CN114075588A - 一种高特异性的细胞分泌蛋白富集方法 - Google Patents
一种高特异性的细胞分泌蛋白富集方法 Download PDFInfo
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Abstract
分泌蛋白组学的研究在疾病的早期诊断,以及疾病的治疗方面都有着广泛的应用。传统分泌蛋白富集方法多采用无血清培养,但这一培养方式存在种种弊端。本发明提供了一种二步法肽段层面富集的蛋白富集流程,极大的提高了该方法的特异性。同时,本发明引入了一种可以替代甲硫氨酸的非自然氨基酸——叠氮基代丙氨酸(Azidohomoalanine,AHA)来对细胞自身合成的蛋白进行标记。再结合近年来广泛应用的点击化学反应,可以高效地将修饰了炔基的生物素(biotin)加到AHA的插入位点。借助生物素这一标记,便能够实现对含血清的培养基中分泌蛋白的分离纯化及鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质组学领域,具体涉及一种细胞分泌蛋白组(secretome)富集的方法。
背景技术
分泌蛋白组学分析的主要是细胞分泌到培养液中的蛋白质,其研究在疾病的早期诊断,以及疾病的治疗方面都有着广泛的应用。
常规的细胞培养基中含有10%血清蛋白(FBS),其含量远远高于细胞自身分泌的蛋白,若用普通培养基收集分泌蛋白,在质谱检测时,FBS的信号会极大的干扰目标的分泌蛋白信号,使得一些低含量的蛋白信号被当做噪音去除掉,从而降低能够检测到的蛋白丰度。
为了避免培养液中血清蛋白的影响,目前多采用的方法是饥饿培养法,即细胞在普通培养基中长至密度为80-90%左右时,换用无血清体系进行培养,然后对上清液中的蛋白质进行质谱检测。但是,饥饿培养法会对细胞的状态产生影响,导致细胞死亡,死亡的细胞会将细胞内的蛋白释放到培养基中,因而会进一步对细胞的分泌蛋白组产生影响。
因此,为了避免饥饿培养法对细胞的种种不利影响,本领域迫切需要开发一种高特异性地针对细胞分泌蛋白的富集方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高特异性地针对细胞分泌蛋白的富集方法。
在本发明的第一方面,提供了一种特异性地富集细胞分泌蛋白的方法,包括步骤:
(I)提供一细胞培养体系,其中培养体系中的分泌蛋白S被第一标签T1特异性地标记,即所述细胞培养体系中含有复合物T1-S;
(II)提供一可通过点击化学反应与第一标签特异性连接的第二标签T2,并使其与复合物T1-S发生点击化学反应,从而形成T2-T1-S复合物;
(III)提供一结合于固相载体Z0的第三标签T3,所述第三标签T3能够与第二标签T2特异性地结合;
(IV)第一富集步骤,包括子步骤:
(IVa)使步骤(III)中的结合于固相载体的第三标签与步骤(II)中的T2-T1-S复合物共孵育,从而使标记有第一标签的分泌蛋白间接结合到固相载体上,从而形成复合物Z0-T3-T2-T1-S;和
(IVb)用洗涤缓冲液洗去未形成复合物Z0-T3-T2-T1-S的非特异性蛋白;
(V)洗脱和消化步骤,包括子步骤:
(Va)将间接结合到固相载体上的分泌蛋白进行酸性洗脱,得到复合物T2-T1-S’;和
(Vb)用胰酶对含有复合物T2-T1-S’的溶液进行消化反应,从而获得复合物T2-T1-P,其中P是酸性洗脱后所得到的细胞分泌蛋白经胰酶进行消化后所获得的肽段;和
(VI)第二富集步骤,包括步骤:
(VIa)将步骤(V)中所获得的复合物T2-T1-P与结合于固相载体Z0的第三标签T3进行第二次孵育,从而形成复合物Z0-T3-T2-T1-P;
(Vb)用洗涤缓冲液洗去未形成复合物Z0-T3-T2-T1-P的特异性肽段;和
(Vc)洗脱目标肽段,从而得到特异性富集的细胞分泌蛋白肽段样品。
在另一优选例中,使用所述方法富集获得的细胞分泌蛋白样品中,分泌蛋白占总蛋白的85%以上(以重量分数计)。
在另一优选例中,所述细胞是原代培养细胞。
在另一优选例中,所述细胞可以来源于肿瘤细胞系。
在另一优选例中,所述细胞可以来源于小鼠、大鼠、非人灵长类或人。
在另一优选例中,所述细胞可以来源于下组的原代培养细胞:星形胶质细胞、小胶质细胞、胶质瘤细胞、成纤维细胞。
在另一优选例中,所述细胞是原代星形胶质细胞或成纤维细胞,优选地为原代星形胶质细胞。
在另一优选例中,所述细胞可以来源于胚胎干细胞(ESC)和诱导多潜能干细胞(iPSC)诱导分化得到的星形胶质细胞、小胶质细胞。
在另一优选例中,所述第一标签T1是AHA,所述第二标签T2是生物素,并且所述第三标签T3是链霉亲和素。
在另一优选例中,所述步骤(I)包括以下的的子步骤:
(Ia)提供一细胞培养体系,所述细胞培养体系中的细胞的汇合率为70-95%(较佳地为80-92%,更佳地为80-90%),并且其中所用培养基是第一培养基;
(Ib)将步骤(I)中的细胞培养体系中的第一培养基更换为第二培养基,并进行培养,所述第二培养基中,不含有Met并且含有AHA(azidohomoalanine,叠氮基代丙氨酸)。
在另一优选例中,所述步骤(II)还包括以下的子步骤:
(IIa)任选地对步骤(Ib)的培养所得培养液进行浓缩;
(IIb)对步骤(Ib)的培养所得培养物或步骤(IIa)的浓缩所得的培养液进行化学点击(click)反应,其中从而获得被第二标签T2特异性地标记的细胞分泌蛋白S,即复合物T2-T1-S。
在另一优选例中,所述第一培养基中含有:DMEM 1.0、青/链霉素(Pen/Strep)、FBS血清,或其组合。
在另一优选例中,所述每500ml第一培养基由以下成分组成:450ml的DMEM1.0、5ml的Pen/Strep(100×),和50ml的FBS。
在另一优选例中,所述第二培养基中含有AHA、FBS、Met去除培养基(depletion培养基),其中FBS的浓度范围为0.3-2v/v%,较佳地为0.4-1.5v/v%,更佳地为0.5-1v/v%。
在另一优选例中,所述Met去除培养基中含有:DMEM 2.0、P/S、GlutaMax、丙酮酸钠、胱氨酸,或其组合。
在另一优选例中,并且所述Met去除培养基中的DMEM 2.0中不含有谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酰。
在另一优选例中,所述每500ml Met去除培养基由以下成分组成:484.5ml的DMEM2.0、5ml的Pen/Strep(100×)、5ml的GlutaMax(100×)、5ml的丙酮酸钠(100×),和500μl的胱氨酸(1000×)。
在另一优选例中,所述第二培养基中各组成成分的体积比为:Met去除培养基:AHA(100mM):FBS=10ml:5μl:50μl。
在另一优选例中,在步骤(IIa)中,所述的浓缩包括将体积浓缩至1/25,较佳地1/40,更佳地1/50。
在另一优选例中,所述化学点击(click)反应的反应体系包括:三唑配体(Triazole ligand)、生物素-四聚乙二醇-炔烃(Biotin-PEG4-Alkyne)、溴化亚铜(CuBr)。
在另一优选例中,所述化学点击(click)反应的反应体系中,各组分的比例为:浓缩培养基:三唑配体(200mM):生物素-四聚乙二醇-炔烃(25mM):溴化亚铜(10mg/mL)=1ml:2μl:4μl:20μl。
在另一优选例中,在步骤(III)中,所述固相载体Z0的材质选自下组:金属、玻璃、胶体、塑料,或其组合。
在另一优选例中,在步骤(III)中,所述的固相载体材质Z0包括:均聚物、共聚物,或其组合。
在另一优选例中,在步骤(III)中,所述的固相载体Z0的材质选自下组:聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯,或其组合。
在另一优选例中,在步骤(III)中,所述的固相载体Z0是琼脂糖树脂。
在另一优选例中,在步骤(IV)中,所述未形成复合物Z0-T3-T2-T1-S的蛋白为培养基中的非特异性蛋白,如血清蛋白。
在另一优选例中,在步骤(IV)中,所需时间为12-24小时,较佳地为16-20小时,更佳地为18小时。
在另一优选例中,在步骤(IVa)中,所述的孵育时间为10-20小时,较佳地为14-16小时,更佳地为12小时。
在另一优选例中,在步骤(IVb)中,所述的洗涤包括两步洗涤,并且所述洗涤缓冲液包括用于第一步洗涤的第一洗涤缓冲液和用于第二步洗涤的第二洗涤缓冲液;其中,所述第一洗涤缓冲液为PBSN(PBS和1%NP-40);所述第二洗涤缓冲液为20%已腈。
在另一优选例中,所述酸性洗脱所用的酸性洗脱液中含有:1-5%的三氟乙酸(TFA)、50%已腈。
在另一优选例中,所述酸性洗脱的洗脱条件为25-55℃,800-1200rpm震荡。
在另一优选例中,所述酸性洗脱的时间为5-20分钟,较佳地8-15分钟,最佳地10分钟。
在另一优选例中,所述消化反应的反应体系中包括:CaCl2、胰酶。
在另一优选例中,所述消化反应的反应体系中,CaCl2的浓度为0.5-2mM(较佳地0.8-1.5mM,更佳地1mM),并且胰酶的浓度为1ug胰酶/100ug蛋白。
在另一优选例中,所述消化反应的反应温度为37℃。
在另一优选例中,所述消化反应的反应时间为12-20h,较佳地为14-18h,更佳地为16h。
在另一优选例中,在步骤(VI)中的反应在填料柱中进行,优选地,所述填料柱是C8填料柱。
在另一优选例中,在步骤(VIa)中,所述形成的复合物Z0-T3-T2-T1-P结合于C8填料柱。
在另一优选例中,所述步骤(VIc)重复两次或三次。
在另一优选例中,所述步骤(VIc)中用于洗脱的洗脱液的成分与步骤(Va)中用于酸性洗脱的酸性洗脱液相同。
在另一优选例中,所述方法还包括步骤:
(VII)对所获得的细胞分泌蛋白样品进行鉴定。
在另一优选例中,所述的鉴定包括:组成成分的分析、生物学功能的分析。
在另一优选例中,所述生物学功能的分析包括:分泌蛋白细胞亚定位及组织分布分析、细胞通路富集分析、对细胞功能的表征、细胞-细胞间相互作用研究、疾病机理研究、肿瘤标志物筛选、疾病早期检测标记物筛选、药物开发及检测等。
在另一优选例中,所述疾病包括肿瘤、免疫性疾病、内分泌疾病、炎症、神经退行性疾病等。
在另一优选例中,所述鉴定的方法包括:质谱检测法、蛋白质免疫印迹检测法、酶联免疫吸附测定法,或其组合。
在本发明的第二方面,提供了一种试剂盒,所述试剂盒用于特异性地富集细胞分泌蛋白,包括:
(i)第一容器,所述第一容器中包括细胞培养物标记系统,所述细胞培养物标记系统用于形成如本发明第一方面所述方法中步骤(I)中的复合物T2-T1-S;
(ii)第二容器,所述第二容器中包括如本发明第一方面所述方法中步骤(II)的结合于固相载体Z0的第二标签T3;
(iii)第三容器,所述第三容器用于如本发明第一方面所述方法中步骤(III)所述的第一富集步骤的反应,以及如本发明第一方面所述方法中步骤(IVa)所述的洗脱;
(iv)第四容器,所述第四容器用于如本发明第一方面所述方法中步骤(IVb)所述的消化反应;
(v)第五容器,所述第五容器用于如本发明第一方面所述方法中步骤(V)所述的第二富集步骤的反应。
(vi)任选的第六容器,所述第六容器中包括洗涤缓冲液;
(vii)任选的第七容器,所述第七容器中包括酸性洗脱液。
在另一优选例中,所述的第一容器、第二容器、第三容器、第四容器、第五容器可以是相同或不同的容器。
在另一优选例中,所述的第二容器和第三容器是相同或不同的容器。
在本发明的第三方面,提供了如本发明第二方面所述的试剂盒的用途,用于对细胞进行组成成分的分析或对细胞或分泌蛋白的生物学功能的分析。
在另一优选例中,所述生物学功能的分析包括:分泌蛋白细胞亚定位及组织分布分析、细胞通路富集分析、对细胞功能的表征、细胞-细胞间相互作用研究、疾病机理研究、肿瘤标志物筛选、疾病早期检测标记物筛选、药物开发及检测等。
在另一优选例中,所述疾病包括肿瘤、免疫性疾病、内分泌疾病、炎症、神经退行性疾病等。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1描述了本方法对细胞分泌蛋白进行富集的实验操作流程。
其中,先令细胞在普通培养基中生长至80-90%汇合率,再换用AHA替代的培养基对细胞进行培养。经过点击化学反应,可以高效地在蛋白的AHA修饰位点上加上生物素(biotin)标签。此时,利用亲和素琼脂糖树脂(avidin resin)进行第一步蛋白层面富集,将大部分修饰了生物素的分泌蛋白富集出来,并剔除血清蛋白。接下来将这部分特异性结合的分泌蛋白洗脱下来,消化为肽段,再进行第二步肽段层面富集,剔除大部分非特异肽段。最后将与亲和素琼脂糖树脂特异性结合的生物素修饰肽段洗脱下来,进行质谱检测,便可以实现在含血清的条件下对细胞分泌蛋白的高特异性的富集和检测。
图2显示低血清培养浓度摸索验证结果。
其中,A)显示了令细胞在相同的起始密度下,经0.5%、1%、2%、3%、5%以及10%血清(FBS)培养24小时后对细胞进行拍照的结果;结果显示各血清浓度培养条件下的细胞密度没有显著差异。B)显示了对各血清浓度培养24小时后的细胞活性进行测定的结果;结果显示该培养条件下细胞活性没有显著改变。C)显示了对各血清浓度培养24小时后的细胞内的蛋白浓度进行测定的结果;结果显示该培养条件下细胞内的蛋白浓度也没有显著降低。
图3显示了AHA插入验证及点击化学反应特异性验证结果。
其中,只有AHA组的细胞裂解液,经过点击化学反应后,才能显出生物素条带。而Met组的细胞裂解液与未进行点击化学反应的细胞裂解液都没有条带。
图4显示了富集得到的分泌蛋白组细胞亚定位分析与组织分布分析结果。
其中,A)显示了分泌蛋白组细胞亚定位分析的结果。在Uniprot中,注释为secreted(分泌型的)、extracellular space(细胞外的)和cell membrane(细胞膜的)的蛋白都视作分泌蛋白。统计结果表明,87.7%(257种)的蛋白被标注为分泌蛋白。B)显示了利用DAVID数据库对这些蛋白的细胞组分分布的分析结果。结果显示富集最显著的前10条注释都定位在细胞外。C)显示了利用DAVID数据库对这些蛋白的组织分布的分析结果。结果显示这些蛋白同样在大脑中存在富集(n=143)。
图5显示了富集所得分泌蛋白所参与的功能注释分析结果。
利用DAVID数据库对我们富集得到的分泌蛋白所参与的生物学过程进行分析,并筛选了一部分显著富集(p值<0.05)的生物学过程进行展示。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,经过大量的筛选,首次开发了一种基于AHA标记-点击化学反应的二步法肽段层面的分泌蛋白富集方法。结果表明,使用本发明的方法,在质谱分析时以AHA和生物素标记对检测到的肽段进行区分,避免了非特异肽段对数据组的干扰。并且,本发明的方法经过两次富集,特异性较高,获得的分泌蛋白样品中,分泌蛋白占所检测到的总蛋白的85%(以质量分数计)以上,显著高于无血清培养方法检测到的分泌蛋白占比(通常低于50%)。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另外定义,否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用,在提到具体列举的数值中使用时,术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1%。例如,如本文所用,表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如,99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用,术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之,所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文所用,术语“免疫共沉淀”指代通过生物素(biotin)和亲和素(avidin)间的强相互作用,通过亲和素标记的琼脂糖树脂将生物素标记蛋白以及生物素标记肽段分离纯化出来的实验步骤。
本发明的富集方法
在本发明中,提供了一种二步法的蛋白富集流程,包括蛋白层面和肽段层面的富集,极大的提高了富集对于细胞分泌蛋白的特异性。
具体地,本发明提供了一种能够特异性地富集细胞分泌蛋白的方法,包括步骤:
(I)提供一细胞培养体系,其中培养体系中的分泌蛋白S被第一标签T1特异性地标记,即所述细胞培养体系中含有复合物T1-S;
(II)提供一可通过点击化学反应与第一标签特异性连接的第二标签T2,并使其与复合物T1-S发生点击化学反应,从而形成T2-T1-S复合物;
(III)提供一结合于固相载体Z0的第三标签T3,所述第三标签T3能够与第二标签T2特异性地结合;
(IV)第一富集步骤,包括子步骤:
(IVa)使步骤(III)中的结合于固相载体的第三标签与步骤(II)中的T2-T1-S复合物共孵育,从而使标记有第一标签的分泌蛋白间接结合到固相载体上,从而形成复合物Z0-T3-T2-T1-S;和
(IVb)用洗涤缓冲液洗去未形成复合物Z0-T3-T2-T1-S的非特异性蛋白;
(V)洗脱和消化步骤,包括子步骤:
(Va)将间接结合到固相载体上的分泌蛋白进行酸性洗脱,得到复合物T2-T1-S’;和
(Vb)用胰酶对含有复合物T2-T1-S’的溶液进行消化反应,从而获得复合物T2-T1-P,其中P是酸性洗脱后所得到的细胞分泌蛋白经胰酶进行消化后所获得的肽段;和
(VI)第二富集步骤,包括步骤:
(VIa)将步骤(V)中所获得的复合物T2-T1-P与结合于固相载体Z0的第三标签T3进行第二次孵育,从而形成复合物Z0-T3-T2-T1-P;
(Vb)用洗涤缓冲液洗去未形成复合物Z0-T3-T2-T1-P的特异性肽段;和
(Vc)洗脱目标肽段,从而得到特异性富集的细胞分泌蛋白肽段样品。
如本文所用,术语“Click反应”(又称作“点击化学反应”)指代由铜离子催化的叠氮(azide)-炔基(alkyne)间发生的Husigen环加成反应(Copper-Catalyzed Azide–AlkyneCycloaddition)。
在一个优选的实施方式中,该方法的所述第二培养基中含有AHA、FBS、Met去除培养基(depletion培养基),其中FBS的浓度范围为0.3-2v/v%,较佳地为0.4-1.5v/v%,更佳地为0.5-1v/v%。
在一个优选的实施方式中,本发明方法引入了一种可以替代甲硫氨酸(Met)的非自然氨基酸Azidohomoalanine(AHA)来对细胞自身合成的蛋白进行标记。AHA在分子量和结构上都与Met十分接近,因此可以被Met的tRNA识别,在蛋白质合成过程中可被Met的tRNA带到蛋白质上的Met位点。并且,结合点击化学反应(click反应),可以高效地将修饰了生物素(biotin)的炔烃加到AHA的插入位点。借助生物素这一标记,便能够实现对含血清的培养基中分泌蛋白的分离纯化及鉴定。
在一个优选的实施方式中,在本发明的方法中,先令细胞在普通培养基中长至80-90%密度,而后换用Met被AHA替换了的培养基进行培养,以对细胞新合成的蛋白进行AHA标记。24小时后收集上清液进行浓缩,并进行点击化学反应,此时细胞自身合成的分泌蛋白都被带上了生物素的标记。接下来,针对生物素这一标记,利用生物素和亲和素(avidin)间的强互相作用,用亲和素标记的琼脂糖树脂对生物素标记蛋白进行第一步蛋白质层面和第二步肽段层面的富集,便可以高特异性的将细胞自身合成并分泌到培养基中的分泌蛋白富集出来,并进行后续的质谱检测。通过多组实验的验证,此方法在获得的分泌蛋白组中分泌蛋白占比均大于80%,细胞组分的富集分析也表明此方法所得蛋白基本定位在细胞外。
在一个优选的实施方式中,本发明提供一种诱导星型胶质细胞(inducedastrocyte)分泌蛋白组(secretome)富集的方法,其包括:待细胞在普通培养基中长至80-90%密度,换用Met被AHA替换了的含0.5%FBS的培养基进行培养,24小时后收集上清液进行浓缩,并进行点击化学反应,此时细胞自身合成的分泌蛋白都被带上了生物素的标记。针对生物素这一标记进行第一步蛋白质层面和第二步肽段层面的富集,便可以高特异性的将标记了生物素的分泌蛋白富集出来,并进行后续的质谱检测。
本发明的方法可用于对细胞进行组成成分的分析或对细胞或分泌蛋白的生物学功能的分析。
优选地,所述的生物学功能的分析包括:分泌蛋白细胞亚定位及组织分布分析、细胞通路富集分析、对细胞功能的表征、细胞-细胞间相互作用研究、疾病机理研究、肿瘤标志物筛选、疾病早期检测标记物筛选、药物开发及检测等。
优选地,所述疾病包括肿瘤、免疫性疾病、内分泌疾病、炎症、神经退行性疾病等。
本发明的方法能够适用的细胞种类包括,但不限于:各种类型的永生化哺乳动物细胞系(如各种肿瘤细胞系),多种类型的哺乳动物原代培养细胞(如星型胶质细胞,成纤维细胞等)。使用本发明的方法富集得到的分泌蛋白组预期可用于多种用途,其包括,但不限于:细胞-细胞间相互作用研究、疾病机理研究、疾病早期生物标志物筛选,以及药物开发及检测等。
试剂盒
在本发明的另一方面,提供了一种试剂盒,所述试剂盒用于特异性地富集细胞分泌蛋白,包括:
(i)第一容器,所述第一容器中包括细胞培养物标记系统,所述细胞培养物标记系统用于形成如本发明所述方法中步骤(I)中的复合物T2-T1-S;
(ii)第二容器,所述第二容器中包括如本发明所述方法中步骤(II)的结合于固相载体Z0的第二标签T3;
(iii)第三容器,所述第三容器用于如本发明所述方法中步骤(III)所述的第一富集步骤的反应,以及如本发明所述方法中步骤(IVa)所述的洗脱;
(iv)第四容器,所述第四容器用于如本发明所述方法中步骤(IVb)所述的消化反应;
(v)第五容器,所述第五容器用于如本发明所述方法中步骤(V)所述的第二富集步骤的反应。
(vi)任选的第六容器,所述第六容器中包括洗涤缓冲液;
(vii)任选的第七容器,所述第七容器中包括酸性洗脱液。
在本发明的试剂盒中,所述的第一容器、第二容器、第三容器、第四容器、第五容器可以是相同或不同的容器。并且本发明试剂盒所述的第二容器和第三容器可以是相同或不同的容器。
本发明的主要优点包括:
1)使用本发明的方法,避免了传统无血清培养对细胞的种种不利影响。
2)使用本发明的方法,在质谱分析时以AHA和生物素标记对检测到的肽段进行区分,避免了非特异肽段对数据组的干扰。
3)本发明的方法经过两次富集,特异性较高,获得的分泌蛋白样品中,分泌蛋白占所检测到的总蛋白的85%(以质量分数计)以上,显著高于无血清培养方法检测到的分泌蛋白占比(通常低于50%)。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1:低血清培养浓度摸索
由于培养基中高浓度的血清蛋白会对点击化学反应效率产生影响,因此本发明首先对细胞培养时的细胞所能耐受的最低血清浓度进行了摸索。在本实施例中,一共设置了0.5%、1%、2%、3和5%这5个血清浓度组进行摸索。
首先让细胞在普通培养基(含10%FBS)中生长至70-80%密度,然后换含以上各浓度血清的培养基对细胞进行24小时的培养。24小时后用明场显微镜对细胞进行照相。
结果显示,在24小时的培养时间内,各血清浓度下细胞的生长速率没有显著差异,24小时后的细胞密度基本一致(图2A)。
接下来,利用发光法细胞活力检测试剂盒(购自碧云天公司)对各组的细胞活性进行了检测。
结果表明,以上各血清浓度培养24小时,对细胞的活性并没有显著影响(图2B)。
与此同时,还收集了培养24小时后各组的细胞裂解液,用蛋白浓度测定试剂盒(购自Thermo Fisher公司)对裂解液中的蛋白浓度进行测定。结果表明各组细胞的蛋白浓度间也没有显著差异。
通过以上摸索,本发明人最终确定,在进行AHA标记时,0.5%FBS为最优的培养血清浓度,来进行分泌蛋白的收集。
实施例2:AHA标记及样品收集
本发明使用了一株健康人胚胎干细胞(hESC)——H1(购自Wicell公司)分化得到的诱导星型胶质细胞(induced astrocytes)来进行分泌蛋白的富集,该细胞系来源及背景清晰,并通过星形胶质细胞特异性蛋白表达检测和支原体检测后使用。
通常待细胞在普通培养基中长至80-90%密度时,可以用来进行AHA标记,此处的普通培养基配方根据具体的细胞种类来决定,本方法中所使用的培养基配方如表1和2所示。收集分泌蛋白时的起始细胞量与最后能够检测到的蛋白质量间呈正相关的关系,具体的起始细胞量需要根据细胞的类型,细胞的分泌能力来决定,需要提前根据所用的细胞状态进行预实验来确定。本实施例中,所采用的起始细胞量为10个15cm培养皿的细胞。
表1:普通培养基配方(500ml体系)
表2:Met去除培养基配方(500ml体系)
首先,待细胞长至90%左右密度时将培养基吸去,用PBS洗两遍细胞,以洗净残留的Met,然后换用含AHA(购自Anaspec公司)的培养基进行培养,AHA标记体系如表3所示。
表3:AHA标记体系(每个15cm培养皿用量)
Met去除培养基 | AHA(100mM) | FBS | 标记时间 |
10ml | 5μl | 50μl | 24h |
AHA标记24小时后,收集上清液至50ml离心管,1,500rpm离心10min,去除悬浮的死细胞,上清液转移至新的离心管中。然后用15ml规格的3kD滤膜(购自Mi llipore公司)进行浓缩。这一步通常浓缩100倍左右,如:100ml上清液可以浓缩至1ml左右。浓缩完成后,将浓缩的上清液转移至1.5ml EP管中,用等体积的8M Urea(购自生工公司)/100mM Tris(购自生工公司)(pH 8.5)溶液冲洗一遍滤膜,尽量将粘附在滤膜上的蛋白洗脱下来。再转移至同一的EP管中,混匀。加入蛋白酶抑制剂(PI,购自Roche公司),混匀。
若需要直接进行点击化学反应,可以继续下面的步骤。若不立即进行点击化学反应,可将样品至于-80℃冰箱暂时保存。但是,由于AHA末端的叠氮基不稳定,因此建议立即进行点击化学反应,即使暂时冰箱保存,也不建议放置太久。
实施例3:点击化学反应
经上述处理后的样品可依次加入三唑配体,生物素-四聚乙二醇-炔烃(购自Sigma公司),CuBr(购自Sigma公司)进行点击化学反应,具体的反应体系如表4所示。
表4:点击化学反应体系(以1ml体系为例)
这里需要指出的是,本方法所用的三唑配体是参照文献自行合成获得,用DMSO(购自Sigma公司)进行溶解。三唑配体的CAS号为510758-28-8,亦可通过公司购买。同时,本方法是利用一价铜(CuBr)进行催化,但是该方法不限于一价铜,二价铜亦可以催化该反应。且需要注意的是,CuBr易分解,每次做反应前都需现配现用。此外,在点击化学反应时,不建议多组样品同时操作,最多同时做四个反应,若样品太多,需分批操作。
点击化学反应后,AHA标记的蛋白便可以带上生物素(biotin)标记,此时可以收集细胞裂解液,通过蛋白质印迹法(Western Blot),用生物素抗体(购自Abcam)进行检测,以验证AHA顺利插入,以及点击化学反应顺利进行。
结果如图3所示,只有AHA培养的细胞裂解液样品在经过点击化学反应后,才能够检测到生物素的信号。
实施例4:二步法肽段层面富集
4.1第一步蛋白层面富集
在本实施例中,将点击化学反应后的分泌蛋白样品和亲和素标记的琼脂糖树脂(Avidin resin,购自Thermo Fisher公司)共孵育,进行第一步蛋白层面富集。亲和素琼脂糖树脂用量可根据实际情况进行调整。本实验中,每个样品对应的亲和素琼脂糖树脂用量为120μl。
孵育前,亲和素琼脂糖树脂先用PBSN,即PBS+1%NP-40(购自Sigma公司)清洗三遍,然后将反应过的分泌蛋白样品加到清洗过后的亲和素琼脂糖树脂中,混匀。置于混合仪上,于4℃过夜孵育。
次日,将样品取出,3,000rpm离心5min,弃上清。亲和素琼脂糖树脂依次用1mlPBSN和20%ACN(Acetonitrile,购自Sigma公司)清洗一遍,去除大部分非特异结合蛋白。用2%TFA(Trifluoroacetic acid,三氟乙酸,购自Sigma公司)50%ACN洗脱蛋白,100μl/样品,置于50℃金属浴1,200rpm震荡10min,然后3000rpm离心5min,将上清转移至新EP管中。
重复一遍上述步骤,洗脱液转移到同一EP管中。用NaOH调节洗脱液pH值至中性,用0.5ml规格的3kD滤膜(购自Millipore公司)进行浓缩,每个样品可以浓缩至50μl左右,用200μl 100mM Tris(pH 8.5)冲洗一遍滤膜,并转移到同一EP管中。
将样品混匀,加入终浓度为5mM的TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine,三(2-羧乙基)膦,购自Sigma公司),混匀,室温反应20min。然后加入终浓度为10mM的IAA(iodoacetamide,碘乙酰胺,购自Sigma公司),室温避光反应15min。最后加入终浓度为1mM的CaCl2(购自Sigma公司),和1μg Trypsin(购自Promega公司),混匀,37℃避光消化16h。
4.2第二步肽段层面富集
在此步骤中,取消化完成的肽段进行第二步肽段层面富集。先用200μl纯ACN活化C8填料柱(购自Empore公司),然后置于离心机中500×g离心5min,使得ACN全部滤走,并弃之不要。后面,如果未做特殊说明,每一步离心后的滤液都气质不要。
接下来,用200μl PBSN清洗C8填料柱,重复三次,每次500×g离心5min,滤走PBSN。然后,每个C8填料柱中加入20μl亲和素琼脂糖树脂,200μl PBSN清洗三次,每次500×g离心5min。
下一步,将消化完成的样品加入到填了亲和素琼脂糖树脂的C8填料柱中进行挂柱,第一次30×g离心2.5h,然后将滤液加回到原C8填料柱中,进行第二次挂柱,第二次50×g离心1.5h。挂柱完成后,洗脱非特异性结合肽段。首先,200μl PBSN清洗三次,每次500×g离心5min。然后,200μl PBS清洗三次,每次500×g离心5min。最后,200μl 10%ACN清洗三次,每次500×g离心5min。
清洗完成后,用100μl 2%TFA 50%ACN洗脱目的肽段,重复两次,每次100×g离心20min。两次的收集洗脱液至同一EP管中,冷冻悬干之后即可送样进行检测。
实施例5:质谱检测
将悬干的样品重悬于0.1%FA(购自Sigma公司)中,以进行后续LC-MS/MS分析。使用EASY-nL-LC 1000-Orbitrap Q-Exactive HF质谱仪(购自Thermo Scientific公司)对混合肽段进行分析。将样品直接上样到15厘米的内径为100um自制毛细管柱上,填料为C18(Dr.Maisch)。流动相A由0.1%FA,2%ACN和98%H2O组成,流动相B由0.1%FA,2%H2O和98%ACN组成。使用60分钟的梯度(流动相B:0分钟时4%,4分钟时8%,45分钟时22%,53分钟时30%,57分钟时90%,60分钟时90%)流速为300nl/min。质谱方法采用数据依赖型采集策略(DDA)。高能碰撞解离(HCD)用于碎裂母离子。对于MS1,扫描范围设置为350–1500m/z,分辨率为60,000,AGC设置为3e6,最大离子注入时间为20毫秒。对于MS2,分辨率设置为30,000,起始质荷比为120,AGC设置为1e5,最大离子注入时间为100ms。每个样品分析两次。
将SwissProt人类蛋白质数据库(2018年8月下载,20191个条目)和内置污染物蛋白质列表作为数据库。选择胰酶特异性酶切,最多漏切位点设置为2。将半胱氨酸的脲甲酰化(+57.02Da)作为固定修饰,甲硫氨酸的氧化(+15.99Da)和蛋白质N末端乙酰化(+42.01Da)设置为可变修饰。此外,我们用AHA(-4.98Da)和生物素-AHA(+452.23Da)替代了甲硫氨酸。应用“match between run”。将蛋白质,肽段水平的错误发现率设为1%。
通过对这一AHA和生物素-AHA标记进行筛选,我们便可以将细胞新合成并分泌到细胞外的分泌蛋白对应的肽段筛选出来,并只对这一部分特异性的肽段对应的蛋白质进行分析,这便极大的提高了我们方法的特异性,避免了血清蛋白对数据组的干扰。
实施例6:分泌蛋白细胞亚定位及组织分布分析
在本实施例中,一共检测到293种由诱导星型胶质细胞分泌的蛋白质。为了验证这些蛋白确实为真正意义上的分泌蛋白,在本实施例中先对这293种蛋白的细胞亚定位进行了分析(图4)。
首先在Uniprot数据库(www.uniprot.org)中对这些蛋白的细胞亚定位进行搜索,并进行统计。结果表明87.7%(257种)的蛋白被标注为分泌蛋白,其余36种蛋白也有可能是通过非常规分泌途径分泌到细胞外,因而在数据库还没有被标注出来。常规无血清培养法获得的分泌蛋白组中分泌蛋白占比通常小于50%,因此这体现了本方法的优势所在。
同时,还利用DAVID数据库(david.ncifcrf.gov/summary.jsp)对这一部分蛋白的细胞组分分布(cellular component)进行分析。同样地,结果显示富集最显著的前10条注释都定位在细胞外。
最后,由于诱导星型胶质细胞为神经来源的细胞,还在DAVID数据库中对这一部分蛋白的组织分布进行了分析。结果显示这些蛋白同样在大脑中存在富集(n=143),表明了这些蛋白神经来源的特性。
以上结果表明,本方法富集得到的蛋白组大部分都为分泌蛋白,且这些分泌蛋白也有较好的细胞特异性。
实施例7:功能注释分析
为了证明本方法富集得到的分泌蛋白组能够表征细胞的功能,本实施例中在DAVID数据库中对这293种分泌蛋白所参与的生物学过程进行分析(图5)。
结果表明,这些蛋白除了参与常规分泌蛋白所具有的细胞外基质组织、细胞黏附等生物学过程外,还在一些细胞基本的代谢途径,如细胞内蛋白质代谢、基因表达调控、碳水化合物代谢过程以及蛋白质稳态调控等生物学过程中存在富集。
于此同时,由于在本实施例中,是对一株神经谱系来源的诱导星型胶质细胞的分泌蛋白进行的富集,因此这些蛋白还在轴突导向,神经系统发育,Amyloid-β清除等神经系统所特异的生物学过程中存在富集。
以上结果表明,本方法富集得到的分泌蛋白具有生物学意义,不仅具有常规分泌蛋白所具有的功能,还具有研究的目标细胞系所特有的一些生物学功能。因此本方法是一种很好的研究各类细胞分泌蛋白组的方法。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种特异性地富集细胞分泌蛋白的方法,其特征在于,包括步骤:
(I)提供一细胞培养体系,其中培养体系中的分泌蛋白S被第一标签T1特异性地标记,即所述细胞培养体系中含有复合物T1-S;
(II)提供一可通过点击化学反应与第一标签特异性连接的第二标签T2,并使其与复合物T1-S发生点击化学反应,从而形成T2-T1-S复合物;
(III)提供一结合于固相载体Z0的第三标签T3,所述第三标签T3能够与第二标签T2特异性地结合;
(IV)第一富集步骤,包括子步骤:
(IVa)使步骤(III)中的结合于固相载体的第三标签与步骤(II)中的T2-T1-S复合物共孵育,从而使标记有第一标签的分泌蛋白间接结合到固相载体上,从而形成复合物Z0-T3-T2-T1-S;和
(IVb)用洗涤缓冲液洗去未形成复合物Z0-T3-T2-T1-S的非特异性蛋白;
(V)洗脱和消化步骤,包括子步骤:
(Va)将间接结合到固相载体上的分泌蛋白进行酸性洗脱,得到复合物T2-T1-S’;和
(Vb)用胰酶对含有复合物T2-T1-S’的溶液进行消化反应,从而获得复合物T2-T1-P,其中P是酸性洗脱后所得到的细胞分泌蛋白经胰酶进行消化后所获得的肽段;和
(VI)第二富集步骤,包括步骤:
(VIa)将步骤(V)中所获得的复合物T2-T1-P与结合于固相载体Z0的第三标签T3进行第二次孵育,从而形成复合物Z0-T3-T2-T1-P;
(Vb)用洗涤缓冲液洗去未形成复合物Z0-T3-T2-T1-P的特异性肽段;和
(Vc)洗脱目标肽段,从而得到特异性富集的细胞分泌蛋白肽段样品。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述细胞可以来源于肿瘤细胞系。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,使用所述方法富集获得的细胞分泌蛋白样品中,分泌蛋白占总蛋白的85%以上(以重量分数计)。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述细胞可以来源于胚胎干细胞(ESC)和诱导多潜能干细胞(iPSC)诱导分化得到的星形胶质细胞、小胶质细胞。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述第一标签T1是AHA,所述第二标签T2是生物素,并且所述第三标签T3是链霉亲和素。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述第二培养基中含有AHA、FBS、Met去除培养基(depletion培养基),其中FBS的浓度范围为0.3-2v/v%,较佳地为0.4-1.5v/v%,更佳地为0.5-1v/v%。
7.一种试剂盒,其特征在于,所述试剂盒用于特异性地富集细胞分泌蛋白,包括:
(i)第一容器,所述第一容器中包括细胞培养物标记系统,所述细胞培养物标记系统用于形成如权利要求1所述方法中步骤(I)中的复合物T2-T1-S;
(ii)第二容器,所述第二容器中包括如权利要求1所述方法中步骤(II)的结合于固相载体Z0的第二标签T3;
(iii)第三容器,所述第三容器用于如权利要求1所述方法中步骤(III)所述的第一富集步骤的反应,以及如权利要求1所述方法中步骤(IVa)所述的洗脱;
(iv)第四容器,所述第四容器用于如权利要求1所述方法中步骤(IVb)所述的消化反应;
(v)第五容器,所述第五容器用于如权利要求1所述方法中步骤(V)所述的第二富集步骤的反应。
(vi)任选的第六容器,所述第六容器中包括洗涤缓冲液;
(vii)任选的第七容器,所述第七容器中包括酸性洗脱液。
8.如权利要求7所述的试剂盒的用途,其特征在于,用于对细胞进行组成成分的分析或对细胞或分泌蛋白的生物学功能的分析。
9.如权利要求8所述的用途,其特征在于,所述生物学功能的分析包括:分泌蛋白细胞亚定位及组织分布分析、细胞通路富集分析、对细胞功能的表征、细胞-细胞间相互作用研究、疾病机理研究、肿瘤标志物筛选、疾病早期检测标记物筛选、药物开发及检测等。
10.如权利要求9所述的用途,其特征在于,所述疾病包括肿瘤、免疫性疾病、内分泌疾病、炎症、神经退行性疾病等。
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