CN105693816A - 一种二/三甲基化肽段富集和质谱分析的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属蛋白质分析技术领域,具体为一种二/三甲基化(Kme2/3)修饰肽段富集和质谱分析的方法。本发明方法包括:对蛋白上未修饰(Kme0)或者单甲基化(Kme1)修饰的赖氨酸进行衍生化使其带上生物素标记,再将蛋白酶解成肽段后,再加入亲和素偶联的琼脂糖微球,通过生物素和亲和素之间的高特异和高亲和作用,除去Kme0/1肽段,在上清中保留Kme2/3修饰肽段,最后利用除盐柱捕获上清中的肽段,送入质谱分析质谱分析Kme2/3修饰肽段。本发明方法首次实现对Kme2/3修饰肽段的化学富集,能显著地提高Kme2/3修饰肽段的分析质谱选择性,并且具有特异性强、重现性好、步骤简单、操作方便等特点。
Description
技术领域
本发明属蛋白质分析技术领域,具体涉及一种二/三甲基化修饰肽段富集和质谱分析的方法。
尤其是利用EZ-NHS-biotin与未修饰(Kme0)或者单甲基化修饰(Kme1)的赖氨酸发生特异性反应而不会与二、三甲基化(Kme2/3)修饰的赖氨酸反应的特点使Kme0/1修饰肽段带上生物素基团,通过亲和素偶联的琼脂糖微球去除Kme0/1修饰的赖氨酸肽段,对Kme2/3修饰的赖氨酸肽段的富集并质谱分析的新方法。本发明方法首次实现对Kme2/3修饰肽段的化学富集,能显著地提高Kme2/3修饰肽段的分析质谱选择性,并且具有特异性强、重现性好、步骤简单、操作方便等特点。
背景技术
现有研究公开了蛋白质甲基化是生物体内组普遍存在的一种翻译后修饰,执行着重要的生物学功能。甲基化修饰在各种生命现象中都起着重要的调控作用,精氨酸甲基化主要参与调控RNA合成,DNA损伤修复,蛋白转运以及信号传递等过程,而对赖氨酸甲基化的功能研究相对较少,近期的研究发现非组蛋白赖氨酸甲基化参与转录调控以及信号转导。高灵敏地鉴定生物体内的甲基化后修饰位点是实现其进一步研究的首要前提,然而,它们的研究都面临着类似的困难,首先,甲基化修饰基团非常小,不会像乙酰化或者磷酸化修饰一样改变所修饰氨基酸位点的电子云分布,因此甲基化修饰肽段和非甲基化修饰肽段之间的理化性质差异很小,很难区分。第二,甲基化修饰的蛋白质在体内含量通常较低,蛋白酶解后产生的甲基化肽段占全部肽段的比例更低,甚至不到1%。第三,甲基化存在多种不同状态,如赖氨酸上可以发生一甲基化(Kme1)、二甲基化(Kme2)、三甲基化(Kme3)修饰,精氨酸上包括一甲基化(Rme1)、对称二甲基化(Rme2s)以及非对称二甲基化(Rme2a),导致甲基化修饰肽段的信号分散和减弱,更难以被质谱检测。第四,带有甲基化修饰的肽段在质谱中的离子化效率和质谱响应往往比非修饰肽段低,对质谱的灵敏度要求更高。目前已有的甲基化蛋白研究策略包括肽段或者蛋白芯片,甲基化抗体和化学亲和方法与质谱联合分析,但是这些方法所得到的赖氨酸甲基化蛋白数目和可靠程度都亟待提高,而且对起始样本需求量大,通量也并不是很高。因此,本申请的发明人拟提供一种反应更加特异和更加高效的二三甲基化肽段反向富集方法,该方法将有利于实现高选择性和高灵敏度质谱鉴定,从而进一步促进甲基化蛋白质的研究。
发明内容
本发明的目的在于补充现有甲基化修饰肽段富集方法的不足,为二/三甲基化修饰肽段富集和质谱分析提供一种步骤简单、操作方便、高特异性、高重现性的新方法,实现甲基化肽选择性富集和高灵敏度质谱鉴定。
本发明提供的二/三甲基化修饰肽段富集和质谱分析的方法,利用生物素化试剂(EZ-NHS-biotin)基团能够与未修饰(Kme0)或者单甲基化(Kme1)(记为Kme0/1)修饰的赖氨酸发生特异性反应而不会与二、三甲基化(Kme2/3)修饰的赖氨酸反应的特点,通过亲和素偶联的琼脂糖微球去除Kme0/1修饰的赖氨酸肽段,对Kme2/3修饰的赖氨酸肽段进行富集;具体步骤为:
(1)蛋白生物素化修饰:基于N-羟基琥珀酰亚胺与赖氨酸侧链氨基的高效反应,采用生物素化试剂(EZ-NHS-biotin),通过化学反应将生物素基团引入赖氨酸Kme0/1上,实现蛋白样品中赖氨酸Kme0/1的高效生物素化修饰;
(2)蛋白沉淀:向经步骤(1)生物素化修饰的蛋白样品加入丙酮,过夜,沉淀蛋白,同时去除过量的生物素化试剂;
(3)蛋白酶解:向经步骤(2)处理的蛋白中加入胰蛋白酶,胰蛋白酶和蛋白的质量比1:40-60,充分混合,35-39摄氏度酶切14-16小时,使蛋白完全酶解成氨基酸长度在10-20之间的的肽段;
(4)亲和素去除生物素修饰肽段:用缓冲液(例如:20mMNaH2PO4,0.15MNaCl(PH7.4))稀释肽段至1-1.5ml,用亲和素偶联的琼脂糖微球为吸附剂,利用亲和素和生物素之间的高亲和能力,将生物素化的Kme0/1吸附到亲和素偶联的琼脂糖微球上,亲和吸附过程在2-6摄氏度条件下进行,时间2-4小时,充分去除发生生物素修饰的Kme0/1修饰肽段;
(5)质谱分析:600-1200g(离心机的转速,说明:离心机转数与离心力的换算,r为离心机转轴中心与离心套管底部内壁的距离;rpm(revolutionperminute)为离心机每分钟的转数;RCF(relativeeentrifugalforce)为相对离心力,以地心引力,即重力加速度的倍数来表示,一般用g表示)离心后取上清,通过除盐柱富集上清中的肽段,冻干,然后进行质谱检测。
步骤(1)中,所述蛋白样品可用缓冲液1(如:1-5%SDS,10-30MmHepes,PH=7-8)提取细胞全蛋白得到,蛋白样品浓度为1ug/μL~5ug/μL;所述采用生物素化试剂(EZ-NHS-biotin),通过化学反应将生物素基团引入赖氨酸Kme0/1上,是在蛋白样品中,加入5-30mM的碳酸氢氨,同时加入等体积5-30mM的EZ-NHS-biotin,在35-39摄氏度下避光混合,使样品中的Kme0/1修饰的赖氨酸被充分被生物素化。
步骤(2)中,蛋白沉淀的操作过程为:在向所述蛋白样品中加入5-10倍体积的预冷丙酮,-10-30摄氏度过夜;11000-15000g离心20-40分钟后得到蛋白沉淀,用预冷丙酮洗2-4次,完全去除生物素化试剂。
步骤(3)中,可先用6-10M尿素重溶步骤(2)中得到的蛋白沉淀,用缓冲液2(如15-40mMNH4HCO3)稀释至0.5-2M尿素;然后加入胰蛋白酶,进行酶解。
步骤(4)中,稀释肽段的缓冲液可为15-40mMNH4HCO3 。琼脂糖微球材料与所富集肽段的体积质量比为50-200ul/1mg。
步骤(4)中,先对亲和素偶联的琼脂糖微球用缓冲液进行清洗,重复2-3次,缓冲液可为:15-40mMNaH2PO4,0.1-0.2MNaCl(PH7.4)。
步骤(5)中,操作过程为:合并步骤(4)中所得到的上清和清洗液;然后除盐、冻干;再重溶于0.05-0.2(优选0.1%)FA中;最后进行LC-MS/MS分析。
本发明的一个实施例中,所述步骤(1)中的蛋白样品浓度为1ug/μL~5ug/μL,溶于2%SDS,20mMHepes(PH=7.4)的缓冲液1中;蛋白样品被5mM的EZ-NHS-Biotin,5mM的碳酸氢铵中避光反应30min,加入终浓度碳酸氢铵至终浓度为20mM混合2分钟以终止反应。
本发明的一个实施例中,所述的步骤(3)中用8M尿素重溶蛋白至完全溶解,可适当超声,用25mMNH4HCO3作为缓冲液2对蛋白样品进行稀释,至尿素终浓度为1M以下,按1mg蛋白中加入20ug胰蛋白酶的比例进行酶解,并保持37摄氏度酶解14-16小时。
本发明的一个实施例中,所述步骤(4)中的亲和素偶联的琼脂糖微球购于天地人和生物科技有限公司;其中加入的琼脂糖微球材料与所富集肽段的体积质量比为100ul/1mg;生物素和亲和素的结合温度是4摄氏度,结合时间是2-4小时。
本发明的一个实施例中,所述的步骤(4)中,用20mMNaH2PO4,0.15MNaCl(PH7.4)作为缓冲液3,每次用400ul缓冲液3对亲和素偶联的琼脂糖微球进行清洗,重复2次;每次清洗后1000g离心将固相微球和溶液分开,收集琼脂糖微球;
本发明采用亲和素偶联的琼脂糖微球为吸附剂,利用亲和素和生物素化修饰后的肽段上的生物素之间的亲和作用,经离心将生物素化修饰的肽段去除,最终实现二、三甲基化修饰肽段富集和质谱分析。本发明首次实现对Kme2/3修饰肽段的化学富集,能显著地提高Kme2/3修饰肽段的分析质谱选择性,并且具有特异性强、重现性好、步骤简单、操作方便等特点。
附图说明
图1为本富集并质谱鉴定方法的流程图。
图2为0.05mM标准肽段FQLTDIPAAPR,ALSNSTPQNSFSEK的MALDI-TOF-MS谱图,MALDI-TOF-MS谱图纵坐标为质谱峰的相对强度(%Intensity),横坐标为质荷比(m/z);(a/d)未反应肽段,(b/e)10mMEZ-Biotin,PBS(PH7.4),室温30min反应后的肽段,(c/f)10mMEZ-Biotin,10mMNH4CO3,2%SDS,20mMHepes(PH7.4)37℃30min反应后的肽段。*为肽段底物的单电荷峰,#为生物素修饰后的肽段;对比图(a/d)、图(b/e)和图(c/f)可以看出,图(c/f)中的生物素化效率达到95%以上,能够实现肽段的高效生物素化。
图3为摩尔比为1:50的生物素修饰肽段(模拟生物素化反应后体内Kme0和Kme1肽段,40pM)和未生物素修饰肽段(模拟生物素化反应后体内Kme2和Kme3肽段,2nM)混合物的MALDI-TOF-MS谱图,MALDI-TOF-MS谱图纵坐标为质谱峰的相对强度(100%Intensity),横坐标为质荷比(m/z);(A)是未富集的;(B)是经10ul亲和素琼脂糖微球富集后得到的;(C)是经15ul亲和素琼脂糖微球富集后得到的;*为未生物素修饰肽段,#为生物素修饰肽段;对比图(A)、图(B)和图(C)可以看出,15ul亲和素琼脂糖微球能够完全结合40pM的生物素分子,经过富集后,生物素修饰肽段可以被选择性除去,进而非生物素修饰肽段实现高灵敏质谱鉴定。
图4为500ugHela全蛋白中富集得到的二三甲基化修饰的肽段和蛋白数目,以及二三甲基化蛋白之间的交盖图。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明提出的一种基于生物素修饰的甲基化肽段富集并质谱分析方法的进一步说明。
实施例1,EZ-biotin试剂对肽段N端和赖氨酸侧链氨基的反应效率的实验
将5mM的标准肽段(FQLTDIPAAPR,ALSNSTPQNSFSEK)母液用2%SDS,20mMHepes(PH7.4),10mMNH4HCO3或者用PBS溶液按照1:100稀释成0.05mM;用2%SDS,20mMHepes(PH7.4)与乙腈按照1:1的比例配制10mMEZ-biotin,注意避光保存。取10ul0.05mM肽段与等体积的10mMEZ-biotin混合,37摄氏度孵育30min后立即取出置于冰上,取上清液0.8μL点样于MALDI靶板上,待干燥后再点样等体积的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液,干燥结晶后进行MALDI-TOF-MS分析,结果如图2所示。
实施例2,亲和素琼脂糖微球对生物素修饰肽段富集能力的实验
用20mMNaH2PO4,0.15MNaCl(PH7.4)的缓冲液按照摩尔比为1:50配制合成的标准生物素修饰肽段(模拟生物素化反应后体内Kme0和Kme1肽段,总量40pM)和未生物素修饰肽段混合物(模拟生物素化反应后体内Kme2和Kme3肽段,总量2nM),以下简称混合肽段;在200ul枪头底部填上3MC18材料作为筛板,从枪头顶部分别填入5ul,10ul以及15ul的亲和素琼脂糖微球,300g离心1min,加入100ul20mMNaH2PO4,0.15MNaCl(PH7.4)的缓冲液平衡,重复两次,分别向含有填料的枪头中加入混合肽段,300g离心1min,取流出液反复结合三次,再加入100ul的20mMNaH2PO4,0.15MNaCl(PH7.4)的缓冲液洗涤一次,收集所有的流出液以及洗涤液,合并除盐、冻干,取上清液0.8μL点样于MALDI靶板上,待干燥后再点样等体积的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液,干燥结晶后进行MALDI-TOF-MS分析,结果如图3所示。
实施例3,基于生物素修饰的二三甲基化肽段亲和富集效果的实验
取500ugHela细胞全蛋白,加入2%SDS,20mMHepes(PH7.4),10mMNH4HCO3配制2ug/ul的蛋白溶液,加入等体积用2%SDS,20mMHepes(PH7.4)与乙腈按照1:1的比例配制10mMEZ-biotin,注意避光保存。37摄氏度孵育30min后加入10ul1MDTT(二硫苏糖醇,溶于25mMNH4HCO3),56℃条件下反应30min;加入40ul的500mMIAA(碘乙酰胺,溶于25mMNH4HCO3,现配现用),室温避光20分钟,向上述反应后的蛋白溶液中加入5倍体积预冷的丙酮溶液,-20℃静置过夜后14000rpm,4℃离心30分钟,加入丙酮洗涤3次,以彻底去除未完全反应的EZ-biotin试剂,最后一次吸除丙酮后,将EP管倒扣于通风橱中,使丙酮挥发完全。向所得蛋白粉末中加入8M尿素,重悬沉淀,如有沉淀,可用枪头轻轻吹打至完全溶解。向蛋白浓缩液中加入适量25mMNH4HCO3稀释至尿素终浓度低于1M,按胰蛋白酶和蛋白的质量比为1:50加入胰蛋白酶,同时加入10%ACN,37摄氏度酶解14h后补加适量胰蛋白酶,2h后加入TFA酸化终止反应,除盐冻干后将生物素反应后的肽段重溶于100ul20mMNaH2PO4,0.15MNaCl(PH7.4)的缓冲液,向已经平衡好的StreptavidinBeads6FF层析柱(填料按2nmolofD-biotin/15ul的载量填充)中缓慢加入肽段样品,在重力作用下平衡,非生物素肽段缓慢流出,用ddH2O洗涤一次,合并洗涤液和流出液,除盐、冻干,然后进行LC-MS质谱分析。
Claims (7)
1.一种二/三甲基化肽段富集和质谱分析的方法,其特征在于,利用生物素化试剂(EZ-NHS-biotin)基团能够与未修饰(Kme0)或者单甲基化(Kme1)(记为Kme0/1)修饰的赖氨酸发生特异性反应而不会与二、三甲基化(Kme2/3)修饰的赖氨酸反应的特点,通过亲和素偶联的琼脂糖微球去除Kme0/1修饰的赖氨酸肽段,对Kme2/3修饰的赖氨酸肽段进行富集;具体步骤为:
(1)蛋白生物素化修饰:基于N-羟基琥珀酰亚胺与赖氨酸侧链氨基的高效反应,采用生物素化试剂(EZ-NHS-biotin),通过化学反应将生物素基团引入赖氨酸Kme0/1上,实现蛋白样品中赖氨酸Kme0/1的高效生物素化修饰;
(2)蛋白沉淀:向经步骤(1)生物素化修饰的蛋白样品加入丙酮,过夜,沉淀蛋白,同时去除过量的生物素化试剂;
(3)蛋白酶解:向经步骤(2)处理的蛋白中加入胰蛋白酶,胰蛋白酶和蛋白的质量比1:40-60,充分混合,35-39摄氏度酶切14-16小时,使蛋白完全酶解成氨基酸长度在10-20之间的的肽段;
(4)亲和素去除生物素修饰肽段:用缓冲液稀释肽段至1-1.5ml,用亲和素偶联的琼脂糖微球为吸附剂,利用亲和素和生物素之间的高亲和能力,将生物素化的Kme0/1吸附到亲和素偶联的琼脂糖微球上,亲和吸附过程在2-6摄氏度条件下进行,时间2-4小时,充分去除发生生物素修饰的Kme0/1修饰肽段;
(5)质谱分析:600-1200g离心后取上清,通过除盐柱富集上清中的肽段,冻干,然后进行质谱检测。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中所述蛋白样品用缓冲液提取细胞全蛋白得到,蛋白样品浓度为1ug/μL~5ug/μL;所述采用生物素化试剂(EZ-NHS-biotin),通过化学反应将生物素基团引入赖氨酸Kme0/1上,是在蛋白样品中,加入5-30mM的碳酸氢氨,同时加入等体积5-30mM的EZ-NHS-biotin,在35-39摄氏度下避光混合,使样品中的Kme0/1修饰的赖氨酸被充分被生物素化。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中蛋白沉淀的操作过程为:在向所述蛋白样品中加入5-10倍体积的预冷丙酮,-10-30摄氏度过夜;11000-15000g离心20-40分钟后得到蛋白沉淀,用预冷丙酮洗2-4次,完全去除生物素化试剂。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)中,先用6-10M尿素重溶步骤(2)中得到的蛋白沉淀用缓冲液稀释至0.5-2M尿素;然后加入胰蛋白酶,进行酶解。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(4)中,琼脂糖微球材料与所富集肽段的体积质量比为50-200ul/1mg。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(4)中,先对亲和素偶联的琼脂糖微球用缓冲液进行清洗,重复2-3次。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(5)的操作过程为:合并步骤(4)中所得到的上清和清洗液;然后除盐、冻干;再重溶于0.05-0.2%FA中;最后进行LC-MS/MS分析。
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