CN111208244A - 一种非抗体依赖的蛋白质甲基化修饰富集分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种非抗体依赖的蛋白质甲基化修饰富集分析新方法及应用，包括Lys‑C/Trypsin/Arg‑C连续酶切、酶切肽段N段氨基的固定、甲基化修饰肽段的选择性释放及LC‑MS/MS分析及数据解析甲基化修饰位点信息。首先对含有蛋白质甲基化修饰的样本进行Lys‑C/Trypsin/Arg‑C多种酶切消化，然后将连续酶切得到的肽段与氨基反应活性材料反应，实现肽段的固定，最后利用特异性酶对固定肽段中含有甲基化修饰的赖氨酸和精氨酸N端肽键特异性酶切。本发明的优点是实现了多种类型低丰度蛋白质甲基化修饰的同时富集，包括赖氨酸二甲基化修饰、赖氨酸三甲基化修饰、精氨酸单甲基化修饰以及精氨酸二甲基化修饰。

Description

一种非抗体依赖的蛋白质甲基化修饰富集分析方法
技术领域
本发明涉及一种非抗体依赖的蛋白质甲基化修饰富集分析新方法及应用，实现了多种类型蛋白质甲基化修饰的同时分析。
背景技术
蛋白质甲基化修饰是一种广泛存在的且具有重要生物功能的翻译后修饰之一，如组蛋白质甲基化修饰参与基因的转录、DNA的损伤修复、信号传导等多种生命活动过程。蛋白质甲基化修饰的调控异常与多种疾病存在着密切的联系，如蛋白质甲基化修饰调控异常与乳腺癌、肺癌、淋巴癌、艾滋病以及心血管疾病等密切相关。此外蛋白质甲基化修的动态变化对生命活动具有重要的调节作用，如Jarid2蛋白质116赖氨酸甲基化修饰(Kme)通过增强甲基化转移酶复合体PRC2的活性进而调节组蛋白H3上27位赖氨酸三甲基化修饰(H2K27me3)的聚集，Jarid2的K116me和组蛋白H3K27me3之间的交互作用(cross-talk)对胚胎干细胞的分化具有重要的作用(Molecular Cell，2015，57(5)：769-783)；TP53蛋白质370位发生二甲化修饰时，TP53则表现为激活状态；在LSD1去甲基化酶的作用下转变为单甲基化修饰时，此时的TP53表现为失活状态,通过对TP53的甲基化状态的调控，从而调节TP53的肿瘤抑制和转录调控作用(Nature，2007，449(7158)：105-108)。因此对生物体内蛋白质甲基化修饰位点进行深度覆盖分析，对研究蛋白质甲基化修饰以及cross-talk在疾病的发生发展中的调控作用具有重要意义。
蛋白质甲基化修饰主要集中在赖氨酸和精氨酸残基侧链上，赖氨酸残基能够发生单甲基化、二甲基化和三甲基化修饰，而精氨酸残基能够发生单甲基化、对称二甲基化和非对称二甲基化修饰。由于蛋白质甲基化修饰不仅丰度低，而且具有多样性及复杂性程度高等特点，在蛋白质组学水平上对蛋白质甲基化位点进行深度覆盖分析仍十分困难。而甲基化肽段的富集分离困难是影响其分析的主要原因，目前，甲基化修饰肽段的富集主要是基于抗体的免疫沉淀法。然而甲基化引入的修饰基团较小，对修饰后氨基酸的理化性质改变也较小，难以获得高特异性的抗体对甲基化修饰肽段进行有效富集，因此利用抗体对甲基化修饰肽段的富集效率低以及特异性差(Nature Protocol，2014，9(1)：37-50)。近年来出现了利用化学衍生化方法、抗体改造以及利用天然甲基结合域蛋白质对甲基化修饰位点进行富集的策略。利用化学衍生化方法是在修饰基团引入可富集基团(Molecular Cell，2013，50(5)：723-735)，通过细胞代谢将含有可富集的甲基基团转移到蛋白上，通过对可富集基团的解析得出甲基化修饰位点，该方法无法应用于临床样本且难以代表生理状态下的甲基化修饰位点限制了该方法的应用；而利用改造后的抗体和天然甲基结合域对甲基化修饰进行富集，尽管提高了抗体的特异性和效率，但是难以实现对不同类型的赖氨酸和精氨酸甲基化修饰的同时富集，而且需要准备非常大量的全蛋白才能够实现对单一类型甲基化修饰肽段的富集检测，如Wu等利用改造后的抗体对150mg的全蛋白质进行了80次抗体富集后，仅仅鉴定出446个赖氨酸单甲基化修饰(Molecular Cell Proteomics，2015，14(2)：329-339)，同时该类方法不能对多种赖氨酸和精氨酸甲基化化修饰进行同时富集，因此利用抗体富集和甲基化结合域难以实现对甲基化修饰的深度覆盖分析。为了实现对多种蛋白质甲基化修饰的深度鉴定，出现了利用Trypsin无法水解甲基化修饰的赖氨酸和精氨酸从而使得甲基化修饰肽段在碱性条件多一个电荷的特性，使用强阳离子交换柱(SCX)对甲基化修饰的肽段进行非抗体方法的富集后进行质谱鉴定，最终在768个蛋白质上鉴定出887个甲基化修饰位点(Analytical Chemistry，2016，88(23)：11319-11327)。由于该方法是利用强阳离子交换柱对甲基化修饰的肽段进行富集，很容易受到在碱性条件下带正电氨基酸的干扰，对甲基化修饰肽段的富集效率较低，难以实现蛋白质甲基化修饰的深度覆盖分析。因此，开发蛋白质甲基化修饰肽段高选择性的富集方法，提高甲基化修饰肽段的富集效率，是实现生物体内甲基化修饰位点的全面深度覆盖分析的关键所在，对研究蛋白质甲基化动态修饰的功能和调控机制具有重要意义。
针对目前蛋白质甲基化修饰分析过程中的富集特异性差、难以实现规模化分析以等问题，通过利用Lys-C/Trypsin/Arg-C多种酶对样本进行酶切，降低无甲基化修饰赖氨酸和精氨酸酶漏切，然后利用氨基反应活性材料与多种酶切得到的肽段反应，实现肽段的固定，最后利用Lysarginase或者Trypsin-N对固定肽段中含有甲基化修饰的赖氨酸和精氨酸N端肽键特异性酶切，实现甲基化修饰肽段的释放，利用亲和色谱或者分子筛将固相材料与释放的甲基化修饰肽段进行分离，从而实现多种内源性甲基化修饰肽段的高选择性同时富集，
发明内容
本发明发展了一种非抗体依赖的蛋白质甲基化修饰富集分析新方法，本发明的优点是实现了多种类型低丰度蛋白质甲基化修饰的同时富集，包括赖氨酸二甲基化修饰、赖氨酸三甲基化修饰、精氨酸单甲基化修饰以及精氨酸二甲基化修饰。
为了实现该目的，本发明的技术方案是：
1、采用Lys-C/Trypsin/Arg-C连续酶切对蛋白质进行酶切
使用8M尿素或者6M盐酸胍作为裂解液进行蛋白质的提取，然后加入终浓度为10mM的二硫苏糖醇，于56度反应30min，然后加入终浓度为30mM的碘乙酰胺，于室温避光反应30min，最后使用终浓度为30mM的二硫苏糖醇于室温反应30min终止过量的碘乙酰胺。
按照Lyc-C比蛋白质的质量比为0.2至0.002加入Lys-C，调节pH值为7.4，37度消化4h，然后将尿素或者盐酸胍浓度稀释至1M以下，
按照Trypsin比蛋白质的质量比为0.2至0.002加入Trypsin，调节pH值为7.4，37度消化过夜。
将得到的蛋白酶酶切肽段使用反相C18柱进行除盐并干燥，然后将干燥后的肽段溶解在含有5mM的氯化钙、5mM的二硫苏糖醇、2mM的EDTA的20mM的HEPES中，调节pH值为7.4，按照Arg-C比蛋白质的质量比为0.2至0.002加入Arg-C，37度消化过夜。使用10kD的滤膜去除Arg-C，将得到的肽段合，并用于后续的固定化标记。
2、使用氨基活材料固定上述酶切得到的肽段
氨基活性材料可以是N-羟基琥珀酰亚胺酯活性琼脂糖、溴化氰活性琼脂糖、异氰酸树脂、醛基功能化材料等能够与氨基进行共价反应的材料，将上述材料加入到Lys-C/Trypsin/Arg-C连续酶切得到的肽段体系中，调节pH为3-12，20-65度10min至24h。使用氨水、碳酸氢铵、乙醇胺、Tris-Cl等含有自由氨基的试剂中和材料上没有反应的活性基团，试剂使用浓度为1mM-1000mM，20-70度反应5min至4h。根据氨基活性材料的性质，使用离心、亲和色谱、分子筛等方法去除多余试剂以及没有被固定的肽段，得到还有固定化肽段修饰的材料。
3、甲基化修饰的肽段的选择性释放
按照Lysarginase或者Trypsin-N等具有酶切甲基化修饰的赖氨酸和精氨酸的酶比蛋白质的质量比为0.2至0.002加入到上述含有固定肽段的材料中，在20-50℃酶解2-48h。根据氨基活性材料的性质，使用离心、亲和色谱、分子筛等方法将释放下来的甲基化修饰肽段与材料分离，得到具有甲基化修饰的肽段。
4、LC-MS/MS分析得到的甲基化修饰肽段
利用ESI电离模式电离甲基化修饰的肽段，使用Orbitrap或者TOF为质量分析器的质谱仪分析，利用目前数据依赖或者从头测序软件，如Mascot、MaxQuant、pFide、SEQUEST，PEAKS等对数据进行分析，解析甲基化修饰位点信息。
本发明的有益效果为：
1、Lys-C/Trypsin/Arg-C连续酶切能够显著降低赖氨酸和精氨酸的漏切率，降低因漏切导致的非甲基化修饰肽段对甲基化修饰的干扰。
2、氨基活性材料与肽段N端氨基具有很高的反应活性，实现肽段的高效固定。
3、通过Lysarginase或者Trypsin-N等对甲基化修饰的赖氨酸和精氨酸N端肽键特异性水解，从而释放出甲基化修饰的肽段，不仅提高甲基化修饰富集的选择性，而且可以实现多种类型蛋白质甲基化修饰的同时富集，包括赖氨酸二甲基化修饰、赖氨酸三甲基化修饰、精氨酸单甲基化修饰以及精氨酸二甲基化修饰。
4、利用超高分别率及超高速度生物质谱分析，可以实现甲基化修饰的高通量分析。
附图说明
图1、一种非抗体依赖的蛋白质甲基化修饰富集分析新方法流程。
具体实施方式
实施例1
如图1所示，将蛋白质进行还原烷基化处理后，使用Lys-C/Trypsin/Arg-C三种酶对蛋白质进行酶切处理，然后在使用氨基活性材料将酶切得到的肽段固定，进一步使用具有酶切甲基化修饰赖氨酸和精氨酸的酶Lysarginase或者Trypsin-N对固定的肽段进行酶切，利用亲和色谱或者分子筛将酶切的甲基化修饰肽段与材料进行分离，从而实现甲基化修饰肽段的富集，利用高效液相反向色谱-超高分别率生物质谱(LC-MS/MS)对富集的甲基化修饰样品进行分析。
以子宫颈癌Hela细胞为样品，使用8M尿素为裂解液进行蛋白质的提取，对提取对蛋白质进行BCA定量，取1mg的蛋白质进行甲基化修饰的分析。加入二硫苏糖醇至终浓度为10mM，56℃变性还原30min后，加入碘乙酰胺至终浓度为30mM，室温避光反应30min，再向反应体系中加二硫苏糖醇至终浓度为30mM，室温孵育30min终止过量的碘乙酰胺。加入10μg的Lys-C，调节pH至7.4，37度酶切4h，然后使用50mM的碳酸氢铵溶液将尿素稀释至0.8M，加入10μg的Trypsin，37℃酶解过夜。15000rcf离心20min得到酶切肽段，将离心得到的肽段样品固载到C18反相捕集柱(4.6mm i.d.×1cm)进行除盐，使用质量浓度0.1％三氟乙酸/体积浓度80％乙腈进行洗脱、冷冻干燥后。然后将干燥后的肽段溶解在含有5mM的氯化钙、5mM的二硫苏糖醇、2mM的EDTA的20mM的HEPES中，调节pH值为7.4，加入10μg的Arg-C，调节pH为7.4，37度消化过夜。使用10kD的滤膜去除Arg-C，将得到的肽段合，并用于后续的固定化标记。将经过10kD的滤膜处理的样品中加入10μl至50ml羟基琥珀酰亚胺酯活性琼脂糖，25度反应1h，然后使用100mM的Tris-Cl终止氨基活性材料上的活性基团，37度反应1小时。2000rcf离心10min，得到还有固定化肽段修饰的材料。将上述得到的含有固定化肽段修饰的材料溶解在20mM的Tris-Cl中，加入氯化钙至终浓度为5mM，加入20μg的Lysarginase，调节pH为7.4，37度消化过夜。离心得到酶切释放的甲基化修饰肽段，使用Q Exactive Orbitrap质谱仪对得到的甲基化修饰肽段进行分析以及使用MaxQuant进行数据解析。
实施例2
以子宫颈癌Hela细胞为样品，使用6M盐酸胍为裂解液进行蛋白质的提取，对提取对蛋白质进行BCA定量，取1mg的蛋白质进行甲基化修饰的分析。加入二硫苏糖醇至终浓度为10mM，56℃变性还原30min后，加入碘乙酰胺至终浓度为30mM，室温避光反应30min，再向反应体系中加二硫苏糖醇至终浓度为30mM，室温孵育30min终止过量的碘乙酰胺。加入10μg的Lys-C，调节pH至7.4，37度酶切4h，然后使用50mM的碳酸氢铵溶液将盐酸胍稀释至0.8M，加入20μg的Trypsin，37℃酶解12h。15000rcf离心20min得到酶切肽段，将离心得到的肽段样品固载到C18反相捕集柱(4.6mm i.d.×1cm)进行除盐，使用0.1％三氟乙酸/80％乙腈进行洗脱、冷冻干燥后。然后将干燥后的肽段溶解在含有5mM的氯化钙、5mM的二硫苏糖醇、2mM的EDTA的20mM的HEPES中，调节pH值为7.4，加入10μg的Arg-C，调节pH为7.4，37度消化过夜。使用10kD的滤膜去除Arg-C，将得到的肽段合，并用于后续的固定化标记。将经过10kD的滤膜处理的样品中加入5mg的HPG-ALD和20mM的氰基硼氰化钠，37度反应过夜，然后使用100mM的Tris-Cl终止氨基活性材料上的活性基团，37度反应1小时。然后使用10kD的滤膜去除多余试剂以及没有被固定的肽段，得到含有固定化肽段修饰的材料。将上述得到的含有固定化肽段修饰的材料溶解在20mM的Tris-Cl中，加入氯化钙至终浓度为5mM，加入20μg的Lysarginase，调节pH为7.4，37度消化过夜。使用10kD的滤膜分离HPG-ALD与酶切下来的甲基化修饰肽段，使用Q Exactive Orbitrap质谱仪对得到的甲基化修饰肽段进行分析。
实施例3
以子宫颈癌Hela细胞为样品，使用6M盐酸胍为裂解液进行蛋白质的提取，对提取的蛋白质进行还原烷基化处理后，加入10μg的Lys-C，调节pH至7.4，37度酶切4h，然后使用50mM的碳酸氢铵溶液将尿素稀释至0.8M，加入40μg的Trypsin，37℃酶解6h。15000rcf离心20min得到酶切肽段，将离心得到的肽段样品固载到C18反相捕集柱(4.6mm i.d.×1cm)进行除盐，使用0.1％三氟乙酸/80％乙腈进行洗脱、冷冻干燥后。然后将干燥后的肽段溶解在含有5mM的氯化钙、5mM的二硫苏糖醇、2mM的EDTA的20mM的HEPES中，调节pH值为7.4，加入10μg的Arg-C，调节pH为7.4，37度消化过夜。使用C18对样本进行除盐并干燥，向样品中5mg的HPG-ALD和20mM的氰基硼氰化钠，37度反应过夜，然后使用100mM的乙醇胺终止氨基活性材料上的活性基团，37度反应1小时。然后使用10kD的滤膜去除多余试剂以及没有被固定的肽段，得到还有固定化肽段修饰的材料。将上述得到的含有固定化肽段修饰的材料溶解在20mM的Tris-Cl中，加入氯化钙至终浓度为5mM，加入20μg的Lysarginase，调节pH为7.4，37度消化过夜。使用10kD的滤膜分离HPG-ALD与酶切下来的甲基化修饰肽段，使用Q ExactiveOrbitrap质谱仪对得到的甲基化修饰肽段进行分析。
实施例4
以子宫颈癌Hela细胞为样品，首先使用13CD3-稳定同位素对细胞进行标记，代谢标记可以提高甲基化修饰鉴定的准确性。使用6M盐酸胍提取蛋白质，然后进行还原烷基化处理，使用Lys-C/Trypsin/Arg-C对蛋白质进行酶切，蛋白水解酶用量为蛋白质质量的1/50，在37℃酶解12h。使用C18反相捕集柱对肽段样品进行除盐并干燥。HPG-ALD用量为蛋白质的5倍，加入还原剂氰基硼氰化钠的终浓度为20mM，37度标记12小时，使用100mM的乙醇胺终止氨基活性材料上的活性基团，37度反应1小时。使用10kD的滤膜去除多余试剂以及没有被固定的肽段。将上述得到的含有固定化肽段修饰的材料溶解在20mM的Tris-Cl中，加入氯化钙至终浓度为5mM，加入20μg的Trypsin-N，调节pH为7.4，37度消化过夜。使用10kD的滤膜分离HPG-ALD与酶切下来的甲基化修饰肽段，使用Q Exactive Orbitrap质谱仪对得到的甲基化修饰肽段进行分析。
实施例5
以子宫颈癌Hela细胞为样品，首先使用13CD3-稳定同位素对细胞进行标记，代谢标记可以提高甲基化修饰鉴定的准确性。使用6M盐酸胍提取蛋白质，然后进行还原烷基化处理，使用Trypsin对蛋白质进行酶切，蛋白水解酶用量为蛋白质质量的1/20，在37℃酶解12h。使用C18反相捕集柱对肽段样品进行除盐并干燥。HPG-ALD用量为蛋白质的5倍，加入还原剂氰基硼氰化钠的终浓度为20mM，37度标记12小时，使用100mM的乙醇胺终止氨基活性材料上的活性基团，37度反应1小时。使用10kD的滤膜去除多余试剂以及没有被固定的肽段。将上述得到的含有固定化肽段修饰的材料溶解在20mM的Tris-Cl中，加入氯化钙至终浓度为5mM，加入20μg的Trypsin-N，调节pH为7.4，37度消化过夜。使用10kD的滤膜分离HPG-ALD与酶切下来的甲基化修饰肽段，使用Q Exactive Orbitrap质谱仪对得到的甲基化修饰肽段进行分析。
实施例6
以子宫颈癌Hela细胞为样品，首先使用13CD3-稳定同位素对细胞进行标记，代谢标记可以提高甲基化修饰鉴定的准确性。使用6M盐酸胍提取蛋白质，然后进行还原烷基化处理，使用Lys-C和Arg-C对蛋白质进行酶切，蛋白水解酶用量为蛋白质质量的1/50，在37℃酶解12h。使用C18反相捕集柱对肽段样品进行除盐并干燥。HPG-ALD用量为蛋白质的5倍，加入还原剂氰基硼氰化钠的终浓度为20mM，37度标记12小时，使用100mM的乙醇胺终止氨基活性材料上的活性基团，37度反应1小时。使用10kD的滤膜去除多余试剂以及没有被固定的肽段。将上述得到的含有固定化肽段修饰的材料溶解在20mM的Tris-Cl中，加入氯化钙至终浓度为5mM，加入20μg的Trypsin-N，调节pH为7.4，37度消化过夜。使用10kD的滤膜分离HPG-ALD与酶切下来的甲基化修饰肽段，使用Q Exactive Orbitrap质谱仪对得到的甲基化修饰肽段进行分析。
实施例7
以人肝癌组织为样品，使用预冷的PBS清洗组织至无明显血色，加入8M尿素后，使用剪刀将组织剪碎，使用超声进行蛋白质的提取。然后对提取的蛋白质进行还原烷基化处理，使用Lys-C/Trypsin/Arg-C多种酶对蛋白质进行酶切，蛋白水解酶用量为蛋白质质量的1/50，在37℃酶解12h。使用C18反相捕集柱对肽段样品进行除盐并干燥。HPG-ALD用量为蛋白质的5倍，加入还原剂氰基硼氰化钠的终浓度为20mM，37度标记12小时，使用100mM的乙醇胺终止氨基活性材料上的活性基团，37度反应1小时。使用10kD的滤膜去除多余试剂以及没有被固定的肽段。将上述得到的含有固定化肽段修饰的材料溶解在20mM的Tris-Cl中，加入氯化钙至终浓度为5mM，加入20μg的Trypsin-N，调节pH为7.4，37度消化过夜。使用10kD的滤膜分离HPG-ALD与酶切下来的甲基化修饰肽段，使用Lumos Fusion Orbitrap质谱仪对得到的甲基化修饰肽段进行分析。
实施例8
以血浆为样品，加入8M尿素使得蛋白质变性，对蛋白质进行还原烷基化处理，使用Lys-C/Trypsin/Arg-C多种酶对蛋白质进行酶切，蛋白水解酶用量为蛋白质质量的1/50，在37℃酶解12h。使用C18反相捕集柱对肽段样品进行除盐并干燥。HPG-ALD用量为蛋白质的5倍，加入还原剂氰基硼氰化钠的终浓度为20mM，37度标记12小时，使用100mM的乙醇胺终止氨基活性材料上的活性基团，37度反应1小时。使用10kD的滤膜去除多余试剂以及没有被固定的肽段。将上述得到的含有固定化肽段修饰的材料溶解在20mM的Tris-Cl中，加入氯化钙至终浓度为5mM，加入20μg的Trypsin-N，调节pH为7.4，37度消化过夜。使用10kD的滤膜分离HPG-ALD与酶切下来的甲基化修饰肽段，使用Lumos Fusion Orbitrap质谱仪对得到的甲基化修饰肽段进行分析。

Claims (10)

1.一种非抗体依赖的蛋白质甲基化修饰富集分析方法，包括：甲基化修饰的样品的Lys-C/Trypsin/Arg-C分别连续酶切；肽段N端氨基的固定；甲基化修饰肽段选择性释放及分离；LC-MS/MS分析及数据解析甲基化修饰位点信息。
2.按照权利要求1的分析方法，其特征在于：连续酶切过程为，采用Lys-C(胞内蛋白酶)、Trypsin(胰蛋白酶)、Arg-C(梭菌蛋白酶)对蛋白质进行连续酶切，通过降低无甲基化修饰赖氨酸和精氨酸的漏切，从而降低无甲基化修饰肽段对甲基化修饰肽段的干扰。
3.按照权利要求1的分析方法，其特征在于：酶切肽段N端氨基的固定过程为，采用氨基活性试剂与肽段N端的α-氨基反应，将肽段固定在固相载体或者高分子材料上。
4.按照权利要求1的分析方法，其特征在于：甲基化修饰肽段选择性的从材料上释放及分离过程为，利用具有酶切甲基化修饰赖氨酸和精氨酸能力的酶对固定的肽段进行酶切，可以实现固定肽段中的甲基化修饰的赖氨酸和精氨酸N端肽键水解，从而将甲基化修饰的肽段从材料上释放，根据材料的特性，利用亲和色谱或者分子筛将甲基化修饰的肽段与材料进行分离，从而实现甲基化修饰肽段的选择性富集。
5.按照权利要求1的分析方法，其特征在于：LC-MS/MS分析及数据解析甲基化修饰位点信息过程为，利用LC对肽段进行分离，利用ESI电离方式对分离的肽段进行离子化，通过高分辨率质谱分析离子化的肽段一级谱和二级谱，并利用搜索软件对质谱数据进行解析，从而鉴定出甲基化修饰肽段的信息。
6.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：利用Lys-C/Trypsin/Arg-C对蛋白质进行酶切，三种蛋白水解酶用量为蛋白质质量的分别为1/5-1/500，在20-50℃酶解2-48h。
7.按照权利要求1或3所述的方法，其特征在于：
1)氨基反应活性材料包括N-羟基琥珀酰亚胺酯活性琼脂糖、溴化氰活性琼脂糖、异氰酸树脂、醛基功能化材料等中的一种或二种以上，调节pH为3-12，20-65度10min至24h；
2)氨基活性材料上多余活性基团的终止：含有自由氨基的试剂都可以作为终止剂使用，可以是氨水、碳酸氢铵、乙醇胺、Tris-Cl等含有自由氨基的试剂中的一种或二种以上，试剂于体系中使用浓度为1mM-1000mM，20-70度反应5min至4h；
3)纯化含有固定肽段的材料：根据材料的性质，可以使用离心、亲和色谱、分子筛等方法中的一种或二种以上去除多余试剂以及没有被固定的肽段，得到还有固定化肽段修饰的材料。
8.按照权利要求1或4所述的方法，其特征在于：
1)目前已有Lysarginase、Trypsin-N等具有酶切甲基化修饰赖氨酸和精氨酸能力，蛋白水解酶用量为蛋白质质量的1/5-1/500，在20-50℃酶解2-48h；
2)利用亲和色谱分离甲基化修饰肽段，包括反相色谱、亲水相互作用色谱，阴离子交换色谱或阳离子交换色谱等中的一种或二种以上；
3)利用分子筛原理分离甲基化修饰肽段，包括使用滤膜、凝胶色谱等中的一种或二种以上。
9.按照权利要求1或5所述的方法，其特征在于：
1)ESI质谱仪为Orbitrap或者TOF为质量分析器的质谱仪；
2)对甲基化进行数据解析的搜索软件可以是基于数据库的软件，或也可以是基于从头测序的软件，目前可用的软件有Mascot、MaxQuant、pFide、SEQUEST，PEAKS等数据处理软件中的一种或二种以上。
10.按照权利要求1所述的方法，其可应用的生物样品包括细胞、组织、体液中的一种或二种以上。
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