CN111208300B - 一种赖氨酸氮连接磷酸化翻译后修饰富集和鉴定的方法 - Google Patents

一种赖氨酸氮连接磷酸化翻译后修饰富集和鉴定的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生化分析领域，涉及一种赖氨酸氮连接的磷酸化翻译后修饰富集和鉴定方法。通过赖氨酸氮连接磷酸化肽段上磷酸基团丢失后产生新的仲胺与疏水衍生化试剂反应，并通过疏水相互作用对赖氨酸磷酸化肽段实现特异性富集，进而通过质谱分析获得鉴定。通过该方法，实现赖氨酸氮连接磷酸化翻译后修饰位点的大规模富集和鉴定。

Description

一种赖氨酸氮连接磷酸化翻译后修饰富集和鉴定的方法
技术领域
本发明涉及生化分析领域，具体的说，是通过化学衍生标记和特异性富集实现赖氨酸氮连接磷酸化翻译后修饰的富集和鉴定。
背景技术
蛋白质的磷酸化翻译后修饰是最常见、最重要的一种翻译后修饰之一，几乎参与了生命过程中的每个环节，研究报道其对蛋白质的结构和功能以及生物体中的信号传导起着重要的作用。近些年来，在大规模的磷酸化翻译后修饰的研究中，高效的磷酸化蛋白/磷酸化肽富集技术结合多维色谱分离技术以及高分辨的质谱的应用，极大的增强了磷酸化翻译后修饰的动态范围和检测限，越来越多的磷酸化位点和磷酸化蛋白被检测出来了。然而，这些磷酸化翻译后修饰主要包括丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸在内的氧连接的磷酸化修饰，而对于另一类磷酸化修饰——氮连接的磷酸化翻译后修饰，其丰度和生物学功能的研究却少有报道。
不同于氧连接磷酸化氨基酸，赖氨酸氮连接磷酸化具有不同的化学性质——在酸性条件下极不稳定，因此在传统的研究方法中容易发生水解而去磷酸化，因此目前为止尚无针对赖氨酸磷酸化富集和鉴定的文献报道。仅有少数文献研究了赖氨酸氮连接磷酸化肽的合成方法(Jordi Bertran-Vicente,Journal of the American Chemical Society,2014,136,13622-13628)及其在质谱中的碎裂规则(Jordi Bertran-Vicente,AnalyticalChemistry,2015,6990-6994)。随着现代生物化学与分子生物学技术的不断进步，人们对氮连接磷酸化翻译后的结构和功能的进一步认识，本领域也因此开始迅速发展。基于此，我们提出了一种通过化学衍生标记和特异性富集技术，实现了赖氨酸氮连接磷酸化翻译后修饰的富集和大规模鉴定。
发明内容
通过赖氨酸氮连接磷酸化肽段上磷酸基团丢失后产生新的仲胺与疏水衍生化试剂反应，并通过疏水相互作用对赖氨酸磷酸化肽段实现特异性富集，进而通过质谱分析获得鉴定。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案步骤如下：
步骤1)首先对蛋白酶解产物中的赖氨酸进行化学标记；
步骤2)对于步骤(1)中化学标记的蛋白酶解产物进行去除赖氨酸上磷酸基团的操作；
步骤3)对步骤(2)中除去磷酸基团的蛋白酶解产物进行可断裂的疏水化衍生；
步骤4)对步骤(3)中疏水化衍生的肽段进行特异性富集；
步骤5)对步骤(4)中富集到的肽段进行去疏水链断裂，最后对其进行质谱鉴定。
所述的蛋白酶解、化学标记、除去磷酸基团、可断裂的疏水化衍生、特异性富集和去疏水链断裂详细说明如下：
(1)蛋白酶解：将蛋白进行变性还原烷基化后，利用蛋白酶，如胰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和蛋白内切酶中的一种或二种以上，37℃条件下对蛋白进行酶解1-24h；所述蛋白为标准蛋白或标准蛋白混合物、细胞或组织中提取的全蛋白或部分蛋白。
(2)化学标记：用一种标记试剂对肽段N端和赖氨酸侧链的α氨基发生高选择性标记，其中标记试剂为：酸酐类试剂，如0.01-100％(w/w)的乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐中的一种或二种以上；羧基活化类试剂，如0.01-100％(w/w)的N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶中的一种或二种以上；醛类试剂，如0.01-100％(w/w)的甲醛、乙醛、丙醛中的一种或二种以上；以及氨基酸类试剂，如0.01-1M的精氨酸、赖氨酸、组氨酸中的一种或二种以上。反应的缓冲体系为：10-500mM的磷酸缓冲液(pH 7-9)、10-500mM的碳酸氢铵缓冲液(pH 7-9)、10-500mM的Tris-HCl缓冲液(pH 6-10)中的一种或二种以上。
(3)除去磷酸基团：在合适的条件下(pH 2-12)，加入一定量磷酸酶(如碱性赖氨酸磷酸酶或酸性赖氨酸磷酸酶)，在一定温度(4-50℃)下孵育0.01-24h；或加入酸性物质(如0.1％-100％(m/m)盐酸、硫酸、硝酸、甲酸、乙酸、丙酸、三氟乙酸、三氯乙酸等pH大于或等于1.0，小于或等于4.0液体中的一种或二种以上)，在一定温度(1-100℃)下孵育0.01-24h。
(4)可断裂的疏水化衍生：可断裂疏水化衍生所用的试剂是能与肽段赖氨酸侧链的α氨基发生高选择性反应同时生成疏水性且可断裂化学标签。其中：
可断裂是指能够在光照、酸性或化学条件下发生化学键断裂的基团。光照条件可断裂基团包括硝基苯在100-1000nm波长范围内的照射下断裂；酸性条件可断裂基团包括：席夫碱在pH 1-6的磷酸、盐酸、硫酸、硝酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸中的一种或二种以上水溶液中断裂；化学条件可断裂基团包括：邻二羟基在高碘酸钠水溶液中断裂和二硫键在二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦水溶液中断裂。
疏水化衍生是指通过化学反应使得肽段的疏水性增加。疏水性化学标签包括：长度为1-100个碳的脂肪族碳链、具有1-100个芳香环的芳香族化合物、以及由1-100个碳的脂肪碳链与1-100个芳香环组成的化合物中的一种或二种以上。
能与肽段赖氨酸侧链的α氨基发生高选择性反应的基团该包括：琥珀酰亚胺酯基团，如0.01-100％(w/w)的琥珀酰亚胺酯；酸酐基团，如0.01-100％(w/w)的乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐中的一种或二种以上；羧基活化基团，如0.01-100％(w/w)的N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶中的一种或二种以上；醛基团，如0.01-100％(w/w)的甲醛、乙醛、丙醛中的一种或二种以上；以及氨基酸基团，如0.01-1M的精氨酸、赖氨酸、组氨酸中的一种或二种以上。
(5)特异性富集：利用反相色谱法和疏水性材料法中的一种或两种，其中：
反相色谱法是指运用C6-C25反相色谱柱在线富集法和运用C6-C25反相色谱填料离线富集法中的一种或两种进行富集的方法；
疏水性材料法是指运用具有水接触角大于或等于90°，平均尺寸介于1nm-100μm的球形、棒状、片状、规则多边形和不规则形貌的材料进行富集的方法。
(6)疏水链断裂：(4)中所述的不同可断裂基团进行相应的断裂，其中：
光照条件可断裂基团，包括：硝基苯在100-1000nm波长范围内的照射0.1-60min断裂；
酸性条件可断裂基团，包括：席夫碱在pH 1-6的磷酸、盐酸、硫酸、硝酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸中的一种或二种以上水溶液中反应0.1-180min断裂；
化学条件可断裂基团，包括：邻二羟基在高碘酸钠水溶液中断裂和二硫键在二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦水溶液中反应0.1-180min断裂。
本发明所述方法应用于蛋白质组学分析。
与传统磷酸化翻译后修饰的富集和鉴定相比，发明具有以下优点：
(1)该富集策略简单，只需要疏水化衍生而获得高效的富集；
(2)经过可断裂基团的断裂，鉴定到的磷酸化肽带有特殊标签，能够准确定位；
(3)这是专门针对赖氨酸氮连接磷酸化肽的特异性富集方法。
附图说明
图1为本发明的流程图；
图2为a)标准赖氨酸磷酸化肽A0与牛血清白蛋白(BSA)酶解产物的混合物(1:100，m/m)经过b)衍生和富集、c)去疏水链后的MALDI-TOF质谱图；
图3为三种可断裂疏水衍生化试剂结构图。
具体实施方式
以下提供本发明简单样品和实际样品中赖氨酸氮连接的磷酸化翻译后修饰富集和鉴定方法的具体实施方式。
实施例1
牛血清白蛋白(BSA)酶解产物中标准赖氨酸磷酸化肽A0(磷酸基团位于赖氨酸侧链的α氨基)的富集和鉴定。
首先利用胰蛋白酶对BSA进行酶解，得到BSA的酶解产物。然后将标准赖氨酸磷酸化肽(A0)与BSA酶解产物以质量比1:100混合(图2a)，进行二甲基化标记，然后向肽段混合物中加入2μL三氟乙酸(TFA)，水浴60℃反应1h去除肽段磷酸化修饰。对去磷酸化后的肽段混合物进行可断裂的疏水化衍生，衍生试剂如图3a所示。接着，将溶液冻干并复溶于A溶液(2％乙腈，0.1％TFA)，向其中加入适量XBP C18填料，室温孵育、清洗和洗脱后(图2b)，加入TCEP还原得到目标肽段(图2c)。
标准赖氨酸磷酸化肽(A0)氨基酸序列:TGIFK(Pho)SAR
蛋白酶解条件：将1mg BSA溶于100μL 8M的尿素，加入8μL 1M的二硫苏糖醇，56℃反应1.5h，再加入20μL 1M的碘乙酰胺，避光反应0.5h，加入1.6mL 50mM的碳酸氢铵溶液，再加入30μg胰蛋白酶，37℃水浴反应16h，除盐后得到BSA酶解产物。
化学标记(这里是甲基化标记)条件：在100mM的磷酸缓冲液(pH 8)中，加入一定体积的0.6M的氰基硼氢化钠和4％(v/v)的甲醛，室温反应1h。
去磷酸化条件：向收集的肽段中加入2μL TFA得到pH为1的溶液，水浴60℃反应1h；
可断裂的疏水化衍生条件：将肽段除盐，分散于80％乙腈(50mM HEPES)溶液中，加入适量试剂(结构如图3a)，45℃反应4h；
富集条件：将肽段溶液冻干，复溶于A溶液(2％乙腈，0.1％TFA)，向其中加入适量XBP C18填料，室温孵育20min。用B溶液(20％乙腈，0.1％TFA)清洗三遍后用C溶液(50％乙腈，0.1％TFA)洗脱；
疏水链断裂条件：向上述溶液中加入10mM TCEP，56℃反应1h。
如图2c所示，上述实验实现了标准赖氨酸磷酸化肽(A0)与BSA酶解产物以质量比1:100(m/m)条件下对赖氨酸磷酸化肽的特异性富集。
由图可以看出在富集之前目标肽段被掩盖在大量干扰肽段中难以被鉴定，经过富集，仅有目标肽段出现在谱图中。说明我们对A0进行了特异性地富集。
实施例2
大肠杆菌蛋白酶解产物中赖氨酸磷酸化肽的富集和鉴定。
首先利用胰蛋白酶对大肠杆菌蛋白进行酶解，得到大肠杆菌蛋白的酶解产物。然后将酶解产物进行二甲基化标记，然后利用高pH C18反相色谱柱对混合肽段进行色谱分级，每5min级分合并收集，共收集7个级分，收集的每个级分中加入2μL TFA，60℃反应1h去除肽段磷酸化修饰，对去磷酸化后每个级分进行冻干，复溶于80％乙腈(50mM HEPES)溶液中，进行可断裂疏水化衍生(图3a)。接着，将溶液冻干并复溶于A溶液(2％乙腈，0.1％TFA)，向其中加入适量XBP C18填料，室温孵育、清洗和洗脱后，加入TCEP还原得到目标肽段。最后对得到的肽段进行LC-ESI-MS/MS分析。一共鉴定到129个赖氨酸磷酸化位点。
高pH C18反相色谱柱(Durashell C18)：5μm,
Figure BDA0001873821170000041
2.1mm i.d.×150mm；
色谱条件：
(1)流动相A：10mM醋酸铵，98％水，氨水调pH 10；流动相B：10mM醋酸铵，80％乙腈，氨水调pH 10。
(2)分离梯度：0-25min：6-45％B；25-30min：45-100％B；30-40min：100％B。
(3)流速：300μL/min。
蛋白酶解条件：将1mg大肠杆菌蛋白溶于100μL 8M的尿素，加入8μL 1M的二硫苏糖醇，37℃反应1h，再加入20μL 1M的碘乙酰胺，避光反应0.5h，加入1.6mL 50mM的碳酸氢铵溶液，再加入300μg胰蛋白酶，37℃水浴反应1.5h，得到大肠杆菌蛋白酶解产物。
化学标记(这里是甲基化标记)条件：在100mM的磷酸缓冲液(pH 8)中，加入一定体积的0.6M的氰基硼氢化钠和4％(v/v)的甲醛，室温反应1h。
去磷酸化条件：向收集的肽段中加入2μL TFA得到pH为1的溶液，水浴60℃反应1h；
可断裂的疏水化衍生条件：将肽段除盐，分散于70％乙腈(50mM HEPES)溶液中，加入适量试剂(结构如图3a)，37℃反应6h；
富集条件：将肽段溶液冻干，复溶于A溶液(2％乙腈，0.1％TFA)，向其中加入适量XBP C18填料，室温孵育20min。用B溶液(20％乙腈，0.1％TFA)清洗三遍后用C溶液(50％乙腈，0.1％TFA)洗脱；
疏水链断裂条件：向上述溶液中加入10mM TCEP，56℃反应1h。
最后对得到的肽段进行LC-ESI-MS/MS分析。
实施例3
海拉蛋白酶解产物中赖氨酸磷酸化肽的富集和鉴定。
首先利用胰蛋白酶对海拉蛋白进行酶解，得到海拉蛋白的酶解产物。然后将酶解产物进行二甲基化标记，然后利用强阳离子交换色谱柱对混合肽段进行色谱分级，共收集10个级分，收集的每个级分中加入2μL TFA，60℃反应1h去除肽段磷酸化修饰，对去磷酸化后每个级分进行除盐，复溶于70％乙腈(50mM HEPES)溶液中，进行可断裂疏水化衍生(图3b)。接着，将溶液冻干并复溶于A溶液(2％乙腈，0.1％TFA)，用装有5μm,
Figure BDA0001873821170000051
4.6mm i.d.×150mm XBP C18色谱柱的高效液相色谱进行富集，清洗和洗脱后，加入二硫苏糖醇还原得到目标肽段。最后对得到的肽段进行LC-ESI-MS/MS分析。一共鉴定到156个赖氨酸磷酸化位点。
强阳离子交换色谱柱(Tosoh)：7μm,
Figure BDA0001873821170000052
2.1mm i.d.×150mm；
色谱条件：
(1)流动相A：10mM磷酸二氢钾，10％乙腈，磷酸调pH 2.7；流动相B：10mM磷酸二氢钾，1M氯化钠，10％乙腈，磷酸调pH 2.7。
(2)分离梯度：0-75min：6-45％B；75-80min：45-100％B；80-100min：100％B。
(3)流速：0.3mL/min。
蛋白酶解条件：将1mg海拉蛋白溶于100μL 8M的尿素，加入二硫苏糖醇使其终浓度为25mM，37℃反应1h，再加入碘乙酰胺使其终浓度为75mM，避光反应0.5h，加入50mM的碳酸氢铵溶液将尿素浓度稀释至1M，再加入300μg胰蛋白酶，37℃水浴反应1.5h，得到海拉蛋白酶解产物。
化学标记(这里是甲基化标记)条件：在100mM的磷酸缓冲液(pH 8)中，加入一定体积的0.6M的氰基硼氢化钠和4％(v/v)的甲醛，室温反应1h。
去磷酸化条件：向收集的肽段中加入2μL TFA得到pH为1的溶液，水浴60℃反应1h；
可断裂疏水化衍生条件：将肽段除盐，分散于70％乙腈(50mM HEPES)溶液中，加入适量试剂(结构如图3b)和0.6M氰基硼氢化钠，37℃反应2h；
富集条件：将肽段溶液冻干，复溶于A溶液(2％乙腈，0.1％TFA)，上样于XBP C18色谱柱上。用B溶液(20％乙腈，0.1％TFA)清洗至没有峰出来后用C溶液(50％乙腈，0.1％TFA)洗脱；
疏水链断裂条件：向上述溶液中加入20mM二硫苏糖醇，56℃反应1h。
最后对得到的肽段进行LC-ESI-MS/MS分析。
实施例4
大鼠肝组织蛋白酶解产物中赖氨酸磷酸化肽的富集和鉴定。
首先利用胰蛋白酶对大鼠肝组织蛋白进行酶解，得到大大鼠肝组织蛋白的酶解产物。然后将酶解产物进行二甲基化标记，然后利用强阴离子交换色谱柱色谱柱对混合肽段进行色谱分级，共收集8个级分，向收集的每个级分中加入3000units的碱性磷酸酶，水浴37℃反应1h去除肽段磷酸化修饰，对去磷酸化后每个级分进行除盐，复溶于70％乙腈(50mMHEPES)溶液中，进行可断裂疏水化衍生(图3b)。接着，将溶液冻干并复溶于A溶液(2％乙腈，0.1％TFA)，用装有5μm,
Figure BDA0001873821170000061
4.6mm i.d.×150mm XBP C18色谱柱的高效液相色谱进行富集，清洗和洗脱后，加入TCEP还原得到目标肽段。最后对得到的肽段进行LC-ESI-MS/MS分析。一共鉴定到108个赖氨酸磷酸化位点。
强阴离子交换色谱柱(Proteomix)：3μm,
Figure BDA0001873821170000062
4.6mm i.d.×150mm；
色谱条件：
(1)流动相A：10mM Tris，10％乙腈，氢氧化钠调pH 8.0；流动相B：10mM Tris，10％乙腈，氢氧化钠调pH 8.0。
(2)分离梯度：0-75min：6-45％B；75-80min：45-100％B；80-100min：100％B。
(3)流速：1mL/min。
蛋白酶解条件：将1mg大鼠肝组织蛋白溶于100μL 8M的尿素，加入8μL1M的二硫苏糖醇，56℃反应1.5h，再加入20μL 1M的碘乙酰胺，避光反应0.5h，加入1.6mL 50mM的碳酸氢铵溶液，再加入30μg胰蛋白酶，37℃水浴反应16h，除盐后得到大鼠肝组织蛋白酶解产物。
化学标记(这里是甲基化标记)条件：在100mM的磷酸缓冲液(pH 8)中，加入一定体积的0.6M的氰基硼氢化钠和4％(v/v)的甲醛，室温反应1h。
去磷酸化条件：向收集的肽段中加入30000units的酸性磷酸酶，水浴37℃反应1h；
可断裂疏水化衍生条件：将肽段除盐，分散于70％乙腈(50mM HEPES)溶液中，加入适量试剂(结构如图3b)和0.6M氰基硼氢化钠，37℃反应1h；
富集条件：将肽段溶液冻干，复溶于A溶液(2％乙腈，0.1％TFA)，上样于XBP C18色谱柱上。用B溶液(20％乙腈，0.1％TFA)清洗至没有峰出来后用C溶液(50％乙腈，0.1％TFA)洗脱；
疏水链断裂条件：向上述溶液中加入20mM TCEP，56℃反应1h。
最后对得到的肽段进行LC-ESI-MS/MS分析。
实施例5
肺癌A549细胞蛋白酶解产物中赖氨酸磷酸化肽的富集和鉴定。
首先利用胰蛋白酶对肺癌A549蛋白进行酶解，得到肺癌A549细胞蛋白的酶解产物。然后将酶解产物进行二甲基化标记，然后利用强阳离子交换色谱柱对混合肽段进行色谱分级，收集12个级分，向收集的每个级分中加入30000units的酸性赖氨酸磷酸酶，水浴37℃反应1h去除肽段磷酸化修饰，对去磷酸化后每个级分进行除盐，复溶于70％乙腈(50mMHEPES)溶液中，进行可断裂疏水化衍生(图3c)。接着，将溶液冻干并复溶于A溶液(2％乙腈，0.1％TFA)，用装有5μm,
Figure BDA0001873821170000071
4.6mm i.d.×150mm XBP C18色谱柱的高效液相色谱进行富集，清洗和洗脱后，加入10mM高碘酸钠得到目标肽段。最后对得到的肽段进行LC-ESI-MS/MS分析。一共鉴定到109个赖氨酸磷酸化位点。
强阳离子交换色谱柱(Tosoh)：7μm,
Figure BDA0001873821170000072
2.1mm i.d.×150mm；
色谱条件：
(1)流动相A：10mM磷酸二氢钾，10％乙腈，磷酸调pH 2.7；流动相B：10mM磷酸二氢钾，1M氯化钠，10％乙腈，磷酸调pH 2.7。
(2)分离梯度：0-75min：6-45％B；75-80min：45-100％B；80-100min：100％B。
(3)流速：300μL/min。
蛋白酶解条件：将1mg肺癌A549细胞蛋白溶于100μL 8M的尿素，加入8μL 1M的二硫苏糖醇，56℃反应1.5h，再加入20μL 1M的碘乙酰胺，避光反应0.5h，加入1.6mL 50mM的碳酸氢铵溶液，再加入30μg胰蛋白酶，37℃水浴反应16h，除盐后得到肺癌A549细胞蛋白酶解产物。
化学标记(这里是甲基化标记)条件：在100mM的磷酸缓冲液(pH 8)中，加入一定体积的0.6M的氰基硼氢化钠和4％(v/v)的甲醛，室温反应1h。
去磷酸化条件：向收集的肽段中加入30000units的酸性磷酸酶，水浴37℃反应1h；
可断裂的疏水化衍生条件：将肽段除盐，分散于70％乙腈(50mM HEPES)溶液中，加入适量试剂(结构如图3c)，37℃反应1h；
富集条件：将肽段溶液冻干，复溶于A溶液(2％乙腈，0.1％TFA)，上样于XBP C18色谱柱上。用B溶液(20％乙腈，0.1％TFA)清洗至没有峰出来后用C溶液(50％乙腈，0.1％TFA)洗脱；
疏水链断裂条件：向上述溶液中加入10mM高碘酸钠，37℃反应30min。
最后对得到的肽段进行LC-ESI-MS/MS分析。
实施例6
SMMC7721细胞蛋白酶解产物中赖氨酸磷酸化肽的富集和鉴定。
首先利用胰蛋白酶对SMMC7721细胞蛋白进行酶解，得到SMMC7721细胞蛋白的酶解产物。然后将酶解产物进行二甲基化轻标，然后利用高pH C18反相色谱柱对混合肽段进行第一次色谱分级，收集12个级分，向收集的每个级分中加入30000units的酸性赖氨酸磷酸酶，水浴37℃反应1h去除肽段磷酸化修饰，对去磷酸化后每个级分进行除盐，复溶于70％乙腈(50mM HEPES)溶液中，进行可断裂疏水化衍生(图3c)。接着，将溶液冻干并复溶于A溶液(2％乙腈，0.1％TFA)，用装有5μm,
Figure BDA0001873821170000081
4.6mm i.d.×150mm XBP C18色谱柱的高效液相色谱进行富集，清洗和洗脱后，加入10mM高碘酸钠得到目标肽段。最后对得到的肽段进行LC-ESI-MS/MS分析。一共鉴定到98个赖氨酸磷酸化位点。
高pH C18反相色谱柱(Durashell C18)：5μm,
Figure BDA0001873821170000082
2.1mm i.d.×150mm；
色谱条件：
(1)流动相A：10mM醋酸铵，98％水，氨水调pH 10；流动相B：10mM醋酸铵，80％乙腈，氨水调pH 10。
(2)分离梯度：0-75min：6-45％B；75-80min：45-100％B；80-100min：100％B。
(3)流速：300μL/min。
蛋白酶解条件：将1mg SMMC7721细胞蛋白溶于100μL 8M的尿素，加入8μL 1M的二硫苏糖醇，56℃反应1.5h，再加入20μL 1M的碘乙酰胺，避光反应0.5h，加入1.6mL 50mM的碳酸氢铵溶液，再加入30μg胰蛋白酶，37℃水浴反应16h，除盐后得到SMMC7721细胞蛋白酶解产物。
化学标记(这里是甲基化标记)条件：在100mM的磷酸缓冲液(pH 8)中，加入一定体积的0.6M的氰基硼氢化钠和4％(v/v)的甲醛，室温反应1h。
去磷酸化条件：向收集的肽段中加入30000units的碱性赖氨酸磷酸酶，水浴37℃反应1h；
可断裂疏水化衍生条件：将肽段除盐，分散于70％乙腈(50mM HEPES)溶液中，加入适量试剂(结构如图3c)，37℃反应1h；
富集条件：将肽段溶液冻干，复溶于A溶液(2％乙腈，0.1％TFA)，上样于XBP C18色谱柱上。用B溶液(20％乙腈，0.1％TFA)清洗至没有峰出来后用C溶液(50％乙腈，0.1％TFA)洗脱；
疏水链断裂条件：向上述溶液中加入10mM高碘酸钠，37℃反应20min。
最后对得到的肽段进行LC-ESI-MS/MS分析。

Claims (10)

1.一种赖氨酸氮连接的磷酸化翻译后修饰肽段的富集和鉴定方法，其特征在于：
步骤（ 1）对蛋白酶解产物中的赖氨酸进行化学标记；
步骤（ 2）对于步骤（1）中化学标记的蛋白酶解产物进行去除赖氨酸上磷酸基团的操作；
步骤（ 3）对步骤（2）中除去磷酸基团的蛋白酶解产物进行可断裂的疏水化衍生；
步骤（ 4）对步骤（3）中疏水化衍生的肽段进行特异性富集；
步骤（ 5）对步骤（4）中富集到的肽段进行去疏水链断裂，最后对其进行质谱鉴定；
可断裂的疏水化衍生的过程采用的可断裂疏水化衍生化试剂是：能与肽段赖氨酸侧链的α氨基发生高选择性反应同时生成可断裂疏水性化学标签的分子。
2.按照权利要求1所述的富集和鉴定方法，其特征在于：蛋白酶解产物是胰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶以及蛋白内切酶中的一种或二种以上对蛋白进行酶解后的产物。
3.按照权利要求1所述的富集和鉴定方法，其特征在于：化学标记的过程为，化学标记采用是能与肽段N端和赖氨酸侧链的α氨基发生选择性反应同时生成化学标签的试剂中的一种或二种以上，该试剂包括酸酐类试剂：重量比0.01-100%的乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐中的一种或二种以上；羧基活化类试剂：重量比0.01-100%的N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶中的一种或二种以上；醛类试剂：重量比0.01-100%的甲醛、乙醛、丙醛中的一种或二种以上；以及氨基酸类试剂：0.01-1 M的精氨酸、赖氨酸、组氨酸中的一种或二种以上；
反应的缓冲体系为：pH 7-9，浓度为10-500 mM的磷酸缓冲液、pH 7-9，浓度为10-500mM的碳酸氢铵缓冲液、pH 6-10，浓度为10-500 mM的Tris-HCl缓冲液中的一种或二种以上。
4.按照权利要求1所述的富集和鉴定方法，其特征在于：除去磷酸基团的蛋白酶解产物的过程为，运用磷酸酶去除法和酸去除法中的一种或两种；
所述磷酸酶去除法是采用一种或两种赖氨酸磷酸酶去除赖氨酸上的磷酸基团的方法，磷酸酶包括碱性赖氨酸磷酸酶或酸性赖氨酸磷酸酶中的一种或两种；
所述酸去除法是采用酸性物质去除赖氨酸上的磷酸基团的方法，酸性物质是pH大于或等于1.0，小于或等于4.0的液体物质，具体为质量比为0.1%-100%的盐酸、硫酸、硝酸、甲酸、乙酸、丙酸、三氟乙酸、三氯乙酸中的一种或二种以上。
5.按照权利要求1所述的富集和鉴定方法，其特征在于：可断裂是指能够在光照、酸性或化学条件下发生化学键断裂的基团；
光照条件可断裂基团包括硝基苯在100-1000 nm波长范围内的照射下断裂；
酸性条件可断裂基团包括：席夫碱在pH 1-6的磷酸、盐酸、硫酸、硝酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸中的一种或二种以上水溶液中断裂；
化学条件可断裂基团包括：邻二羟基在高碘酸钠水溶液中断裂和/或二硫键在二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦水溶液中断裂。
6.按照权利要求1所述的富集和鉴定方法，其特征在于：
疏水化衍生是指通过化学反应使得肽段的疏水性增加;
疏水性化学标签包括：长度为1-100个碳的脂肪族碳链、具有1-100个芳香环的芳香族化合物、以及由1-100个碳的脂肪碳链与1-100个芳香环组成的化合物中的一种或二种以上。
7.按照权利要求1所述的富集和鉴定方法，其特征在于：能与肽段赖氨酸侧链的α氨基发生选择性反应的基团包括下述中的一种或二种以上,
琥珀酰亚胺酯基团：重量比0.01-100%的琥珀酰亚胺酯；酸酐基团：重量比0.01-100%的乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐中的一种或二种以上；羧基活化基团：重量比0.01-100%的N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶中的一种或二种以上；醛基团：重量比0.01-100%的甲醛、乙醛、丙醛中的一种或二种以上；以及氨基酸基团：0.01-1M的精氨酸、赖氨酸、组氨酸中的一种或二种以上。
8.按照权利要求1所述的富集和鉴定方法，其特征在于：特异性富集的过程为,利用反相色谱法和疏水性材料法中的一种或两种进行富集；
所述反相色谱法是指运用C6-C25反相色谱柱在线富集法和运用C6-C25反相色谱填料离线富集法中的一种或两种进行富集的方法；
所述疏水性材料法是指运用具有水接触角大于或等于90°，平均尺寸介于1 nm-100 μm的球形、棒状、片状、规则多边形和不规则形貌的材料进行富集的方法。
9.按照权利要求5所述的富集和鉴定方法，其特征在于：不同可断裂基团进行相应的断裂，具体为：
光照条件可断裂基团，包括：硝基苯在100-1000 nm波长范围内的照射0.1-60 min断裂；
酸性条件可断裂基团，包括：席夫碱在pH 1-6的磷酸、盐酸、硫酸、硝酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸中的一种或二种以上水溶液中反应0.1-180 min断裂；
化学条件可断裂基团，包括：邻二羟基在高碘酸钠水溶液中断裂和/或二硫键在二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦水溶液中反应0.1-180 min断裂。
10.按照权利要求1所述的富集和鉴定方法，其特征在于：所述质谱是飞行时间类质谱、离子阱类和轨道阱类质谱中的一种或二种。
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