 태그"는 생물학적 샘플로부터 유래된 핵산, 펩티드, 탄수화물, 지질, 또는 기타 소분자를 공유 결합으로 표지하기 위해 사용될 수 있다.

조직, 세포 및 생물학적 유체와 같은 생물학적 샘플로부터 유래된 펩티드 및 단백질 분해 분해물을 정제하기 위한 방법, 제제, 및 키트가 기술된다. 일반적으로, 생물학적 샘플로부터 유래된 펩티드로부터 오염물을 제거하기 위한 방법 및 제제가 본원에 기술된다. 생물학적 시료로부터 유래된 샘플은 다양한 소수성, 친수성 및 이온성 오염물을 함유할 수 있다. 오염물은 상기 생물학적 샘플 자체로부터 유래하거나, 또는 상기 생물학적 샘플을 처리하는 동안 도입될 수 있다. 기술된 방법은 상기 샘플로부터 원치 않는 오염물을 제거하기 위한 일련의 세척 단계를 실행한다. 공지된 정제 방법에 대비한 본원에 개시된 방법 및 관련 세척제 용액의 특정 이점은, (기원에 관계없이) 소수성 및 친수성 1가 양이온성 오염물 둘 모두가 상기 샘플로부터 제거될 수 있다는 점이다. 따라서, 오염물이 충분히 없는 고순도 펩티드가 제공될 수 있다. 단리된 펩티드는 극도로 순수한 샘플을 요구하는 까다로운 다운스트림 응용 분야 및 분석(예를 들어 LC-MS)에 사용하기에 적합하다. 상기 생물학적 샘플로부터 원치 않는 파편 및 성분(예를 들어 염, 지방, 지질, 당 등)을 제거하는 것은, 기기 손상을 방지하고(예를 들어, 원치 않는 이온을 제거함으로써) MS 단백질체학 데이터의 품질을 개선할 수 있다. 예를 들어, LC-MS 응용 분야에 사용되는 경우, 본 방법에 따라 정제된 펩티드는 크로마토그래피 간섭, 이온화 억제 및 액체 크로마토그래피(LC) 배관 성분의 막힘을 최소화할 수 있다. 또한, 오염물을 제거하면, 더 적은 전하 상태(예를 들어 M+, M+2, M+3 등) 및/또는 전하 종(예를 들어 M+Na, M+2Na 등)과 함께 기체상에서의 샘플 복잡성의 감소로 인해 LC-MS 펩티드 및 단백질 식별 속도가 개선된다. 개선된 LC-MS 스펙트럼 품질은 또한, 데이터베이스 검색, 스펙트럼 라이브러리 매칭 또는 드 노보 시퀀싱(de novo sequencing)을 사용하는 데이터 분석 동안의 펩티드 및 단백질 식별 속도를 개선할 수 있다.

기술된 방법 및 제제는 표준 역상 및 양이온 교환 크로마토그래피 수지를 실행하는 기존 정제 방법보다 개선되었다. 상기에서 논의된 바와 같이, 역상 탈염 방법의 단점은, 지질 및 세제와 같은 소수성 분자가 소수성 상호작용에 의해 상기 수지에 결합된 상태로 남아 있을 수 있다는 것이다. 유기 용매를 함유하는 산성 용액을 사용하여 상기 수지로부터 결합된 펩티드를 용출시킬 때, 상기 소수성 분자도 용출되어 상기 펩티드 샘플을 오염시킬 수 있다. 생물학적 샘플로부터의 펩티드의 정제를 위한 역상 수지의 사용과 관련된 단점 중 일부를 해결하기 위해, 펩티드 샘플 정화를 위한 역상 접근법에 대한 대안으로서 강력한 양이온 교환 수지가 사용될 수 있다.

양이온 교환 수지를 사용하는 대표적인 방법 중 하나에서, 상기 샘플은 산성화되고, 수용액 중의 양이온 교환 수지 상에 로딩된다. 친수성 음이온성 및 중성 종은 상기 수지를 통과하는 반면, 모든 양이온성 및 소수성 종은, 각각 이온 교환 또는 소수성 상호작용에 의해 상기 수지에 결합된 상태로 유지된다. 그런 다음, 상기 수지는 낮은 이온 강도의 제1 산성 수용액(예를 들어, 물 중의 0.1% 포름산)으로 세척되어, 수지 매트릭스로부터 임의의 과잉 친수성 양이온을 제거한다. 다음으로, 상기 수지는, 동일한 이온 강도 및 산도를 갖지만 유기 용매 성분을 갖는 용액(예를 들어 70% 아세토니트릴 중의 0.1% 포름산)으로 세척된다. 상기 제2 세척제 용액은 소수성 상호작용에 의해, 상기 수지에 결합된 중성 및 음이온성 소수성 종(예를 들어 지질, 세제 등)을 제거한다. 상기 제2 세척제 용액으로 처리한 후, 상기 샘플로부터의 양이온 종만이 상기 수지에 결합된 상태로 남는다(예를 들어 원자 양이온, 예를 들어 나트륨, 다양한 소형/대형 아민, 및 펩티드). 그런 다음, 상기 펩티드 상의 카르복실산기를 이온화하고 상기 수지에 대한 아미노기의 친화도를 감소시키기 위한 높은 pH에서, 임의의 소수성 상호작용을 제거하기 위해 유기 용매 성분을 포함하는 염기성 용액을 사용하여, 펩티드를 용출시킨다. 또한, 상기 용출 용액의 이온 강도는, 양이온 교환 결합 부위에 대해 상기 펩티드 아미노기와 경쟁하기에 충분한 것(예를 들어, 0.1%(v/v) 이상)이 바람직하다. 대표적인 용출 용액은 30% 이상의 아세토니트릴(ACN: acetonitrile) 유기 용매 중의 암모니아 또는 트리메틸아민(TEA: trimethylamine)의 조합을 포함할 수 있다.

트립신을 사용한 단백질 분해로부터 생성된 모든 펩티드는 낮은 pH에서, N-말단 및 C-말단의 리신/아르기닌 잔기에 적어도 2개의 양전하를 함유한다는 점에 주목하는 것이 중요하다. 1가 및 2가 양이온 둘 모두가 상기 양이온 교환 수지에 결합된 상태로 남아 있을 수 있지만, 2가 양이온성 펩티드는, 단일 양전하를 갖는 양이온성 종보다, 상기 강한 양이온 교환 수지에 대한 친화도가 더 높다. 그 결과, 원치 않는 비-펩티드 양이온이 상기 펩티드와 함께 상기 수지로부터 용출된다. 이 문제를 해결하기 위해, 상기 수지로부터 비-펩티드 단일 전하 양이온성 종을 제거하면서 동시에, 소수성 상호작용에 의해 상기 수지에 결합된 중성 및 음이온성 소수성 종(예를 들어 지질, 세제 등)을 제거하는 개선된 방법 및 세척제 용액이 본원에 기술된다. 예상외로, 산성 pH 조건에서 휘발성 염의 다양한 제제를 사용하여 상기 세척제 용액의 이온 강도를 최적화함으로써, 상기 수지 상에서의 펩티드 보유를 유지하면서 동시에, 원치 않는 양이온의 제거를 최대화하는 것이 실현 가능하였다. 따라서, 기술된 제제 및 방법은 생물학적 샘플로부터 펩티드를 정제하기 위한 기존 방법에 비해 상당한 개선을 제공한다.

일 양태에서, 생물학적 샘플로부터 고순도의 펩티드를 단리하기 위한 방법이 제공되며, 여기서, 단리된 펩티드는 실질적으로 오염물을 포함하지 않는다. 상기 방법은 정제된 펩티드 샘플을 오염시킬 수 있는 원치 않는 종을 제거하기 위한 일련의 세척 단계를 포함한다. 상기 수지의 세척은, 크로마토그래피에 사용되는 고정상 수지 또는 기타 고체 물질이 액체 이동상 성분과 접촉되는 절차를 지칭한다. 크로마토그래피 지지체의 세척은 항온처리 및/또는 상기 수지를 세척 완충제와 혼합하는 것에 의해 수행될 수 있다. 세척은 또한, 원심분리, 진공, 중력, 양압, 또는 기타 수단을 사용하여 컬럼 형식의 수지에 세척 완충제를 통과시킴으로써 수행될 수도 있다. 공지된 정제 방법에 비한 본원에 개시된 방법의 특정 이점은, 소수성 및 친수성 단일양이온성 오염물 둘 모두가 상기 펩티드 샘플로부터 제거될 수 있다는 점이다. 정제된 펩티드는 추가 다운스트림 분석 및 극도로 순수한 샘플로부터 이익을 얻는 응용 분야에서 조사하기에 충분히 순수하다. 다운스트림 응용 분야의 예는 웨스턴 블롯팅, 면역침전/정제, 리간드 수용체 결합 분석, NMR 분광법, 비색 및 형광분석 정성적 및 정량적 분석, 및 LC-MS 분석을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 개선된 공정으로부터 생성된 펩티드의 순도는 LC-MS 분석과 관련된 샘플 품질 메트릭(metrics)(예를 들어 펩티드 및 단백질 식별, 샘플링 성공률 등)을 상당히 향상시킬 수 있다는 것이 발견되었다.

본원에 기술된 방법은 펩티드 및 단백질 샘플의 비교(즉, 상대적 정량화) 분석을 위한 질량 태그로 표지된 펩티드를 함유하는 샘플의 정제의 맥락에서 특정 이점을 제공한다. 예를 들어, (정화 전 또는 후의) 펩티드 샘플은 아민 반응성 탠덤 질량 태그(TMT: Tandem Mass Tag) 시약을 사용하여 N-말단 및 리신 잔기 측쇄에 표지될 수 있다. 낮은 pH에서, TMT 시약은 비휘발성 1가 양이온이다. 그러나, 상기 샘플 내의 과잉 TMT 시약은 비색 및 MS 기반 분석을 방해할 수 있다. 본원에 공개된 방법은 상기 샘플로부터의 과잉 TMT 시약의 제거를 제공한다. TMT 시약을 제거하면, MS 기반 분석에서 스펙트럼 간섭이 크게 감소하고, 샘플 펩티드 수율의 정량적 비색 분석 측정에서의 간섭이 감소하여, 펩티드 및 단백질 식별 수가 개선된다.

상기 생물학적 샘플은 펩티드(예를 들어, 단백질 또는 폴리펩티드의 분해로부터 생성된 펩티드) 뿐만 아니라 상기 생물학적 샘플로부터의 잔류 성분 및/또는 상기 샘플의 처리로부터 잔류하는 종을 포함할 수 있다. 오염물은 친수성 및/또는 소수성 종뿐만 아니라 하전된 종을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 생물학적 샘플은 염, 세제, 지질, 핵산 및 기타 유형의 소분자(예를 들어 탄수화물, 대사 산물, 뉴클레오티드 등)로 오염될 수 있다. 상기 샘플은 양이온성 및/또는 음이온성 종을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 샘플은 1가 및/또는 2가 양이온성 종을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 샘플은 상기 1가 및/또는 2가 양이온성 종 이외에, 친수성 오염물(예를 들어, 중성 또는 이온성 종)을 포함한다. 친수성 오염물의 예는 염, 핵산 및 탄수화물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 1가 양이온성 오염물의 대표적인 예는 암모늄, 나트륨, 칼륨, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(TRIS), 하이드록실아민, 에탄올아민, HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), PIPES(피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), EPPS(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진프로판설폰산), 및 글리신을 포함한다.

특정 실시형태에서, 상기 단백질 분해물 또는 펩티드는 질량 태그 또는 다른 표지 시약, 예를 들어 아민-, 설프하이드릴-, 카르복실- 및 카르보닐-반응성 탠덤 질량 태그(TMT) 시약(매사추세츠주 월섬에 소재한 Thermo Fisher Scientific으로부터 입수 가능함), iTRAQ 시약(매사추세츠주 프레이밍햄에 소재한 SCIEX로부터 입수 가능함), N,N-디메틸 류신(di-Leu) 시약, 조합 질량 태그, 형광 염료, 비오틴화 시약 등으로 유도체화될 수 있다. 질량 태그 또는 기타 표지 시약을 사용한 표지는, 예를 들어 과잉 미반응 표지 시약의 형태로, 상기 샘플에 오염물을 도입할 수 있다. 질량 태그(예를 들어 TMT) 또는 기타 표지 시약으로 표지된 단백질 분해물 또는 펩티드 샘플의 경우, 정제 전 샘플은 잔류 질량 태그뿐만 아니라 표지 및 켄칭 반응에 사용되는 성분(예를 들어 완충제 염)을 포함할 수 있다. 상기 오염물은 미반응 질량 태그 또는 표지일 수 있다. 대안적으로, 상기 오염물은 상기 표지 반응 중에 형성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 오염물은 상기 펩티드 또는 단백질 분해물을 표지하는 공정 동안 형성되는 상기 표지 또는 질량 태그의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 상기 질량 태그 유도체는 1가 양이온의 형태일 수 있다. 예를 들어, TMT와 같은 질량 태그의 1가 양이온성 유도체는 예를 들어, 미반응 TMT 시약의 NHS 에스테르, 질량 태그의 가수분해에 의해 형성된 TMT 시약의 산 유도체; 및 질량 태그와 아민 또는 아민-함유 화합물의 반응 시 형성된 TMT의 아미드 유도체를 포함할 수 있다.

상기 방법의 일 실시형태는, 단일 용액을 사용하여 정제 수지에 결합된 샘플을 세척하여 1가 양이온성 및 소수성 오염물을 제거함으로써, 펩티드 또는 단백질 분해물과 같은 생물학적 샘플을 정제하기 위해 사용된다. 처리된 생물학적 샘플은, 단백질의 가용화 특성 및 pH를 유지하기 위해 전형적으로 도입되는 소수성 성분, 예를 들어, 단백질 가용화를 돕는, 외부에서 도입된 세제, 및 완충제 염을 함유할 수 있다. 상기 샘플 단백질의 단백질 분해 후, 이들 오염물의 제거는 질량 분석 및 기타 분석 기술에 의한 최적의 분석을 달성하는 데 중요하다. 대표적인 방법 중 하나에서, 상기 샘플은 산성 조건(예를 들어 pH 약 1 내지 5) 하에 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질에 로딩된다. 전형적으로, 상기 양이온 교환 물질은 상기 샘플의 용이한 취급 및 처리를 촉진시키기 위해 컬럼 내에 함유된다. 산성 조건에서, 상기 샘플은 상기 양이온 교환 물질에 결합할 수 있다. 상기 공정의 다음 단계에서, 상기 양이온 교환 물질은 산성 용액(예를 들어 pH 약 1 내지 5)으로 세척된다. 특정 실시형태에서, pH는 약 2 내지 4이다. 상기 산성 용액은 물 및 하나 이상의 휘발성 성분, 예를 들어 휘발성 유기 용매 및 휘발성 염을 포함할 수 있다. 상기 휘발성 염은 휘발성 산(예를 들어, 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 또는 트리클로로아세트산) 및 휘발성 염기(예를 들어, 트리메틸아민, 암모니아, 트리에틸아민, 피페리딘, 또는 부틸아민)를 포함할 수 있다. 전형적으로, 상기 산성 용액은 20%(v/v) 이상의 휘발성 유기 용매(예를 들어, 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소-프로판올, 또는 아세톤)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 산성 용액은 약 20% 내지 40%; 40% 내지 60%; 60% 내지 80%; 또는 80%(v/v) 초과의 휘발성 유기 용매를 포함할 수 있다. 상기 산성 용액은 휘발성 염을 추가로 포함할 수 있다. 상기 용액 내의 휘발성 염의 양은, 원하는 수준으로 pH를 유지하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 상기 용액의 pH를 약 1 내지 5로 유지하기 위해, 휘발성 염의 농도는 약 0.01% 내지 약 1.0%(v/v) 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 산성 용액은 물, 60%(v/v) 이상의 휘발성 유기 용매(예를 들어, 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소-프로판올, 또는 아세톤) 및 약 0.1% 내지 1.0%(v/v)의 휘발성 염(예를 들어, 휘발성 산 성분, 예를 들어 포름산, 아세트산 및/또는 트리플루오로아세트산 및 휘발성 염기, 예를 들어 암모니아, 트리에틸아민 및/또는 피페리딘을 포함하는 염)을 포함하여, 상기 용액의 pH는 약 pH 2 내지 4로 유지된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 휘발성 산 또는 휘발성 염기가 사용될 수 있다. 상기 산성 용액으로 처리 시, 펩티드는 상기 양이온 교환 물질 상에 보유되고, 상기 1가 양이온성 및/또는 소수성 오염물은 상기 양이온 교환 물질로부터 제거될 수 있다. 보유된 펩티드는 알칼리성 또는 중성 용액을 사용하여 상기 양이온 교환 물질로부터 용출될 수 있다. 상기 알칼리성 또는 중성 용액은 휘발성 유기 용매와 물의 조합을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 용출 용액은 20%(v/v) 이상의 휘발성 유기 용매(예를 들어, 20% 내지 40%; 40% 내지 60%; 60% 내지 80%; 또는 80% 초과(v/v))를 포함한다. 전형적으로, 상기 알칼리성 또는 중성 용액은 5 이상의 pH를 갖는다. 특정 실시형태에서, 상기 용액은 7 초과, 8 초과; 9 초과; 10 초과; 또는 11 초과의 pH를 갖는다. 또한, 상기 알칼리성 또는 중성 용액은, 본원에 기술된 바와 같은, 휘발성 염기 및/또는 휘발성 염을 포함할 수 있다. 상기 용출 용액 내의 휘발성 염의 양은, 원하는 수준으로 pH를 유지하도록 조정될 수 있다. 상기 용출 용액의 pH를 5 이상으로 유지하기 위해, 휘발성 염의 농도는 약 0.01% 내지 약 1.0%(v/v) 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 용출 용액은 40%(v/v) 이상의 휘발성 유기 용매(예를 들어, 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소-프로판올, 또는 아세톤) 및 약 0.01% 내지 1.0%(v/v)의 휘발성 염(예를 들어, 휘발성 산 성분, 예를 들어 포름산, 아세트산 및/또는 트리플루오로아세트산 및 휘발성 염기, 예를 들어 암모니아, 트리에틸아민 및/또는 피페리딘을 포함하는 염)을 포함하여, 상기 용액의 pH는 약 pH 8 내지 12로 유지된다.

본원에 제공된 예시적인 방법 중 하나는 펩티드 또는 단백질 분해물과 같은 생물학적 샘플을 정제하기 위해 사용된다. 상기 방법은, 수지에 결합된 샘플을 하나 초과의 용액으로 세척하여 소수성 및 단일양이온성 오염물을 먼저 제거한 다음, 친수성 오염물을 제거하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 샘플은 고농도의 방부제, 예를 들어 탄수화물을 함유할 수 있으며, 이는, 충분히 제거되지 않는 경우, MS에 의한 상기 샘플의 다운스트림 분석에서 상당한 수준의 간섭을 일으킬 수 있다. 이러한 오염물을 효율적으로 제거하려면, 전형적으로, 20%(v/v) 이하의 휘발성 유기 용매를 포함하는 세척제 용액을 사용해야 한다. 따라서, 특정 샘플의 경우, 상기 샘플로부터 친수성, 소수성 및 이온성 오염물을 제거하기 위해 다수의 세척제 용액을 포함하는 것이 유리할 수 있다. 다수의 세척제 용액을 실행하는 대표적인 방법 중 하나에서, 상기 샘플은, 본원에 개시된 바와 같은, 상기 양이온 교환 물질 상에 로딩된 펩티드를 포함한다. 그런 다음, 상기 물질은 제1 산성 용액(pH 약 2 내지 4)으로 세척된다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 산성 용액은 20%(v/v) 이하의 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 산성 용액은 10% 내지 20%; 또는 5% 내지 10%; 또는 1% 내지 5%; 또는 1%(v/v) 미만의 휘발성 유기 용매를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 산성 용액은 5%(v/v) 미만의 휘발성 유기 용매 및 약 0.01% 내지 0.5%(v/v)의 휘발성 산(예를 들어, 포름산, 아세트산, 트리플루오르아세트산, 또는 트리클로로아세트산)을 포함하여, 상기 용액의 pH가 약 pH 2 내지 4로 유지되도록 한다. 상기 제1 산성 용액으로 처리하면, 상기 양이온 교환 물질로부터 상기 친수성 오염물은 제거되고, 상기 펩티드는 상기 양이온 교환 물질 상에 보유된 상태로 남아 있게 된다. 그런 다음, 상기 양이온 교환 물질은 제2 산성 용액(예를 들어 pH 약 1 내지 5)으로 세척되어, 상기 양이온 교환 물질로부터 1가 양이온성 및/또는 소수성 오염물을 제거하는 반면, 상기 펩티드는 상기 양이온 교환 물질에 결합된 채로 유지되도록 한다. 상기 제2 산성 용액은 물 및 하나 이상의 휘발성 성분, 예를 들어 휘발성 유기 용매(예를 들어 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소-프로판올, 또는 아세톤) 및 휘발성 염(예를 들어 포름산과 같은 휘발성 산 및 트리메틸아민과 같은 휘발성 염기로부터 형성된 염)을 포함할 수 있다. 전형적으로, 상기 제2 산성 용액은 20%(v/v) 이상의 휘발성 유기 용매를 포함한다. 예를 들어, 상기 산성 용액은 약 20% 내지 40%; 40% 내지 60%; 60% 내지 80%; 또는 80%(v/v) 초과의 휘발성 유기 용매를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 산성 용액은 60%(v/v) 초과의 휘발성 유기 용매 및 약 0.01% 내지 1.0%(v/v)의 휘발성 염을 포함하여, 상기 용액의 pH가 약 pH 2 내지 4로 유지되도록 한다. 보유된 펩티드는, 본원에 개시된 바와 같은, 알칼리성 또는 중성 용액을 사용하여 상기 양이온 교환 물질로부터 용출될 수 있다.

본원에 개시된 제제 및 방법을 사용하여 생물학적 샘플로부터 순수한 펩티드를 단리하는 대표적인 방법을 도 1에 도시하였다. 도 1을 참조하면, 펩티드 정제 워크플로우(100)는, 당업자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 생물학적 샘플을 분해하여, 분해된 생물학적 물질(예를 들어, 세포, 조직, 핵산, 단백질, 폴리펩티드, 지질, 탄수화물 등) 및 하나 이상의 오염물, 예를 들어 염, 세제, 지질, 및 기타 작은 중성 분자를 함유하는 미정제 분해물 샘플(110)을 제공하는 단계를 포함한다. 상기 분해된 샘플(110)은 pH를 1 내지 4로 감소시키기에 충분한 순수한 또는 희석된 산 용액의 첨가에 의해 산성화된다. 그런 다음, 분해된 샘플(110)은 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질(115) 상으로 이동된다(단계 1). 상기 양이온 교환 물질은 출구 포트(117)가 장착된 정화 컬럼(116) 내에 포함될 수 있다. 상기 컬럼은 원심분리기 튜브(118) 내에 포함될 수 있다. 상기 정화 컬럼을 포함하는 원심분리기 튜브는 진공 하에 원심분리되어, 상기 샘플의 성분(120)(예를 들어 분해된 생물학적 물질)이 컬럼(116)에 포함된 수지(115)를 통해 흐르도록 허용한다. 양이온 교환 물질(115)에 대한 친화도가 거의 없거나 전혀 없는 성분(120)은 상기 양이온 교환 물질을 통과하여 흘러서, 포트(117)를 통해 배출되고, 원심분리기 튜브(118)에 수집된다. 제1 산성 용액(세척제 용액 A)이 상기 양이온 교환 물질에 첨가되고 진공 하에 원심분리되어, 상기 양이온 교환 물질을 통과하여 친수성 오염물(예를 들어 중성 및 음이온성 성분)(130)을 세척하는 반면, 양이온성 및 소수성 종(예를 들어 펩티드 및 /또는 분해된 단백질)은 양이온 교환 물질(115) 상에 보유시킨다(단계 2). 친수성 오염물(130)은 폐기된다. 제2 산성 용액(세척제 용액 B)이 상기 양이온 교환 물질에 적용되고, 상기 컬럼이 진공 하에 원심분리되어, 수지(115)로부터 소수성(예를 들어 중성, 음이온성 및 1가 양이온성) 및 친수성 1가 양이온성 오염물(140)을 제거한다(단계 3). 2가 양이온성 종은 상기 양이온 교환 물질 상에 보유되는 반면, 상기 1가 양이온성 및/또는 소수성 오염물(140)은 진공 하에 원심분리에 의해 상기 양이온 교환 물질로부터 제거된다. 폴리펩티드 또는 단백질의 효소 분해에 의해 생성된 펩티드는 적어도 2개의 양전하(즉, 2가 양이온)를 갖기 때문에, 상기 펩티드는 단계 3 후에 상기 양이온 교환 물질(115) 상에 보유된다. 그런 다음, 상기 펩티드는 알칼리성 또는 중성 용액을 사용하여 상기 양이온 교환 물질로부터 용출되어(단계 4), 정제된 펩티드 용액(150)을 제공한다. 정제된 펩티드 용액(150)은 선택적으로(예를 들어, 동결건조에 의해) 건조되어(단계 5), 추가 다운스트림 응용 분야에 사용하기에 충분히 순수한 건조 펩티드(160)를 제공할 수 있다.

상기 방법의 일 실시형태는, 하나 초과의 용액을 사용하여 정제 수지에 결합된 샘플을 세척하여 소수성 및 1가 양이온성 오염물 이전에 친수성 오염물을 제거함으로써, 펩티드 또는 단백질 분해물과 같은 생물학적 샘플을 정제하는 단계를 포함한다. 또 다른 방법에서, 펩티드를 함유하는 샘플은, 본원에 개시된 바와 같이, 상기 양이온 교환 물질 상에 로딩된다. 그런 다음, 상기 양이온 교환 물질은 20%(v) 초과의 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 염을 포함하는 제1 산성 용액으로 세척되어, 상기 펩티드-함유 화합물은 상기 양이온 교환 물질 상에 보유되도록 하고 상기 1가 양이온성 및/또는 소수성 오염물은 상기 양이온 교환 물질로부터 제거되도록 한다.

상기 제1 산성 용액은 물 및 하나 이상의 휘발성 성분, 예를 들어 휘발성 유기 용매 및 휘발성 염을 포함할 수 있다. 전형적으로, 상기 제1 산성 용액은 20%(v/v) 이상의 휘발성 유기 용매를 포함한다. 예를 들어, 상기 산성 용액은 약 20% 내지 40%; 40% 내지 60%; 60% 내지 80%; 또는 80%(v/v) 초과의 휘발성 유기 용매를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 산성 용액은 60%(v/v) 초과의 휘발성 유기 용매 및 약 0.01% 내지 1.0%(v/v)의 휘발성 염을 포함하여, 상기 용액의 pH가 약 pH 2 내지 4로 유지되도록 한다. 다음으로, 제2 산성 용액을 사용하여 상기 양이온 교환 물질을 세척한다. 특정 실시형태에서, 상기 제2 산성 용액은 20%(v/v) 이하의 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 산을 포함한다. 상기 제2 산성 용액으로 처리하면, 상기 친수성 오염물은 제거되는 반면, 상기 펩티드는 상기 양이온 교환 물질 상에 잔류하게 된다. 일부 실시형태에서, 상기 제2 산성 용액은 20%(v/v) 이하의 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 산성 용액은 10% 내지 20%; 또는 5% 내지 10%; 또는 1% 내지 5%; 또는 1%(v/v) 미만의 휘발성 유기 용매를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 제2 용액은 5%(v/v) 미만의 휘발성 유기 용매 및 약 0.01% 내지 0.5%(v/v)의 휘발성 산을 포함하여, 상기 용액의 pH가 약 pH 2 내지 4로 유지되도록 한다. 보유된 펩티드는, 본원에 개시된 바와 같은, 알칼리성 또는 중성 용액을 사용하여 상기 양이온 교환 물질로부터 용출될 수 있다.

다른 양태에서, 본원에 제공된 방법은 상기 단백질 분해물 또는 펩티드를 표지 시약(예를 들어, 질량 태그)으로 표지하는 단계를 추가로 포함한다. 단백질, 단백질 분해물 및 펩티드를 질량 태그로 표지하는 것을 용이하게 하기 위한 성분(예를 들어 완충 염, 켄칭 시약 및 잔류 표지 시약)의 첨가는, 상기 생물학적 샘플로 추가 오염물을 도입할 수 있고, 이는 LC-MS 데이터의 품질을 저하시키고/거나 크로마토그래피 컬럼 및 펌프를 손상시킬 수 있다. 유리하게는, 본원에 제공된 제제 및 방법은 표지 공정 동안 도입된 오염물을 제거하여, 이러한 오염물을 실질적으로 포함하지 않는 질량 태그 또는 기타 표지 시약으로 표지되며 LC-MS 시스템을 사용하는 분석에 적합한 펩티드를 제공할 수 있다. 본원에 제공된 방법은 상기 샘플로부터 과잉 TMT 시약을 제거할 수 있으므로, MS 기반 분석에서 스펙트럼 간섭을 크게 감소시키고, 샘플 펩티드 수율의 정량적 비색 분석 측정에서 간섭을 감소시키고(TMT 시약이 이 유형의 분석을 방해하기 때문임), LC-MS 기기 성분 상에서의 이들 물질의 물리적 침착 및 축적을 감소시킬 수 있으며, 이는 궁극적으로, 기기 시스템의 높은 감도를 연장하고 펩티드 및 단백질 식별 수를 개선한다.

질량 태그는 예를 들어, Thermo Fisher Scientific(매사추세츠주 월섬 소재)로부터 상업적으로 입수 가능한 TMT 및 TMTPRO 표지 시약과 같은 탠덤 질량 태그 시약을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 단백질 분해물은 펩티드 정화 전에 상기 질량 태그로 표지된다. 다른 실시형태에서, 펩티드는 펩티드 정화 후에 TMT 시약으로 표지될 수 있다.

따라서, 상기 단백질 분해물 또는 정제된 펩티드를 TMT 시약으로 표지하는 단계를 추가로 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 단백질 분해물을 TMT 시약으로 표지하는 대표적인 방법은, 약염기성(예를 들어 pH 7.5 내지 9) 완충된(예를 들어 100 mM TEAB 또는 HEPES) 용액에 용해된 단백질 분해물을 유기 용매(예를 들어 아세토니트릴)에 용해된 TMT 시약과 조합하는 단계, 및 혼합물을 실온에서 항온처리하는 단계; 및 이어서, 1차 아민(예를 들어 하이드록실아민)을 함유하는 용액을 사용하여 표지 반응을 켄칭하는 단계를 포함한다.

정제된 펩티드를 TMT 시약으로 표지하는 대표적인 방법은, 건조 펩티드 샘플을 약염기성(예를 들어 pH 7.5 내지 9) 완충된(예를 들어 100 mM TEAB 또는 HEPES) 용액에 용해시키는 단계를 포함한다. 그런 다음, 용해된 펩티드 샘플은 아세토니트릴에 용해된 TMT 시약과 조합되고 실온에서 항온처리된다. 표지 반응은 하이드록실아민을 함유하는 용액으로 켄칭된다. 켄칭되고 나면, 표지된 샘플은 TFA(pH < 3)로 산성화되고 탈염된다.

본원에 제공된 방법은 고체상 추출 수지를 실행한다. 상기 추출 수지는 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 다양한 양이온 교환 수지가, 개시된 방법의 실시에 사용될 수 있다. 적합한 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질의 대표적인 예는 설폰화 디비닐 벤젠 폴리스티렌, 설폰화 폴리디비닐 벤젠 수지, 설폰화 폴리디비닐 벤젠/폴리스티렌 수지, 및 설폰화 폴리디비닐 벤젠/폴리스티렌 수지를 포함한다. 상업적으로 입수 가능한 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질의 대표적인 예는, 각각 Waters Corporation(매사추세츠주 밀포드 소재) 및 Thermo Fisher Scientific(매사추세츠주 베드포드 소재)로부터 입수 가능한 Oasis MCX 및 POROS XS 강한 양이온 교환 수지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 추출 수지는 양이온 교환 물질의 조합을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 정제 수지는 양이온 교환 물질의 물리적 배합물이다. 특정 실시형태에서, 상기 추출 수지는 예를 들어, 디비닐 벤젠 또는 스티렌과 같은 단량체 및 피롤리돈 단량체의 조합으로부터 형성된 공중합체이거나 또는 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 양이온 교환 물질은 피롤리돈과 설폰화 단량체, 예를 들어 디비닐 벤젠 또는 설폰화 폴리디비닐벤젠의 공중합체이다. 특정 실시형태에서, 강한 양이온 교환 특성을 갖거나 갖지 않는 다른 유형의 소수성 및/또는 친수성 수지(예를 들어 C18 수지, 비-설폰화 폴리디비닐 벤젠/폴리스티렌 수지, 실리카, 아가로스, 세파로스 등)가(예를 들어, 물리적 배합물로서) 본원에 개시된 바와 같은, 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질과 조합될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 추출 수지는 강한 양이온 교환 물질(예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은, 설폰화 단량체) 및 친수성 및/또는 소수성 수지의 조합이다. 특정 실시형태에서, 상기 친수성 및/또는 소수성 수지의 결합 방식은 상기 강한 양이온 교환 물질과 동일한 결합 방식을 갖는다.

고체상 추출(SPE: solid-phase extraction) 수지는 자성 입자(예를 들어 비드) 형태일 수 있다. 예를 들어, 상기 SPE 수지는 자성(magnetic) 물질을 추가로 포함하는 중합체성 물질로 구성될 수 있다. 자성 중합체 입자에 결합된 피분석물을 함유하는 샘플에 자기장을 가하면, 원심분리 또는 여과를 사용하지 않으면서 상기 피분석물을 단리할 수 있다. 본원에서 "자성"은 중합체성 입자가 초상자성(superparamagnetic) 결정을 함유함을 의미한다. 따라서, 상기 자성 중합체 입자는 자기적으로 변위될 수 있지만 영구적으로 자기화할 수는 없다. 자성 중합체 입자를 제조하는 많은 공정이 공지되어 있으며, 그 중 다수는 사전-형성된 자성 산화철, 예를 들어, 자철석으로부터 마그헤마이트- 또는 자철석-함유 중합체 입자를 제조하는 단계를 포함한다. 자성 중합체 입자는 본원에 개시된 펩티드 정제 프로토콜에서 실행될 수 있으며, 광범위한 자동화 플랫폼 상에서 쉽게 자동화될 수 있다.

본원에 제공된 세척제 용액은 하나 이상의 휘발성 성분, 예를 들어 유기 용매, 염기, 및 염을 사용한다. 휘발성 성분은 상기 샘플에 추가 오염물을 도입하지 않으면서 진공 하에 쉽게 증발될 수 있기 때문에, 특히 유용하다. 휘발성 성분은 또한 전기분무 이온화 기반 질량 분석과 양립 가능하기 때문에 유용하다. 개시된 방법에 사용될 수 있는 휘발성 유기 용매의 대표적인 예는 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소-프로판올, 및 아세톤을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에서, 휘발성 유기 용매의 조합이, 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 개시된 방법에 사용될 수 있는 휘발성 염의 대표적인 예는 휘발성 산 및/또는 휘발성 염기를 포함할 수 있다. 적합한 휘발성 염기는 예를 들어, 트리메틸아민(TEA), 암모니아, 피페리딘, 및 부틸아민을 포함한다. 적합한 휘발성 산은 예를 들어 포름산, 아세트산, 트리플루오르아세트산, 및 트리클로로아세트산을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 휘발성 염은 휘발성 염기 및 휘발성 산, 예를 들어 암모늄 아세테이트, 암모늄 포르메이트, 암모늄 트리플루오로아세테이트, 트리에틸암모늄 포르메이트, 트리에틸암모늄 아세테이트, 트리에틸암모늄 트리플루오로아세테이트, 또는 중탄산 암모늄을 포함한다.

펩티드를 포함하는 생물학적 샘플을 정제하기 위한 키트가 본원에 추가로 제공된다. 상기 키트는 세포 또는 조직과 같은 생물학적 샘플로부터 유래된 펩티드를 단리하는 데 사용될 수 있다. 상기 펩티드는 단백질 또는 폴리펩티드의 분해에 의해 생성될 수 있다.

일 양태에서, 단백질체 MS 분석 및 기타 유형의 분석을 위한 세포(예를 들어 배양된 포유동물 세포), 생물학적 유체(예를 들어 혈장 또는 혈청), 및 조직의 효율적이고 재현 가능한 처리를 수행하기 위한 키트가 제공된다. 키트는 사전-형성된 완충제, MS 등급 효소 믹스, 펩티드 정화 (플레이트 및 컬럼), 및 LC-MS 분석과 양립 가능한 펩티드 샘플을 생성하기 위한 최적화된 시간-효율적인 프로토콜을 포함할 수 있다. 정제된 펩티드 샘플은 본원에 제공된 키트 및 방법을 사용하여 몇 시간 내에(예를 들어, 4시간 미만 내에) 제조될 수 있으며, 이로써 기존 키트 및 방법과 관련된 표준 처리 시간을 상당히 감소시킬 수 있다. 약 1 μg 내지 약 10 mg 또는 그 초과의 단백질 샘플이, 개시된 방법 및 키트를 사용하여 처리되어, 정제된 펩티드 샘플을 높은 수율로 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 키트를 사용하여 약 0.5 mg 내지 약 2 mg 범위의 단백질 샘플을 처리할 수 있다.

본원에 제공된 키트는 사전-형성된 완충제, MS 등급 효소(예를 들어 뉴클레아제, 시스테인 변형을 위한 환원/알킬화 용액, 및 단백질 분해를 위한 트립신/Lys-C 프로테아제 믹스), 및 MS-양립 가능한 펩티드를 생성하기 위한 프로토콜을 포함될 수 있다. 또한, 상기 키트는 직접 LC-MS 분석 또는 추가 샘플 처리, 예를 들어 동중 원소 태그(isobaric tag)(예를 들어 TMT™ 시약) 표지, 포스포펩티드 농축 또는 분별(예를 들어 높은 pH 역상 분별)을 위한 세제-불포함 펩티드 샘플을 제조하기 위한 펩티드 정화 플레이트 또는 바이알 및 용액을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 키트는, 본원에 기술된 바와 같은, 하나 이상의 세척제 용액, 및 하나 이상의 추가 성분, 예를 들어 세포 용해 용액, 범용 뉴클레아제, 환원 용액, 알킬화 용액, 효소 재구성 용액, 트립신/Lys-C 프로테아제 믹스, 효소, 분해 중지 용액, 및 용출 용액을 포함할 수 있다.

생물학적 유래의 펩티드를 정제하기 위한 키트의 대표적인 예는 하기를 포함한다: (a) 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질; (b) 휘발성 염, 물 및 20%(v/v) 초과의 휘발성 유기 용매를 포함하는 산성 용액; (c) 휘발성 염기, 물 및 휘발성 유기 용매를 포함하는 중성 또는 알칼리성 용액; 및 (d) 상기 키트를 사용하여 상기 생물학적 샘플을 정제하기 위한 지침.

생물학적 샘플로부터 유래하는 펩티드를 정제하기 위한 키트의 다른 예는 하기를 포함한다: (a) 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질; (b) 20%(v/v) 초과의 휘발성 유기 용매, 휘발성 염 및 물을 포함하는 산성 용액, (c) 20%(v/v) 이하의 휘발성 유기 용매, 휘발성 염, 및 물을 포함하는 산성 용액; (d) 휘발성 염기, 물, 및 휘발성 유기 용매를 포함하는 중성 또는 알칼리성 용액; 및 (e) 상기 키트를 사용하여 상기 생물학적 샘플을 정제하기 위한 지침.

이하의 실시예는 본 발명의 특정 실시형태들을 예시하기 위해 포함된다. 이하의 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실시에서 잘 기능하는 것으로 본 발명자(들)에 의해 발견된 기술을 나타내며, 따라서 이의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것이 당업자에게 이해될 것이다. 그러나, 당업자는, 본 개시내용을 고려하여, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서, 개시된 특정 실시형태들에서 많은 변형이 이루어질 수 있으며 여전히 동일한 또는 유사한 결과를 얻을 수 있다는 점을 이해할 것이다.

실시예

본원에 제공된 실시예는 달리 명시되지 않는 한, 이하의 물질 및 일반적인 방법을 사용한다. 추가 물질은 하기의 Thermo Fisher Scientific(일리노이주 록퍼드 소재) 또는 명시된 경우 상업적 출처로부터 입수하였다.

실시예 1

TMT-표지된 펩티드의 정제

하기 프로토콜은 TMT 시약으로 표지된 펩티드를 정제하는 방법을 기술한다. 펩티드는 생물학적 샘플(예를 들어, 배양된 세포, 조직, 정제된 단백질, 혈청, 또는 혈장)의 단백질 분해 분해물로부터 유래될 수 있고, 진공 원심분리 후에 건조 펩티드가 수득될 때까지 실시예 3에 기술된 바와 같이 처리될 수 있다. 대안적으로, C18 또는 다른 역상 고체상 추출 정화 물질을 사용하여, 진공 원심분리 전에 샘플을 탈염할 수 있다. 건조 펩티드를 적합한 완충제(예를 들어 100 mM TEAB pH 8.5 또는 100 mM HEPES pH 8.0)에 용해시킨다. TMT 시약으로 표지된 다양한 샘플로부터의 펩티드. 100 μg의 펩티드 샘플의 경우, 40 μL의 아세토니트릴 중의 0.4 내지 0.8 mg의 TMT 시약을 사용하여 실온에서 1시간 동안 샘플을 표지한다. 8 μL의 5% 하이드록실아민을 추가함으로써 반응을 중지시키고, 5분 동안 항온처리한다. 하나의 샘플로 조합하기 전 또는 후에, 1 내지 10% 포름산을 사용하여, TMT-표지된 펩티드 샘플을 pH 2 내지 4로 산성화시킨다. 이어서, 50 내지 100 mg의, 본원에 개시된 바와 같은, 소수성의, 중합체성 양이온 교환 물질을 함유하는 정화 컬럼 상에, 조합된 샘플을 로딩한다. 로딩되고 나면, 1,000 rpm에서 10분 동안 컬럼을 원심분리한다. 3 mL의, 본원에 기술된 바와 같은, 산성 세척 완충제를 첨가하고, 2분 동안 2,000 rpm에서 컬럼을 원심분리하여 친수성 오염물(예를 들어, 중성 및 음이온성 성분)을 제거한다. 3 mL의, 본원에 기술된 바와 같은, 제2 산성 세척 완충제를 첨가하고 2분 동안 2,000 rpm에서 컬럼을 원심분리한다. 3 mL의 제2 산성 세척 완충제를 다시 첨가하고 2,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하여 소수성(예를 들어 중성, 음이온성, 및 1가 양이온성) 및 친수성 1가 양이온성 오염물을 제거한다. 3 mL의, 본원에 기술된 바와 같은, 용출 용액을 컬럼에 첨가하고 2분 동안 2,000 rpm에서 원심분리하여 깨끗한 펩티드 샘플을 수집한다. 진공 원심분리기를 사용하여 펩티드 샘플을 건조시킨다. LC-MS 분석을 위해 물 중의 100 내지 500 μL의 0.1% 포름산에 샘플을 재현탁할 수 있다. 선택적으로, Pierce™ 정량 비색 펩티드 분석과 같은 정량적 펩티드 분석을 사용하여 펩티드 수율 및 농도를 평가할 수 있다. LC-MS 분석을 위해, 수용액 중의 0.1% 포름산으로 1 내지 10 μg의 펩티드를 0.1 내지 1 μg/uL로 조정한다. 최고 속도 데이터 종속 수집 방법(top speed data dependent acquisition method)을 사용하는 Thermo Scientific™ Fusion™ Trbrid™ 질량 분석기 상에서 300 nL/분의 유속으로, 85분에 걸쳐 3% 내지 28%, 30분에 걸쳐 28% 내지 45%의 아세토니트릴 구배를 갖는 50 cm C18 Thermo Scientific EASY-Spray™ 컬럼을 사용하는 Thermo Scientific™ Dionex™ Ultimate™ 3000 Nano LC 시스템을 사용하여 3중 단백질 분해물 샘플(주입 당 1 μg)을 분리하였다. 4e5의 목표 값 및 50 ms 최대 주입 시간과 함께 120K의 분해능을 사용하여 MS 스펙트럼을 획득하였다. 1e5의 목표 값 및 50 ms 최대 주입 시간 CID NCE 35를 사용하여 MS/MS 스펙트럼을 생성하였다. 1e5의 목표 값 및 105 ms 최대 주입 시간과 함께 50K의 분해능에서 HCD NCE 60을 사용하여 MS/MS/MS 스펙트럼을 생성하였다. 고정된 카르바미도메틸 (C), 동적 산화 (M), TMT6plex 또는 TMTpro(K, N-말단) 및 탈아미드화 (N, Q) 변형을 사용하여 Thermo Scientific™ Proteome Discoverer™ 2.3 소프트웨어에서 SEQUEST® HT 검색 엔진을 사용하여 LC-MS 데이터를 분석하였다. Uniprot 인간 단백질 데이터베이스에 대비해 데이터를 검색하였고, 1% 단백질 FDR 임계값을 사용하여 결과를 필터링하였다(도 2a 내지 도 2c 및 도 3a 내지 도 3b 참조). 표준 완충제(FA 단독)와 비교하여, 휘발성 염(TEA 및 FA)을 함유하는 개선된 산성 세척 완충제를 사용한 것은, 초기 MS 크로마토그램으로부터 켄칭 및 가수분해된 과잉 TMT 시약을 효과적으로 제거하였다. 또한, 과잉 TMT 시약의 제거는 비색 펩티드 분석을 사용하여 측정된 배경 신호의 감소에 의해 또한 확인되었다. LC-MS 분석을 위한 정확한 펩티드 측정을 위해서는, 과잉 TMT 시약과 관련된 배경 신호의 제거가 필요하다.

실시예 2

생물학적 샘플로부터의 TMT 시약-표지된 단백질 분해물의 정제

하기 프로토콜은 생물학적 샘플(예를 들어 배양된 세포, 조직, 정제된 단백질, 혈청, 또는 혈장)로부터 펩티드를 단리하는 방법을 기술한다. 단백질은 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 생물학적 샘플로부터 추출, 환원, 및 알킬화된다. 그런 다음, 환원 및 알킬화된 단백질은 적절한 완충제(예를 들어 100 mM TEAB pH 8.5 또는 100 mM HEPES pH 8.0) 중의 트립신과 Lys-C 프로테아제의 혼합물을 사용하여 분해된다. 단백질 분해물은 TMT 시약으로 표지된 다양한 샘플로부터 유래한다. 10 μg의 펩티드 샘플의 경우, 20 μL의 아세토니트릴 중의 0.04 내지 0.08 mg의 TMT 시약을 사용하여 실온에서 15분 내지 1시간 동안 샘플을 표지한다. 1 내지 4 μL의 5% 하이드록실아민을 첨가함으로써 반응을 중지시키고, 5분 동안 항온처리한다. 하나의 샘플로 조합하기 전 또는 후에, 1 내지 10% 포름산을 사용하여, TMT-표지된 펩티드 샘플을 pH 2 내지 4로 산성화시킨다. 하기 방법에 따라, TMT-표지된 펩티드 샘플을 정제한다. 본원에 개시된 바와 같은, 소수성의, 중합체성 양이온 교환 물질을 함유하는 건조 펩티드 정화 컬럼으로, 조합된 샘플을 이동한다. 로딩되고 나면, 1,000 rpm에서 10분 동안 컬럼을 원심분리한다. 300 μL의, 본원에 기술된 바와 같은, 산성 세척 완충제를 첨가하고, 2분 동안 2,000 rpm에서 컬럼을 원심분리하여 친수성 오염물(예를 들어, 중성 및 음이온성 성분)을 제거한다. 300 μL의, 본원에 기술된 바와 같은, 제2 산성 세척 완충제를 첨가하고 2분 동안 2,000 rpm에서 컬럼을 원심분리한다. 300 μL의 제2 산성 세척 완충제를 다시 첨가하고 2,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하여 소수성(예를 들어 중성, 음이온성 및 1가 양이온성) 및 친수성 1가 양이온성 오염물을 제거한다. 300 μL의, 본원에 기술된 바와 같은, 용출 용액을 컬럼에 첨가하고 2분 동안 2,000 rpm에서 원심분리하여 깨끗한 펩티드 샘플을 수집한다. 진공 원심분리기를 사용하여 펩티드 샘플을 건조시킨다. LC-MS 분석을 위해 물 중의 100 μL의 0.1% 포름산에 샘플을 재현탁할 수 있다. 선택적으로, Pierce™ 정량 비색 펩티드 분석과 같은 정량적 펩티드 분석을 사용하여 펩티드 수율 및 농도를 평가할 수 있다. LC-MS 분석을 위해, 수용액 중의 0.1% 포름산으로 1 내지 10 μg의 펩티드를 0.1 내지 1 μg/uL로 조정한다. 최고 속도 데이터 종속 수집 방법(top speed data dependent acquisition method)을 사용하는 Thermo Scientific™ Fusion™ Tribrid™ 질량 분석기 상에서 300 nL/분의 유속으로, 85분에 걸쳐 3% 내지 28%, 30분에 걸쳐 28% 내지 45%의 아세토니트릴 구배를 갖는 50 cm C18 Thermo Scientific EASY-Spray™ 컬럼을 사용하는 Thermo Scientific™ Dionex™ Ultimate™ 3000 Nano LC 시스템을 사용하여 3중 단백질 분해물 샘플(주입 당 1 μg)을 분리하였다. 4e5의 목표 값 및 50 ms 최대 주입 시간과 함께 120K의 분해능을 사용하여 MS 스펙트럼을 획득하였다. 1e5의 목표 값 및 50 ms 최대 주입 시간 CID NCE 35를 사용하여 MS/MS 스펙트럼을 생성하였다. 1e5의 목표 값 및 105 ms 최대 주입 시간과 함께 50K의 분해능에서 HCD NCE 60을 사용하여 MS/MS/MS 스펙트럼을 생성하였다. 고정된 카르바미도메틸 (C), 동적 산화 (M), TMT6plex 또는 TMTpro (K, N-말단) 및 탈아미드화 (N, Q) 변형을 사용하여 Thermo Scientific™ Proteome Discoverer™ 2.3 소프트웨어에서 SEQUEST® HT 검색 엔진을 사용하여 LC-MS 데이터를 분석하였다. Uniprot 인간 단백질 데이터베이스에 대비해 데이터를 검색하였고, 1% 단백질 FDR 임계값을 사용하여 결과를 필터링하였다. 도 4a 내지 도 4d 참조. 표준 세척 완충제와 비교하여, 개선된 세척 완충제를 사용하여 과잉 TMT 시약 및 기타 오염물을 제거한 것은, MS/MS 스캔의 총 수는 감소시켰지만 LC-MS에 의해 식별된 펩티드 스펙트럼 매치(PSM), 고유한 펩티드 및 단백질 군의 총 수는 증가시켰다.

실시예 3

생물학적 샘플로부터의 펩티드의 정제

하기 프로토콜은 생물학적 샘플(예를 들어 배양된 세포, 조직, 정제된 단백질, 혈청, 또는 혈장)의 단백질 분해 분해물로부터 펩티드를 정제하는 방법을 기술한다. 단백질은 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 생물학적 샘플로부터 추출, 환원, 및 알킬화된다. 이어서, 환원 및 알킬화된 단백질은 트립신과 Lys-C 프로테아제의 혼합물을 사용하여 분해된다. pH 범위가 2 내지 4가 될 때까지 1 내지 10% 포름산을 첨가함으로써, 단백질의 분해를 중지시킨다. 5 내지 10 mg의, 본원에 개시된 바와 같은, 소수성의, 중합체성 양이온 교환 물질을 함유하는 건조 펩티드 정화 컬럼으로 단백질 분해물 샘플을 이동한다. 로딩되고 나면, 1,000 rpm에서 10분 동안 컬럼을 원심분리한다. 300 μL의, 본원에 기술된 바와 같은, 산성 세척 완충제를 첨가하고, 2분 동안 2,000 rpm에서 컬럼을 원심분리하여 친수성 오염물(예를 들어, 중성 및 음이온성 성분)을 제거한다. 300 μL의, 본원에 기술된 바와 같은, 제2 산성 세척 완충제를 첨가하고 2분 동안 2,000 rpm에서 컬럼을 원심분리한다. 300 μL의 제2 산성 세척 완충제를 다시 첨가하고 2,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하여 소수성(예를 들어 중성, 음이온성 및 1가 양이온성) 및 친수성 1가 양이온성 오염물을 제거한다. 300 μL의, 본원에 기술된 바와 같은, 용출 용액을 컬럼에 첨가하고 2분 동안 2,000 rpm에서 원심분리하여 깨끗한 펩티드 샘플을 수집한다. 진공 원심분리기를 사용하여 펩티드 샘플을 건조시킨다. LC-MS 분석을 위해 물 중의 100 μL의 0.1% 포름산에 샘플을 재현탁할 수 있다. 선택적으로, Pierce™ 정량 비색 펩티드 분석과 같은 정량적 펩티드 분석을 사용하여 펩티드 수율 및 농도를 평가할 수 있다. LC-MS 분석을 위해, 수용액 중의 0.1% 포름산으로 1 내지 10 μg의 펩티드를 0.1 내지 1 μg/uL로 조정한다. 최고 20 데이터 종속 수집 방법을 사용하는 Thermo Scientific™ Q Exactive™ Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ 질량 분석기 상에서 300 nL/분의 유속으로, 85분에 걸쳐 3% 내지 28%, 30분에 걸쳐 28% 내지 45%의 아세토니트릴 구배를 갖는 50 cm C18 Thermo Scientific EASY-Spray™ 컬럼을 사용하는 Thermo Scientific™ Dionex™ Ultimate™ 3000 Nano LC 시스템을 사용하여 3중 단백질 분해물 샘플(주입 당 1 μg)을 분리하였다. 3e6의 목표 값 및 100 ms 최대 주입 시간과 함께 70K의 분해능을 사용하여 MS 스펙트럼을 획득하였다. 1e5의 목표 값 및 54 ms 최대 주입 시간과 함께 17.5K의 분해능에서 HCD NCE 28을 사용하여 MS/MS 스펙트럼을 생성하였다. 고정된 카르바미도메틸 (C), 동적 산화 (M), 및 탈아미드화 (N, Q) 변형을 사용하여 Thermo Scientific™ Proteome Discoverer™ 2.3 소프트웨어에서 SEQUEST® HT 검색 엔진을 사용하여 LC-MS 데이터를 분석하였다. Uniprot 인간 단백질 데이터베이스에 대비해 데이터를 검색하였고, 1% 단백질 FDR 임계값을 사용하여 결과를 필터링하였다. 도 5a 및 도 5b는, 0.1% 포름산 및 70% ACN를 갖는 표준 세척제 용액(세척제 B) 및 개선된 세척제 용액(0.5% 포름산, 0.5% 트리메틸아민 및 70% ACN을 포함하는 세척제 B+)을 사용하여 제조된 10 μg 및 100 μg의 Hela 세포 용해물 샘플에 대한 펩티드 및 단백질 식별 수와 관련한 분석의 결과를 나타낸다. 도 5a 및 도 5b에 나타난 바와 같이, 표준 세척제 용액과 비교하여, 추가 오염물을 제거하는 개선된 세척제 용액을 사용한 경우, 더 많은 단백질 및 펩티드가 식별되었다.

본 발명의 바람직한 실시형태들이 본원에 제시되고 기술되어 있지만, 이러한 실시형태들이 오직 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 많은 변형, 변화 및 치환이 당해 분야의 숙련자에게 떠오를 것이다. 본원에 기술된 본 발명의 실시형태들에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 이용될 수 있음이 이해되어야 한다. 하기 조항들 및 청구범위가 본 발명의 범위를 정의하며 이들 조항 및 청구범위 및 이들의 균등물의 범위 내의 방법 및 구조가 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다. 실시형태들은 이하의 번호가 매겨진 조항들에 따를 수 있다:

1. 생물학적 샘플을 정제하는 방법으로서,

(a) 상기 생물학적 샘플을 산성 조건 하에 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질과 접촉시켜, 상기 샘플이 상기 양이온 교환 물질에 결합하도록 하는 단계로서, 상기 샘플은,

(i) 펩티드, 및

(ii) 1가 양이온성 오염물 및/또는 소수성 오염물을 포함하는, 단계;

(b) 상기 양이온 교환 물질을 20%(v/v) 초과의 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 염을 포함하는 산성 용액으로 세척하여, 상기 펩티드는 상기 양이온 교환 물질 상에 보유되도록 하고 상기 1가 양이온성 및/또는 소수성 오염물은 상기 양이온 교환 물질로부터 제거되도록 하는 단계; 및

(c) 알칼리성 또는 중성 용액을 사용하여 상기 양이온 교환 물질로부터, 보유된 펩티드를 용출시키는 단계로서, 상기 알칼리성 또는 중성 용액은 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 염기, 휘발성 염 및 이들의 조합으로부터 선택된 휘발성 화합물을 포함하는, 단계를 포함하는, 생물학적 샘플을 정제하는 방법.

2. 생물학적 샘플을 정제하는 방법으로서,

(a) 상기 생물학적 샘플을 산성 조건 하에 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질과 접촉시켜, 상기 샘플이 상기 양이온 교환 물질에 결합하도록 하는 단계로서, 상기 샘플은,

(i) 펩티드,

(ii) 1가 양이온성 오염물 및/또는 소수성 오염물, 및

(iii) 친수성 오염물을 포함하는, 단계;

(b) 상기 양이온 교환 물질을 20%(v/v) 초과의 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 염을 포함하는 제1 산성 용액으로 세척하여, 상기 펩티드는 상기 양이온 교환 물질 상에 보유되도록 하고 상기 1가 양이온성 및/또는 소수성 오염물은 상기 양이온 교환 물질로부터 제거되도록 하는 단계;

(c) 상기 양이온 교환 물질을 20%(v/v) 이하의 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 산을 포함하는 제2 산성 용액으로 세척하는 단계로서, 상기 펩티드는 상기 양이온 교환 물질 상에 보유되고 상기 친수성 오염물은 제거되는, 단계; 및

(d) 알칼리성 또는 중성 용액을 사용하여 상기 양이온 교환 물질로부터, 보유된 펩티드를 용출시키는 단계로서, 상기 알칼리성 또는 중성 용액은 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 염기, 휘발성 염 및 이들의 조합으로부터 선택된 휘발성 화합물을 포함하는, 단계를 포함하는, 생물학적 샘플을 정제하는 방법.

3. 생물학적 샘플을 정제하는 방법으로서,

(a) 상기 생물학적 샘플을 산성 조건 하에 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질과 접촉시켜, 상기 샘플이 상기 양이온 교환 물질에 결합하도록 하는 단계로서, 상기 생물학적 샘플은,

(i) 펩티드,

(ii) 1가 양이온성 오염물 및/또는 소수성 오염물, 및

(iii) 친수성 오염물을 포함하는, 단계;

(b) 상기 양이온 교환 물질을 20%(v/v) 이하의 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 산을 포함하는 제1 산성 용액으로 세척하여, 상기 펩티드는 상기 양이온 교환 물질 상에 보유되도록 하고 상기 친수성 오염물은 상기 양이온 교환 물질로부터 제거되도록 하는 단계;

(c) 상기 양이온 교환 물질을 20%(v/v) 초과의 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 염을 포함하는 제2 산성 용액으로 세척하는 단계로서, 상기 펩티드는 상기 양이온 교환 물질 상에 보유되고 상기 1가 양이온성 및/또는 소수성 오염물은 상기 양이온 교환 물질로부터 제거되는, 단계; 및

(d) 알칼리성 또는 중성 용액을 사용하여 상기 양이온 교환 물질로부터, 보유된 펩티드를 용출시키는 단계로서, 상기 알칼리성 또는 중성 용액은 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 염기, 휘발성 염 및 이들의 조합으로부터 선택된 휘발성 화합물을 포함하는, 단계를 포함하는, 생물학적 샘플을 정제하는 방법.

4. 조항 1 내지 조항 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 친수성 오염물이 중성 오염물, 음이온성 오염물, 또는 이들의 조합인, 방법.

5. 조항 1 내지 조항 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 염, 세제, 지질, 작은 중성 분자, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는, 방법.

6. 조항 1 내지 조항 5 중 어느 하나에 있어서, pH 1 내지 5에서 상기 샘플을 상기 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.

7. 조항 1 내지 조항 6 중 어느 하나에 있어서, pH 1 내지 5에서 상기 양이온 교환 물질을 세척하는 단계를 포함하는, 방법.

8. 조항 1 내지 조항 7 중 어느 하나에 있어서, pH 5 초과(예를 들어, 5 내지 11)에서 상기 양이온 교환 물질로부터 상기 샘플을 용출시키는 단계를 포함하는, 방법.

9. 조항 1 내지 조항 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 1가 양이온성 오염물이 암모늄, 나트륨, 칼륨, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(tris), 하이드록실아민, 에탄올아민, HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), PIPES(피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), EPPS(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진프로판설폰산), 글리신, 질량 태그, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.

10. 조항 1 내지 조항 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 1가 양이온성 오염물이 질량 태그 또는 이의 유도체이거나 또는 이를 포함하는, 방법.

11. 조항 1 내지 조항 10 중 어느 하나에 있어서, 소수성 오염물이 지질 또는 세제인, 방법.

12. 조항 1 내지 조항 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 친수성 오염물이 염, 핵산, 또는 탄수화물인, 방법.

13. 조항 1 내지 조항 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물학적 샘플을 상기 양이온 교환 물질과 접촉시키기 전에, 상기 생물학적 샘플을 단백질 분해 효소(예를 들어, 트립신 또는 Lys-C)로 처리하여 상기 펩티드를 생성하는, 방법.

14. 펩티드를 포함하는 생물학적 샘플을 정제하기 위한 키트로서,

(a) 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질;

(b) 휘발성 염, 물, 및 20%(v/v) 초과의 휘발성 유기 용매를 포함하는 산성 용액;

(c) 휘발성 염기, 물, 및 휘발성 유기 용매를 포함하는 중성 또는 알칼리성 용액; 및

(d) 상기 키트를 사용하여 상기 생물학적 샘플을 정제하기 위한 지침을 포함하는, 펩티드를 포함하는 생물학적 샘플을 정제하기 위한 키트.

15. 펩티드를 포함하는 생물학적 샘플을 정제하기 위한 키트로서,

(a) 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질;

(b) 20%(v/v) 초과의 휘발성 유기 용매, 휘발성 염, 및 물을 포함하는 산성 용액,

(c) 20%(v/v) 이하의 휘발성 유기 용매, 휘발성 염, 및 물을 포함하는 산성 용액;

(d) 휘발성 염기, 물, 및 휘발성 유기 용매를 포함하는 중성 또는 알칼리성 용액; 및

(e) 상기 키트를 사용하여 상기 생물학적 샘플을 정제하기 위한 지침을 포함하는, 펩티드를 포함하는 생물학적 샘플을 정제하기 위한 키트.

16. 선행하는 조항들 중 어느 하나에 있어서, 상기 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질이 설폰화 디비닐 벤젠 폴리스티렌, 설폰화 폴리디비닐 벤젠, 또는 설폰화 디비닐 벤젠/폴리스티렌/피롤리돈 수지인, 방법 또는 키트.

17. 선행하는 조항들 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드가 2 내지 50개의 아미노산 잔기를 포함하는, 방법 또는 키트.

18. 선행하는 조항들 중 어느 하나에 있어서, 상기 휘발성 염이 휘발성 산 및 휘발성 염기를 포함하는, 방법 또는 키트.

19. 선행하는 조항들 중 어느 하나에 있어서, 상기 휘발성 산이 포름산, 아세트산, 트리플루오르아세트산, 트리클로로아세트산으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법 또는 키트.

20. 선행하는 조항들 중 어느 하나에 있어서, 상기 휘발성 염기가 트리메틸아민, 암모니아, 트리에틸아민, 피페리딘, 및 부틸아민으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법 또는 키트.

21. 선행하는 조항들 중 어느 하나에 있어서, 상기 휘발성 유기 용매가 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소-프로판올, 아세톤, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법 또는 키트.

21. 선행하는 조항들 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플이 2개 이상의 펩티드를 포함하는, 방법 또는 키트.

22. 선행하는 조항들 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플이 분해된 단백질 또는 폴리펩티드인, 방법 또는 키트.

23. 선행하는 조항들 중 어느 하나에 있어서, 알칼리성 또는 중성 용액을 사용하여 상기 양이온 교환 물질로부터, 보유된 펩티드를 용출시키는 단계로서, 상기 알칼리성 또는 중성 용액은 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 염을 포함하는, 단계를 포함하는, 방법.

Claims (23)

1. 생물학적 샘플을 정제하는 방법으로서,
   (a) 상기 생물학적 샘플을 산성 조건 하에 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질과 접촉시켜, 상기 샘플이 상기 양이온 교환 물질에 결합하도록 하는 단계로서, 상기 샘플은,
   (i) 펩티드, 및
   (ii) 1가 양이온성 오염물 및/또는 소수성 오염물을 포함하는, 단계;
   (b) 상기 양이온 교환 물질을 20%(v/v) 초과의 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 염을 포함하는 산성 용액으로 세척하여, 상기 펩티드는 상기 양이온 교환 물질 상에 보유되도록 하고 상기 1가 양이온성 및/또는 소수성 오염물은 상기 양이온 교환 물질로부터 제거되도록 하는 단계; 및
   (c) 알칼리성 또는 중성 용액을 사용하여 상기 양이온 교환 물질로부터, 보유된 펩티드를 용출시키는 단계로서, 상기 알칼리성 또는 중성 용액은 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 염기, 휘발성 염 및 이들의 조합으로부터 선택된 휘발성 화합물을 포함하는, 단계를 포함하는, 생물학적 샘플을 정제하는 방법.
2. 생물학적 샘플을 정제하는 방법으로서,
   (a) 상기 생물학적 샘플을 산성 조건 하에 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질과 접촉시켜, 상기 샘플이 상기 양이온 교환 물질에 결합하도록 하는 단계로서, 상기 샘플은,
   (i) 펩티드,
   (ii) 1가 양이온성 오염물 및/또는 소수성 오염물, 및
   (iii) 친수성 오염물을 포함하는, 단계;
   (b) 상기 양이온 교환 물질을 20%(v/v) 초과의 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 염을 포함하는 제1 산성 용액으로 세척하여, 상기 펩티드는 상기 양이온 교환 물질 상에 보유되도록 하고 상기 1가 양이온성 및/또는 소수성 오염물은 상기 양이온 교환 물질로부터 제거되도록 하는 단계;
   (c) 상기 양이온 교환 물질을 20%(v/v) 이하의 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 산을 포함하는 제2 산성 용액으로 세척하는 단계로서, 상기 펩티드는 상기 양이온 교환 물질 상에 보유되고 상기 친수성 오염물은 제거되는, 단계; 및
   (d) 알칼리성 또는 중성 용액을 사용하여 상기 양이온 교환 물질로부터, 보유된 펩티드를 용출시키는 단계로서, 상기 알칼리성 또는 중성 용액은 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 염기, 휘발성 염 및 이들의 조합으로부터 선택된 휘발성 화합물을 포함하는, 단계를 포함하는, 생물학적 샘플을 정제하는 방법.
3. 생물학적 샘플을 정제하는 방법으로서,
   (a) 상기 생물학적 샘플을 산성 조건 하에 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질과 접촉시켜, 상기 샘플이 상기 양이온 교환 물질에 결합하도록 하는 단계로서, 상기 생물학적 샘플은,
   (i) 펩티드,
   (ii) 1가 양이온성 오염물 및/또는 소수성 오염물, 및
   (iii) 친수성 오염물을 포함하는, 단계;
   (b) 상기 양이온 교환 물질을 20%(v/v) 이하의 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 산을 포함하는 제1 산성 용액으로 세척하여, 상기 펩티드는 상기 양이온 교환 물질 상에 보유되도록 하고 상기 친수성 오염물은 상기 양이온 교환 물질로부터 제거되도록 하는 단계;
   (c) 상기 양이온 교환 물질을 20%(v/v) 초과의 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 염을 포함하는 제2 산성 용액으로 세척하는 단계로서, 상기 펩티드는 상기 양이온 교환 물질 상에 보유되고 상기 1가 양이온성 및/또는 소수성 오염물은 상기 양이온 교환 물질로부터 제거되는, 단계; 및
   (d) 알칼리성 또는 중성 용액을 사용하여 상기 양이온 교환 물질로부터, 보유된 펩티드를 용출시키는 단계로서, 상기 알칼리성 또는 중성 용액은 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 염기, 휘발성 염 및 이들의 조합으로부터 선택된 휘발성 화합물을 포함하는, 단계를 포함하는, 생물학적 샘플을 정제하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친수성 오염물이 중성 오염물, 음이온성 오염물, 또는 이들의 조합인, 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 염, 세제, 지질, 작은 중성 분자, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, pH 1 내지 5에서 상기 샘플을 상기 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, pH 1 내지 5에서 상기 양이온 교환 물질을 세척하는 단계를 포함하는, 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, pH 5 초과(예를 들어, 5 내지 11)에서 상기 양이온 교환 물질로부터 상기 샘플을 용출시키는 단계를 포함하는, 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1가 양이온성 오염물이 암모늄, 나트륨, 칼륨, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(tris), 하이드록실아민, 에탄올아민, HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), PIPES(피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), EPPS(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진프로판설폰산), 글리신, 질량 태그(mass tag), 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1가 양이온성 오염물이 질량 태그 또는 이의 유도체이거나 또는 이를 포함하는, 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 오염물이 지질 또는 세제인, 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친수성 오염물이 염, 핵산, 또는 탄수화물인, 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플을 상기 양이온 교환 물질과 접촉시키기 전에, 상기 생물학적 샘플을 단백질 분해 효소(예를 들어, 트립신 또는 Lys-C)로 처리하여 상기 펩티드를 생성하는, 방법.
14. 펩티드를 포함하는 생물학적 샘플을 정제하기 위한 키트로서,
    (a) 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질;
    (b) 휘발성 염, 물, 및 20%(v/v) 초과의 휘발성 유기 용매를 포함하는 산성 용액;
    (c) 휘발성 염기, 물, 및 휘발성 유기 용매를 포함하는 중성 또는 알칼리성 용액; 및
    (d) 상기 키트를 사용하여 상기 생물학적 샘플을 정제하기 위한 지침을 포함하는, 펩티드를 포함하는 생물학적 샘플을 정제하기 위한 키트.
15. 펩티드를 포함하는 생물학적 샘플을 정제하기 위한 키트로서,
    (a) 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질;
    (b) 20%(v/v) 초과의 휘발성 유기 용매, 휘발성 염, 및 물을 포함하는 산성 용액,
    (c) 20%(v/v) 이하의 휘발성 유기 용매, 휘발성 염, 및 물을 포함하는 산성 용액;
    (d) 휘발성 염기, 물, 및 휘발성 유기 용매를 포함하는 중성 또는 알칼리성 용액; 및
    (e) 상기 키트를 사용하여 상기 생물학적 샘플을 정제하기 위한 지침을 포함하는, 펩티드를 포함하는 생물학적 샘플을 정제하기 위한 키트.
16. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성의, 중합체-기반 양이온 교환 물질이 설폰화 디비닐 벤젠 폴리스티렌, 설폰화 폴리디비닐 벤젠, 또는 설폰화 디비닐 벤젠/폴리스티렌/피롤리돈 수지인, 방법 또는 키트.
17. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가 2 내지 50개의 아미노산 잔기를 포함하는, 방법 또는 키트.
18. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 휘발성 염이 휘발성 산 및 휘발성 염기를 포함하는, 방법 또는 키트.
19. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 휘발성 산이 포름산, 아세트산, 트리플루오르아세트산, 트리클로로아세트산으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법 또는 키트.
20. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 휘발성 염기가 트리메틸아민, 암모니아, 트리에틸아민, 피페리딘, 및 부틸아민으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법 또는 키트.
21. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 휘발성 유기 용매가 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소-프로판올, 아세톤, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법 또는 키트.
    [청구항 21]
    선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 2개 이상의 펩티드를 포함하는, 방법 또는 키트.
22. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 분해된 단백질 또는 폴리펩티드인, 방법 또는 키트.
23. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 알칼리성 또는 중성 용액을 사용하여 상기 양이온 교환 물질로부터, 보유된 펩티드를 용출시키는 단계로서, 상기 알칼리성 또는 중성 용액은 휘발성 유기 용매, 물, 및 휘발성 염을 포함하는, 단계를 포함하는, 방법.

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