CN111208245A - 一种基于胍基化标记的蛋白质n端肽段反向富集的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于胍基化标记的蛋白质N末端肽段反向富集的分析方法及应用，包括赖氨酸ε‑氨基及多肽N端氨基的胍基化标记、胍基化试剂的去除，胍基化赖氨酸C端肽键的胰蛋白酶酶切及非蛋白质N末端肽段的选择性去除。首先建立能够高效胍基化标记赖氨酸ε‑氨基及多肽N端氨基的标记条件及过量标记试剂的选择性去除，然后将优化好的标记条件用于蛋白质中的N端氨基和赖氨酸ε‑氨基胍基化标记，利用氨基活性材料与酶切产生肽段的N端氨基反应，从而实现蛋白质N端肽段反向富集。本发明的优点是高效的赖氨酸ε‑氨基及肽端N段氨基胍基化标记、高效的离子化率，提高了蛋白质N端肽段反向富集率及鉴定深度。

Description

一种基于胍基化标记的蛋白质N端肽段反向富集的方法
技术领域
本发明涉及一种基于胍基化标记的蛋白质N-端肽段反相分析方法，提高蛋白质N-端信息的鉴定灵敏度和鉴定深度。
背景技术
蛋白质N端在蛋白质合成过程中生成，并在合成后被广泛修饰，如N-末端启动子甲硫氨酸去除和N-末端乙酰化修饰，以及通过特异性水解转化为成熟有活性的蛋白质。特异性的蛋白水解处理产生新的蛋白质形态，这些新形态可能会显著地改变蛋白质的稳定性、活性及功能，如caspase-1或caspase-11活化后，可特异性切割GSDMD蛋白2个结构域之间的连接区域，释放的N端结构域可识别并结合细胞膜上的磷脂类分子，在细胞膜上打孔，导致细胞渗透压变化，细胞膜胀大裂解引发细胞焦亡(Nature 2015，526，660–665)。基于质谱的蛋白质组学是研究蛋白质N端理想方法，其基本策略是对蛋白质酶切产生肽段的分析，由于大量的非N端肽段的存在，大大干扰了蛋白质N端肽段的分析，通过降低非N端肽段的比例，提高蛋白质N端肽段的鉴定灵敏度，对研究蛋白质N端及N端的翻译共修饰所具有的生物功能具有重要的意义。
目前，反相富集策略是研究蛋白质N端肽段主要方法，通过在蛋白质水平对赖氨酸的ε-氨基及蛋白质的N端氨基进行二甲基化、乙酰化等化学标记，然后利用蛋白酶对蛋白质进行水解，水解产生的肽段含有N端氨基，利用能够与氨基反应的活性颗粒或带有标签的氨基活性试剂与水解产生的N端氨基反应，选择性去除水解得到的中间肽段，实现蛋白质N端的肽段的选择性富集(Methods Mol Biol 2017，1574，51-76；Nature Biotechnology2010,28,281-288)。由于蛋白质的赖氨酸ε-氨基被二甲基化、乙酰化等标记后，胰蛋白酶无法对赖氨酸进行酶切，将会产生严重的酶漏切率，使得酶切得到的肽段过长，利用质谱进行分析时，二级碎片信息复杂，不利于鉴定；同时蛋白质N端被二甲基化、乙酰化等标记后，不利于肽段的离子化，进一步干扰了蛋白质N端肽段的鉴定。
针对目前基于质谱技术的蛋白质N端肽段分析存在的胰蛋白酶漏切及离子化抑制的科学问题，通过实现蛋白质赖氨酸ε-氨基和N端的胍基化标记，显著提高标记N端肽段的离子化效率；并通过实验证实，胰蛋白酶能够高效酶切胍基化标记的赖氨酸，显著性降低胰蛋白酶的漏切率，提升肽段的解析能力，从而提高蛋白质N-端信息的鉴定灵敏度和鉴定深度。
发明内容
本发明发展了一种蛋白质N-端肽段反相分析方法，本发明的优点是高效的赖氨酸ε-氨基及肽端N段氨基胍基化标记、高效的离子化率、高效的酶切率及高效的氨基去除率，提高蛋白质N端肽段反向富集率及鉴定深度。
为了实现该目的，本发明的技术方案是：
1、蛋白质赖氨ε-氨基及蛋白质N段氨基胍基化标记
将蛋白进行变性、还原、烷基化后，加入终浓度为2mM-2M的1H-吡唑-1-甲脒，使用强氧化钠、三乙胺、二异丙基乙基氨等不含自由氨基的碱调节pH为9.5-12.5，于25-99℃振荡反应10min-24h，得溶液A；
2、通过蛋白质沉淀或者滤膜的方法去除过量的胍基化试剂
1)通过蛋白质沉淀的方法去除过量的胍基化试剂
加入丙酮至终体积为80％，放置在-20℃冰箱2-12h；或者加入100％的三氯乙酸至终体积为15％-25％，放置在4℃冰箱2-12h；或者加入氯仿-甲醇(1：4)至终体积为50％-80％，放置在4℃冰箱30min-12h。通过上述方法得到蛋白质沉淀，使用丙酮清洗三次。
2)使用滤膜的方法去除过量的胍基化试剂
使用甲酸调节溶液A的pH为7-8，将溶液A加入到含有5kDa或者10kDa或者30kDa滤膜的离心管上，15000rgf离心20min；加入8M尿素或者6M的盐酸胍200μl，15000rgf离心20min，重复该操作三次；最后加入200μl的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、三乙胺-碳酸缓冲液(TEAB)等不含有自由氨基的缓冲液，15000rgf离心20min。
3、胍基化赖氨酸C端肽键的胰蛋白酶酶切
将去除过量胍基化试剂的蛋白质溶解在4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、三乙胺-碳酸缓冲液(TEAB)等不含有自由氨基的缓冲液中，胰蛋白酶用量为蛋白质质量的1/5-1/500，调节pH至6.5-9.5，在20-50℃酶解2-48h，离心得到多肽溶液B。
4、非蛋白质N端肽段的选择性去除
使用氨基活性材料与胰蛋白酶酶切的肽段的N端自由氨基进行反应，调节pH为3-12，20-65度10min至24h。使用氨水、碳酸氢铵、乙醇胺、Tris-Cl等含有自由氨基的试剂中和材料上没有反应的活性基团，试剂使用浓度为1mM-1000mM，20-70度反应5min至4h。
根据氨基活性材料的性质，使用离心、亲和色谱、分子筛等方法将氨基活性材料与蛋白质N末端肽段分离，事项蛋白质N末端肽段的选择性富集。
本发明的有益效果为：
1、1H-吡唑-1-甲脒能够对蛋白质N端氨基和赖氨酸ε-氨基进行高效的胍基化标记。
2、蛋白质N端氨基和赖氨酸ε-氨基胍基化后，通过提高多肽的碱性从而提高其离子化效率；此外肽段两端同时含有胍基，使得多肽电荷分布更加均衡，有利于产生b离子和y离子，提高二级离子碎片信息，增加肽段鉴定的可靠性。
3、胰蛋白酶高效酶切胍基化标记的赖氨酸，使得蛋白质N端肽段具有合适的长度，此外，与之前发展的方法相比，蛋白质N端肽段中间位置不含有赖氨酸碱性氨基酸，提高了肽段二级谱图的质量，这些都有利于蛋白质N端肽段的质谱鉴定；
4、氨基活性材料与非蛋白质N末端肽段的自由氨基具有很高的反应活性，可以实现蛋白质N末端肽段的高效去除，从而提高了蛋白质N末端的纯度，有利于蛋白质N末端深度覆盖分析。
附图说明
图1、蛋白质N端肽段反向富集的分析方法的流程。
具体实施方式
实施例1
如图1所示，蛋白质进行还原烷基化处理后，使用1H-吡唑-1-甲脒对蛋白质的N端氨基和赖氨酸ε-氨基进行胍基化标记，使用胰蛋白酶对胍基化标记的蛋白质进行酶切得到肽段，使用HPG-ALD或者十六圈对酶切的肽段进行标记，利用滤膜或者C18反向色谱将非蛋白质N端肽段去除，从而实现蛋白质N端肽段的反相富集。
以酵母为样品，首先使用液氮研磨法将酵母磨碎，使用6M盐酸胍的进行蛋白质的提取。取200μl浓度为1μg/μl的酵母蛋白质进行N端肽段的富集。加入2μl浓度为1M的二硫苏糖醇，56℃变性还原30min后，加入6μl浓度为1M碘乙酰胺室温避光反应30min，再向反应体系中加6μl浓度为1M二硫苏糖醇，室温孵育30min终止过量的碘乙酰胺，向溶液中加入终浓度为500mM的1H-吡唑-1-甲脒和500mM的三乙胺，95℃标记15min。使用甲酸将反应体系的pH至调节至7-8，使用10kDa的滤膜除掉没有反应的胍基化试剂，将蛋白质溶解再200μl的50mM的HEPES中，调节pH为8.0，加入4μg的胰蛋白酶，37℃酶解12h。15000g离心20min得到酶切肽段，向酶切肽段中加入20μl的50mg/ml的HPG-ALD和4μl浓度为1M的氰基硼氰化钠，37度反应2-12h。然后将反应体系加入到含有滤膜的离心管中，15000rcf离心20min，将离心得到的肽段样品固载到C18反相捕集柱(4.6mm i.d.×1cm)进行除盐，使用0.1％三氟乙酸/80乙腈进行洗脱、冷冻干燥后，得到蛋白质N端肽段。
实施例2
以酵母为样品，首先使用液氮研磨法将酵母磨碎，使用6M盐酸胍的进行蛋白质的提取。取200μl浓度为1μg/μl的酵母蛋白质进行N端肽段的富集。加入2μl浓度为1M的二硫苏糖醇，56℃变性还原30min后，加入6μl浓度为1M碘乙酰胺室温避光反应30min，再向反应体系中加6μl 100浓度为1M二硫苏糖醇，室温孵育30min终止过量的碘乙酰胺，向溶液中加入终浓度为500mM的1H-吡唑-1-甲脒和500mM的三乙胺，95℃标记15min。使用甲酸将反应体系的pH至调节至7-8，使用10kDa的滤膜除掉没有反应的胍基化试剂，将蛋白质溶解再200μl的50mM的HEPES中，调节pH为8.0，加入4μg的胰蛋白酶，37℃酶解12h。15000rcf离心20min得到酶切肽段，向酶切肽段中加入1mL 10mg/mL十六醛(溶于正丙醇)，40μl 600mM氰基硼氢化钠水溶液，50℃反应过夜。将溶液冷冻干燥至50μl，加入1ml的0.1％三氟乙酸/2％乙腈/98水，4℃离心20min，将上清液转移到新的离心管中。使用C18反相捕集柱(4.6mm i.d.×1cm)对得到的样品进行除盐，使用0.1％三氟乙酸/80乙腈进行洗脱、冷冻干燥后，得到蛋白质N端肽段。
实施例3
以酵母为样品，首先使用液氮研磨法将酵母磨碎，使用6M盐酸胍的进行蛋白质的提取。将蛋白质进行还原烷基化处理后，向溶液中加入终浓度为500mM的1H-吡唑-1-甲脒和500mM的三乙胺，95℃标记30min。向反应体系中加入终浓度为80的丙酮，-20度放置2小时以上。离心得到蛋白质沉淀，并使用-20度的丙酮洗三遍。最后将蛋白质溶解在50mM的TEAB溶液中，胰蛋白酶的用量为蛋白质质量的1/50，37度消化过夜。向酶解后产生的肽段中加入N-羟基琥珀酰亚胺酯活性琼脂糖，25度反应1h，然后使用100mM的Tris-Cl终止氨基活性材料上的活性基团，37度反应1小时，2000rcf离心10min，将N-羟基琥珀酰亚胺酯活性琼脂糖与没有反应的蛋白质N末端肽段分离，实现蛋白质N末端肽段的选择性富集。
实施例4
以肝癌组织为样品，首先使用预冷的PBS清洗组织至无明显血色，加入6M盐酸胍，使用剪刀将组织剪碎，并进行超声，提取蛋白质。将蛋白质进行还原烷基化处理后，向溶液中加入终浓度为500mM的1H-吡唑-1-甲脒和500mM的三乙胺，95℃标记30min。向反应体系中加入终浓度为80的丙酮，-20度放置2小时以上。离心得到蛋白质沉淀，并使用-20度的丙酮洗三遍。最后将蛋白质溶解在50mM的TEAB溶液中，胰蛋白酶的用量为蛋白质质量的1/50，37度消化过夜。向酶解后产生的肽段中加入N-羟基琥珀酰亚胺酯活性琼脂糖，25度反应1h，然后使用100mM的Tris-Cl终止氨基活性材料上的活性基团，37度反应1小时，2000rcf离心10min，将N-羟基琥珀酰亚胺酯活性琼脂糖与没有反应的蛋白质N末端肽段分离，实现蛋白质N末端肽段的选择性富集。
实施例5
以血浆组织为样品，加入6M盐酸胍使得蛋白质变性，将蛋白质进行还原烷基化处理后，向溶液中加入终浓度为500mM的1H-吡唑-1-甲脒和500mM的三乙胺，95℃标记30min。向反应体系中加入终浓度为80的丙酮，-20度放置2小时以上。离心得到蛋白质沉淀，并使用-20度的丙酮洗三遍。最后将蛋白质溶解在50mM的TEAB溶液中，胰蛋白酶的用量为蛋白质质量的1/50，37度消化过夜。向酶解后产生的肽段中加入N-羟基琥珀酰亚胺酯活性琼脂糖，25度反应1h，然后使用100mM的Tris-Cl终止氨基活性材料上的活性基团，37度反应1小时，2000rcf离心10min，将N-羟基琥珀酰亚胺酯活性琼脂糖与没有反应的蛋白质N末端肽段分离，实现蛋白质N末端肽段的选择性富集。

Claims (9)

1.一种基于胍基化标记的蛋白质N端肽段反向富集的方法，包括：赖氨酸ε-氨基及多肽N端氨基的胍基化标记、胍基化试剂的去除，胍基化赖氨酸C端肽键的胰蛋白酶酶切及非蛋白质N末端肽段的选择性去除。
2.按照权利要求1的方法，其特征在于：胍基化标记过程为，
1)使用1H-吡唑-1-甲脒作为胍基化标记试剂(不仅能够对赖氨酸ε-氨基进行胍基化标记，而且能够实现肽段及蛋白质的N端氨基进行高效标记)；
2)使用1H-吡唑-1-甲脒进行高效胍基化标记的浓度为2mM-2M，反应加入氢氧化钠、三乙胺、二异丙基乙基氨等中的一种或二种以上不含自由氨基的碱调节pH为9-12，反应温度为25℃-99℃，反应时间为10min-24h。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：对胍基化试剂的去除过程为，可以利用蛋白质变性沉淀或者滤膜过滤方法将多余的胍基化试剂去除；
1)沉淀法出去胍基化标记试剂：利用氯仿-甲醇沉淀、三氟乙酸沉淀、或丙酮沉淀等方法将蛋白质变性沉淀，将蛋白质与多余的胍基化试剂分离，实现胍基化试剂的去除；
2)滤膜过滤法去除胍基化试剂：使用具有5kDa、10kDa或30kDa滤膜的离心管截留蛋白质，而胍基化试剂通过滤膜，实现蛋白质与多余胍基化试剂的去除。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：胍基化赖氨酸C端肽键的胰蛋白酶酶切过程为，利用蛋白质变性沉淀或者滤膜过滤方法，将胍基化试剂去除；将胍基化标记的蛋白质样品重溶解在包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、三乙胺-碳酸缓冲液(TEAB)等中的一种或二种以上不含有自由氨基的缓冲液中，胰蛋白酶用量为蛋白质质量的1/5-1/500，调节pH至6.5-9.5，在20-50℃酶解2-48h。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：利用氨基活性材料选择性去除非N末端肽段过程为，
1)氨基反应活性材料包括包括N-羟基琥珀酰亚胺酯活性琼脂糖、溴化氰活性琼脂糖、异氰酸树脂、醛基功能化材料、十一醛、十六醛、超支化聚甘油醛(HPG-ALD)等中的一种或二种以上，调节pH为2-13，15-95度反应10min至24h；
2)氨基活性材料上多余活性基团的终止：使用含有自由氨基的试剂如氨水、碳酸氢铵、乙醇胺、Tris-Cl等中的一种或二种以上与氨基活性材料上活性基团反应，中和多余的活性基团，氨基自由试剂使用浓度为1mM-1000mM，15-95度反应5min至4h；
3)纯化蛋白质N末端肽段：根据材料的性质，可以使用离心、亲和色谱、滤膜等方法中的一种或二种以上将氨基活性材料与没有反应的蛋白质N末端肽段分开。
6.按照权利要求1所述的方法，对富集产物进行质谱分析，为增强离子化效率，包括在电喷雾离子化(ESI)、离子喷雾离子化(ISI)、大气压化学离子化(APCI)或基质辅助激光解吸离子化(MALDI)等离子化效率的增强。
7.按照权利要求1所述的方法，对富集产物进行质谱分析，为提高肽段的二级谱图质量，包括在诱导碰撞解离(Collision Induced Dissociation：CID)、高能碰撞解离(HigherEnergy Collision Dissociation：HCD)、或电子转移解离(Electron TransferDissociation:ETD)等碰撞产生的二级谱图。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：胍基化标记的标记对象是蛋白质及氨基酸。
9.按照权利要求1所述的方法，其来源包括：胍基化标记的组织、细胞、血浆、标准蛋白等各种来源的含有氨基的样品中的一种或二种以上。
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