CN112285265A - 一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法及应用,包括胰蛋白酶镜像酶(胰蛋白酶N端羧肽酶)酶切甲基化修饰和无甲基化修饰赖氨酸和精氨酸N端肽键、肽段N末端α氨基的选择性标记、trypsin等酶切无甲基化修饰赖氨酸和精氨酸C端肽键、氨基活性材料辅助去除无甲基化修饰肽段及LC‑MS/MS分析。本发明的优点是一种不依赖抗体的蛋白质甲基化富集方法,实现赖氨酸单甲基化修饰、赖氨酸二甲基化修饰、赖氨酸三甲基化修饰、精氨酸单甲基化修饰以及精氨酸二甲基化修饰同时富集。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法及应用,实现了蛋白质赖氨酸甲基化修饰和精氨酸甲基化修饰的富集和质谱鉴定。
背景技术
蛋白质甲基化修饰是一种可逆的翻译后修饰,广泛存在于真核和原核生物中,蛋白质甲基化修饰参与了生物体的多种生命过程,与基因的转录调控、RNA剪切、DNA损伤修复、代谢、信号传导等密切相关。蛋白质甲基化修饰的形式具有多样性,可以在多种氨基酸上进行甲基化修饰,如可以发生在赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸以及甲硫氨酸上。蛋白质甲基化修饰不仅发生在多种氨基酸上,在同一种也具有不同的修饰形式,如在赖氨酸上可以发生单甲基化修饰、二甲基化修饰以及三甲基化修饰。尽管甲基化修饰可以发生在多种氨基酸上形成多种形式的甲基化修饰,目前对蛋白质甲基化修饰的研究主要集中在赖氨酸甲基化修饰和精氨酸甲基化修饰,这两种修饰在调控染色体的结构以及基因的表达中发挥着重要作用。蛋白质甲基化修饰的调控异常与多种疾病存在着密切的联系,如蛋白质甲基化修饰调控异常与乳腺癌、肺癌、淋巴癌、艾滋病以及心血管疾病等密切相关,这提示甲基化修饰底物有可能作为疾病的生物标志物存在以及蛋白质甲基化转移酶是很有潜力的药物靶标。因此,解析生物体内的甲基化修饰底物及其相互作用网络对研究疾病发生发展的生理和病理机制具有重要作用,为药物的研发以及防止各种疾病提供有益的信息。
尽管蛋白质甲基化修饰研究已经很久了,与蛋白质磷酸修饰、糖基化修饰以及乙酰化修饰相比,甲基化修饰引起的物理化学性质改变很小,因此蛋白质甲基化修饰的鉴定目前依然存在很大的挑战。为了实现蛋白质甲基化修饰的高通量富集以及鉴定,近些年发展了多种原理的蛋白质甲基化修饰富集手段,结合基于质谱技术的蛋白质组学技术,实现了蛋白质甲基化的底物系统性鉴定。常用的蛋白质甲基化修饰富集原理主要包括抗体亲和富集策略、甲基化识别结构域富集策略以及基于色谱原理的甲基化富集策略。目前,抗体亲和富集策略是甲基化修饰肽段的富集最为成功的研究办法是抗体亲和富集策略,Larsen等(Science signaling 2016,9,rs9)利用抗精氨酸甲基化修饰抗体在人肾上皮293细胞中的3300个蛋白质上鉴定出8030个蛋白质精氨酸单甲基化修饰位点信息。抗体亲和富集在蛋白质精氨酸甲基化修饰研究中取得很大的成功,但是利用抗体亲和富集方法对蛋白质赖氨酸甲基化修饰进行分析还存在很大的挑战。在2013年,Cao等(Epigenetics 2013,8,477-485)开发三种针对赖氨酸甲基化修饰的抗体,结合SCX分级,鉴定出552个蛋白质赖氨酸甲基化修饰位点;于2016年,Cao等(Current protocols in proteinscience 2016,86)进一步优化实验条件,在30mg蛋白质中鉴定出1000多个蛋白质赖氨酸单甲基化修饰位点。生物体内存在多个氨基酸互换以及翻译后修饰与甲基化修饰具有相同元素组成,Cao等没有使用稳定同位素13CD3-甲硫氨酸标记,大大增加甲基化修饰位点鉴定误差。为了提高蛋白质赖氨酸单甲基化修饰鉴定效率以及鉴定可靠性,于Wu等(MolecμLar&cellμLar proteomics:MCP2015,14,329-339)利用化学蛋白质手段建立了一个能够实现蛋白质单甲基化修饰高效富集的方法,Wu等利用丙酸酐对蛋白质进行丙酰化标记,从而将赖氨酸单甲基化修饰转变为赖氨酸丙酰甲基化修饰,提高了抗原性,开发出抗赖氨酸丙酰甲基化修饰的泛抗体,结合稳定同位素13CD3-甲硫氨酸标记以及高pH值RP-HPLC分级,最终在398个蛋白质上鉴定出446个赖氨酸单甲基化修饰位点,这446个甲基化修饰位点具有很高的可靠性,因为不仅使用了稳定同位素13CD3-甲硫氨酸标记,而且对甲基化修饰肽段的二级谱图进行手工检查,从而保证了每个二级谱具有很高的可靠性。亲和富集的选择性和鉴定结果多依赖于抗体,然而不同批次以及不同商家的抗体难以保证抗体很好的重现性。赖氨酸甲基化修饰的结构域有克罗莫结构域(chromodomain)、帝陀结构域(tudor domain)和MBT结构域(malignant braintumor domain),其中克罗莫结构域和MBT结构域已经成功应用于蛋白质甲基化修饰的富集,Moore等(Molecular cell 2013,50,444-456)采用GST-3×MBT融合蛋白质对人肾上皮293T细胞的甲基化修饰蛋白质进行富集,在313个蛋白质上仅仅鉴定到26个甲基化修饰位点信息;Liu等(Molecular cell 2013,50,723-735)利用赖氨酸甲基化修饰识别结构域(methyllysinerecognizing domain:MRD domain)在29个蛋白质上鉴定出40个赖氨酸甲基化修饰位点。虽然甲基化修饰识别结构域可以对甲基化修饰蛋白质和甲基化修饰肽段进行富集,但是从总体上看,鉴定出的甲基化修饰位点信息较少。2012年,Uhlmann等(Molecular&cellular proteomics:MCP 2012,11,1489-1499)比较了亲水作用色谱(HILIC)、强阳离子交换色谱(SCX)以及等电聚焦(IEF)对甲基化修饰肽段的富集效果,结果显示HILIC具有更好的富集效果,利用HILIC鉴定出215个精氨酸甲基化修饰位点,而SCX和IEF分别鉴定出39个和66个甲基化修饰位点信息;Wang等(Analyticalchemistry 2017,89,12909-12917)优化酶切条件以及SCX分离条件,建立了基于SCX的蛋白质甲基化修饰分析方法,利用该方法,在人肝癌细胞HepG2中鉴定出768个甲基化修饰位点;Ma等(Analyticalchemistry 2017,89,12909-12917)建立了基于HILIC原理的DOMAIN(de-glyco-assistedmethylation site identification)方法,在人非小细胞肺癌A549细胞中鉴定出573个甲基化修饰类型。尽管基于色谱原理的蛋白质甲基化修饰富集策略在富集选择方面还无法达到抗体亲和富集的效果,但其成本较低,重现性较好,使其成为蛋白质甲基化修饰分析中的可靠方法。
抗体对底物的识别具有很高的特异性,由于甲基化基团小,引起的底物结构和理化性质改变小,目前开发具有特异性富集蛋白质甲基化修饰的泛抗体非常具有挑战,尤其是抗赖氨酸甲基化修饰抗体,而且一种抗体只富集某单一甲基化修饰类型,无法实现多种蛋白质甲基化修饰的同时富集,不利于蛋白质甲基化修饰状态以及甲基化修饰之间交互作用(cross-talk)的研究。目前开展的基于HILIC和SCX方法也会受到亲水性肽段以及组氨酸的影响,因此同时高效分析多种甲基化修饰存在很大的挑战。
为了实现多种蛋白质甲基化修饰类型同时高效分析,我们建立一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法。利用胰蛋白酶镜像酶(Lysarginase)对蛋白质甲基化修饰和无甲基化修饰的赖氨酸和精氨酸N端肽键进行酶切,并使用醛对Lysarginase酶切肽段的N端氨基进行选择性封闭,进一步使用胰蛋白酶等对无甲基化修饰的肽段C端肽键进行酶切进而产生一个新的含有N端自由氨基的肽段,利用氨基活性材料与氨基的反应选择性去除无甲基化修饰肽段,从而实现赖氨酸甲基化修饰和精氨酸甲基化修饰肽段的反向富集。
发明内容
为了实现该目的,本发明的技术方案是:
1、采用胰蛋白酶N端羧肽酶(LysargNase)对蛋白质进行酶切
将尿素或者盐酸胍溶解在5-200mM的HEPES中配置成裂解液,使用配置好的裂解液对蛋白质进行提取,使用终浓度为2-20mM的二硫苏糖醇于25-56℃反应15-60min,将蛋白质上的二硫键打开,然后使用终浓度为6-60mM的碘乙酰胺于室温避光反应15-60min,对打蛋白质上的巯基进行烷基化标记,最后使用终浓度为12-120mM的二硫苏糖醇于室温反应15-60min终止过量的碘乙酰胺。
然后使用10kDa的超滤管将过量的试剂去除,具体过程如下;将全细胞裂解液加入至超滤管中,10000-16000g离心10-30min,然后加入100-400μL的2-8M尿素水溶液,10000-16000g离心10-30min,重复该步骤三遍,在使用100-400μL浓度为5-200mM的HEPES洗三遍,最后按照酶用量为蛋白质质量的分别为1/5-1/500,25℃-65℃,酶解2-48h,酶解体系pH为6-9。
将肽段溶液使用TFA进行酸化并进行除盐。使用乙腈活化Oasis HLB除盐柱,然后使用0.05%-1%TFA水溶液对小柱进行平衡,将酸化的酶解产物加入至平衡好的Oasis HLB除盐小柱上,使得酶解产物缓慢通过小柱,然后使用0.05%-1%TFA水溶液清洗小柱,最后使用0.05%-1%TFA/35-80%乙腈将肽段从Oasis HLB小柱上洗脱下来,并使用speed-vac进行干燥。
本发明中胰蛋白酶N端羧肽酶还有其他名称,还可以命名为胰蛋白酶镜像酶。
2、肽段N端α氨基的选择性标记
将干燥的酶解肽段溶于水中,肽段浓度为0.1-1mg/mL,,使用醛基化合物(甲醛、乙醛等)终浓度为5mM-1000mM,反应温度为4℃-37℃,反应时间为10min-48h,pH为1-5。将标记的肽段立刻使用Oasis HLB除盐柱进行除盐,方法如上。
3、采用trypsin等对N端α氨基的选择性标记的肽段进行酶切
将N端α氨基的选择性标记的肽段溶解在5-200mM的HEPES中,加入trypsin等酶用于水解肽段中无甲基化修饰的赖氨酸和精氨酸C端肽键,使得无甲基化修饰肽段因被酶切而产生一个N端自由α氨基,酶用量为蛋白质质量的分别为1/5-1/500,25℃-50℃,酶解2-48h,酶解体系pH为6-9。
此处进行酶切时,通过以下酶进行酶切(1)采用胰蛋白酶进行酶切,(2)或通过将细胞内蛋白酶和梭菌蛋白酶联合使用实现无甲基化修饰赖氨酸和精氨酸C端肽键的水解,(3)或者通过将细胞内蛋白酶、梭菌蛋白酶和胰蛋白酶联合使用实现无甲基化修饰赖氨酸和精氨酸C端肽键的水解。
4、甲基化修饰肽段的反向富集
由于无甲基化修饰肽段因为被trypsin等酶酶切产生一个N端自由α氨基,无甲基化修饰肽段进一步使用氨基活材料去除含有N端自由α氨基的无甲基化修饰肽段,实现甲基化修饰肽段的反向富集。氨基活性材料可以是N-羟基琥珀酰亚胺酯活性琼脂糖、溴化氰活性琼脂糖、异氰酸树脂、醛基功能化材料等能够与氨基进行共价反应的材料,将氨基活性材料与trypsin等酶切得到的肽段进行抚育,调节pH为3-12,25℃-50℃反应0.16h至24h。根据氨基活性材料的性质,使用离心、亲和色谱、分子筛等去除氨基活性材料,得到甲基化修饰的肽段。
5、LC-MS/MS分析得到的甲基化修饰肽段
利用ESI电离模式电离甲基化修饰的肽段,使用Orbitrap质谱仪等分析,利用目前数据依赖或者从头测序软件,如Mascot、MaxQuant、pFide、SEQUEST,PEAKS等对数据进行分析,解析甲基化修饰位点信息。
本发明中的一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法,其可应用的生物样品包括细胞、组织、体液中的一种或二种以上。
本发明的有益效果为:
1、本发明是一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集方法,不依赖抗体的实验策略,通过甲基化修饰赖氨酸和精氨酸N端肽段的酶切能够对赖氨酸单甲基化修饰、赖氨酸二甲基化修饰、赖氨酸三甲基化修饰、精氨酸单甲基化修饰以及精氨酸二甲基化修饰同时富集。
2、利用超高分别率及超高速度生物质谱对富集得到甲基化修饰肽段,可以实现甲基化修饰的高通量分析。
附图说明
图1、一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集方法的流程图。
图2、将甲基化修饰BSA与正常BSA按照1:1000的比例混合,富集前后的鉴定结果。
图3、Hela细胞蛋白质甲基化修饰鉴定结果。
具体实施方式
实施例1
如图1所示,将蛋白质进行还原烷基化处理后,使用LysargNase酶对蛋白质进行酶切处理,使用醛对肽段的N端α氨基进行选择性封闭,然后使用胰蛋白酶(trypsin)对封闭的肽段进行酶切,无甲基化修饰肽段经过胰蛋白酶水解会产生一个新的N末端α氨基,然后使用氨基活性材料与非甲基化修饰肽段的N末端α氨基反应,通过进一步分离氨基活性材料实现甲基化修饰肽段的反向富集,利用高效液相反向色谱-超高分别率生物质谱(LC-MS/MS)对富集的甲基化修饰样品进行分析,实现蛋白质甲基化修饰的高通量鉴定。
为了考察基于反向富集策略的蛋白质甲基化修饰分析方法对甲基化修饰的富集能力,我们首先选择简单BSA蛋白质体系对实验方法进行评估。首先将BSA蛋白质进行还原烷基化处理,然后一部分BSA使用13CD2-甲醛进行二甲基化标记,然后将标记好的BSA和正常BSA按照质量比为1:1000进行混合,将混合的蛋白质体系使用图1所述的方法进行甲基化修饰肽段的富集。使用Q Exactive对没有进行富集的BSA样品以及采用我们方法进行富集的BSA样品进行分析,在没有富集的BSA样品中,我们鉴定到了63个肽段,而没有鉴定到二甲基化修饰的肽段,当经过我们的方法富集之后,我们鉴定到了23个BSA肽段,其中13条为二甲基化修饰的肽段,甲基化修饰肽段占鉴定总肽段的56%,如图2所示,该结果提示在1000倍的背景干扰下,我们的蛋白质甲基化修饰富集分析方法能够有效的鉴定出甲基化修饰肽段。
以子宫颈癌Hela细胞为样品,首先使用稳定同位素13CD3-甲硫氨酸对细胞进行代谢标记,使用含有8M尿素的20mM的HEPES为裂解液,对蛋白质进行提取,使用BCA试剂盒对蛋白质进行定量,根据BCA定量结果,将蛋白质配置成浓度为1mg/mL,加入终浓度为5mM的二硫苏糖醇,56℃反应30min打开蛋白质中的二硫键,然后加入终浓度为15mM的碘乙酰胺,室温避光反应30min,将蛋白质上的巯基进行烷基化,最后使用终浓度为30mM二硫苏糖醇终止过量的碘乙酰胺。使用10kDa的超滤管去除蛋白质溶液中的尿素及小分子标记试剂。首先将蛋白质裂解液转移至超滤管中,16000g离心30min,然后加入400μL 8M的尿素水溶液,16000g离心30min,重复尿素清洗三次,然后使用400μL 20mM的HEPES继续洗三遍。将蛋白质重悬于20mM的HEPES中,调节pH为7.4,按照LysargNase与蛋白质的质量比为1:20对蛋白质进行酶切,37℃消化12h。使用除盐柱对LysargNase酶切肽段进行除盐及干燥。将干燥的肽段溶解在水溶液中至终浓度为1mg/mL,使用冰乙酸调节pH为2.5,加入终浓度为20mM的氰基硼氢化钠和40mM的甲醛,25℃标记1h,然后对标记的肽段立刻进行除盐及干燥。将干燥的肽段溶解在20mM HEPES中至终浓度为1mg/mL,调节pH为7.4,按照胰蛋白酶与肽段的质量比为1:20对肽段进行酶切,37℃消化12h。然后将胰蛋白酶酶切得到的肽段加入至16mg的超支化多聚醛高分子材料HPG-ALD中,加入氰基硼氢化钠至终浓度为20mM,37℃反应12h。最后利用10kDa的超滤管将聚合物HPG-ALD分离,过滤得到的溶液既含有甲基化修饰肽段,使用C18对得到的肽段进行除盐和干燥,对干燥得到的肽段进行LC-MS/MS分析以及原始文件的MaxQuant搜索,实现蛋白质甲基化修饰肽段的鉴定。我们在771蛋白质上,鉴定出1148个甲基化修饰信息,包括141个赖氨酸单甲基化修饰位点、162个赖氨酸二甲基化修饰位点、255个赖氨酸三甲基化修饰位点、338个精氨酸单甲基化修饰位点和252个精氨酸二甲基化修饰位点,如图3所示,这是目前利用非抗体富集方法进行蛋白质甲基化修饰鉴定的最大数据集。
实施例2
以子宫颈癌Hela细胞为样品,首先使用稳定同位素13CD3-甲硫氨酸对细胞进行代谢标记,使用含有4M尿素的20mM的HEPES为裂解液,对蛋白质进行提取,使用BCA试剂盒对蛋白质进行定量,根据BCA定量结果,将蛋白质配置成浓度为1mg/mL,加入终浓度为2mM的二硫苏糖醇,56℃反应60min打开蛋白质中的二硫键,然后加入终浓度为6mM的碘乙酰胺,室温避光反应60min,将蛋白质上的巯基进行烷基化,最后使用终浓度为12mM二硫苏糖醇终止过量的碘乙酰胺。使用10kDa的超滤管去除蛋白质溶液中的尿素及小分子标记试剂。首先将蛋白质裂解液转移至超滤管中,10000g离心30min,然后加入100μL 8M的尿素水溶液,10000g离心10min,重复尿素清洗三次,然后使用100μL 20mM的HEPES继续洗三遍。将蛋白质重悬于20mM的HEPES中,调节pH为7.4,按照LysargNase与蛋白质的质量比为1:5对蛋白质进行酶切,25℃消化48h。使用除盐柱对LysargNase酶切肽段进行除盐及干燥。将干燥的肽段溶解在水溶液中至终浓度为0.1mg/mL,使用冰乙酸调节pH为2.5,加入终浓度为20mM的氰基硼氢化钠和40mM的甲醛,25℃标记1h,然后对标记的肽段立刻进行除盐及干燥。将干燥的肽段溶解在20mM HEPES中至终浓度为1mg/mL,调节pH为7.4,按照胰蛋白酶与肽段的质量比为1:5对肽段进行酶切,25℃消化48h。然后将胰蛋白酶酶切得到的肽段加入至16mg的超支化多聚醛高分子材料HPG-ALD中,加入氰基硼氢化钠至终浓度为20mM,37℃反应12h。最后利用10kDa的超滤管将聚合物HPG-ALD分离,过滤得到的溶液既含有甲基化修饰肽段,使用C18对得到的肽段进行除盐和干燥,对干燥得到的肽段进行LC-MS/MS分析以及原始文件的Mascot搜索,实现蛋白质甲基化修饰肽段的鉴定。
实施例3
以子宫颈癌Hela细胞为样品,首先使用稳定同位素13CD3-甲硫氨酸对细胞进行代谢标记,使用含有8M尿素的20mM的HEPES为裂解液,对蛋白质进行提取,使用BCA试剂盒对蛋白质进行定量,根据BCA定量结果,将蛋白质配置成浓度为1mg/mL,加入终浓度为20mM的二硫苏糖醇,56℃反应15min打开蛋白质中的二硫键,然后加入终浓度为60mM的碘乙酰胺,室温避光反应15min,将蛋白质上的巯基进行烷基化,最后使用终浓度为120mM二硫苏糖醇终止过量的碘乙酰胺。使用10kDa的超滤管去除蛋白质溶液中的尿素及小分子标记试剂。首先将蛋白质裂解液转移至超滤管中,14000g离心30min,然后加入200μL 8M的尿素水溶液,14000g离心20min,重复尿素清洗三次,然后使用200μL 20mM的HEPES继续洗三遍。将蛋白质重悬于20mM的HEPES中,调节pH为7.4,按照LysargNase与蛋白质的质量比为1:500对蛋白质进行酶切,65℃消化6h。使用除盐柱对LysargNase酶切肽段进行除盐及干燥。将干燥的肽段溶解在水溶液中至终浓度为1mg/mL,使用冰乙酸调节pH为1.5,加入终浓度为20mM的氰基硼氢化钠和1000mM的甲醛,25℃标记10min,然后对标记的肽段立刻进行除盐及干燥。将干燥的肽段溶解在20mM HEPES中至终浓度为1mg/mL,调节pH为7.4,按照胰蛋白酶与肽段的质量比为1:500对肽段进行酶切,50℃消化6h。然后将胰蛋白酶酶切得到的肽段加入至16mg的超支化多聚醛高分子材料HPG-ALD中,加入氰基硼氢化钠至终浓度为20mM,50℃反应4h。最后利用10kDa的超滤管将聚合物HPG-ALD分离,过滤得到的溶液既含有甲基化修饰肽段,使用C18对得到的肽段进行除盐和干燥,对干燥得到的肽段进行LC-MS/MS分析以及原始文件的Mascot搜索,实现蛋白质甲基化修饰肽段的鉴定。
实施例4
以子宫颈癌Hela细胞为样品,首先使用稳定同位素13CD3-甲硫氨酸对细胞进行代谢标记,使用含有4M尿素的20mM的HEPES为裂解液,对蛋白质进行提取,使用BCA试剂盒对蛋白质进行定量,根据BCA定量结果,将蛋白质配置成浓度为1mg/mL,加入终浓度为10mM的二硫苏糖醇,56℃反应30min打开蛋白质中的二硫键,然后加入终浓度为30mM的碘乙酰胺,室温避光反应30min,将蛋白质上的巯基进行烷基化,最后使用终浓度为60mM二硫苏糖醇终止过量的碘乙酰胺。使用10kDa的超滤管去除蛋白质溶液中的尿素及小分子标记试剂。首先将蛋白质裂解液转移至超滤管中,15000g离心30min,然后加入400μL 8M的尿素水溶液,15000g离心30min,重复尿素清洗三次,然后使用400μL 20mM的HEPES继续洗三遍。将蛋白质重悬于20mM的HEPES中,调节pH为7.4,按照LysargNase与蛋白质的质量比为1:50对蛋白质进行酶切,45℃消化4h。使用除盐柱对LysargNase酶切肽段进行除盐及干燥。将干燥的肽段溶解在水溶液中,使用冰乙酸调节pH为2.0,加入终浓度为20mM的氰基硼氢化钠和100mM的甲醛,25℃标记30min,然后对标记的肽段立刻进行除盐及干燥。将干燥的肽段溶解在20mMHEPES中至终浓度为1mg/mL,调节pH为7.4,按照消化酶与肽段的质量比为1:50的比例分别加入trypsin、Lys-C以及Arg-C对肽段进行酶切,37℃消化12h。然后将胰蛋白酶酶切得到的肽段加入至16mg的超支化多聚醛高分子材料HPG-ALD中,加入氰基硼氢化钠至终浓度为20mM,40℃反应6h。最后利用10kDa的超滤管将聚合物HPG-ALD分离,过滤得到的溶液既含有甲基化修饰肽段,使用C18对得到的肽段进行除盐和干燥,对干燥得到的肽段进行LC-MS/MS分析以及原始文件的Mascot搜索,实现蛋白质甲基化修饰肽段的鉴定。
实施例5
以子宫颈癌Hela细胞为样品,首先使用稳定同位素13CD3-甲硫氨酸对细胞进行代谢标记,使用含有4M尿素的20mM的HEPES为裂解液,对蛋白质进行提取,使用BCA试剂盒对蛋白质进行定量,根据BCA定量结果,将蛋白质配置成浓度为1mg/mL,加入终浓度为10mM的二硫苏糖醇,56℃反应30min打开蛋白质中的二硫键,然后加入终浓度为30mM的碘乙酰胺,室温避光反应30min,将蛋白质上的巯基进行烷基化,最后使用终浓度为60mM二硫苏糖醇终止过量的碘乙酰胺。使用10kDa的超滤管去除蛋白质溶液中的尿素及小分子标记试剂。首先将蛋白质裂解液转移至超滤管中,15000g离心30min,然后加入400μL 8M的尿素水溶液,15000g离心30min,重复尿素清洗三次,然后使用400μL 20mM的HEPES继续洗三遍。将蛋白质重悬于20mM的HEPES中,调节pH为7.4,按照LysargNase与蛋白质的质量比为1:50对蛋白质进行酶切,45℃消化4h。使用除盐柱对LysargNase酶切肽段进行除盐及干燥。将干燥的肽段溶解在水溶液中,使用冰乙酸调节pH为2.0,加入终浓度为20mM的氰基硼氢化钠和100mM的甲醛,25℃标记30min,然后对标记的肽段立刻进行除盐及干燥。将干燥的肽段溶解在20mMHEPES中至终浓度为1mg/mL,调节pH为7.4,按照消化酶与肽段的质量比为1:50的比例分别加入Lys-C以及Arg-C对肽段进行酶切,37℃消化12h。然后将胰蛋白酶酶切得到的肽段加入至16mg的超支化多聚醛高分子材料HPG-ALD中,加入氰基硼氢化钠至终浓度为20mM,40℃反应6h。最后利用10kDa的超滤管将聚合物HPG-ALD分离,过滤得到的溶液既含有甲基化修饰肽段,使用C18对得到的肽段进行除盐和干燥,对干燥得到的肽段进行LC-MS/MS分析以及原始文件的Mascot搜索,实现蛋白质甲基化修饰肽段的鉴定。
实施例6
以人肝癌组织为样品,使用预冷的PBS清洗组织至无明显血色,加入8M尿素后,使用剪刀将组织剪碎,使用超声进行蛋白质的提取,使用BCA试剂盒对蛋白质进行定量,根据BCA定量结果,取1mg的蛋白质配置成浓度为1mg/mL,加入10μL浓度为1M的二硫苏糖醇,56℃反应30min打开蛋白质中的二硫键,然后加入30μL浓度为1M的碘乙酰胺,室温避光反应30min,将蛋白质上的巯基进行烷基化,最后使用终浓度为30mM二硫苏糖醇终止过量的碘乙酰胺。使用10kDa的超滤管去除蛋白质溶液中的尿素及小分子标记试剂,首先将蛋白质裂解液转移至超滤管中,16000g离心30min,然后加入400μL 8M的尿素水溶液,16000g离心30min,重复尿素清洗三次,然后使用400μL 20mM的HEPES继续洗三遍。将蛋白质重悬于20mM的HEPES中,按照LysargNase与蛋白质的质量比为1:20对蛋白质进行酶切,37℃过夜。使用除盐柱对LysargNase酶切肽段进行除盐及干燥。将干燥的肽段溶解在1mL 1.5%的乙酸水溶液中,加入20μL 1M的氰基硼氢化钠,25℃标记1h,然后对标记的肽段立刻进行除盐及干燥。将干燥的肽段溶解在20mMHEPES中,按照胰蛋白酶与肽段的质量比为1:30对肽段进行酶切,37℃过夜。然后将胰蛋白酶酶切得到的肽段加入至16mg的超支化多聚醛高分子材料HPG-ALD中,加入氰基硼氢化钠至终浓度为20mM,37℃反应过夜。最后利用10kDa的超滤管将聚合物HPG-ALD分离,过滤得到的溶液既含有甲基化修饰肽段,使用C18对得到的肽段进行除盐和干燥,对干燥得到的肽段进行LC-MS/MS分析以及原始文件的MaxQuant搜索,实现蛋白质甲基化修饰肽段的鉴定。
实施例7
以子宫颈癌Hela细胞为样品,首先使用稳定同位素13CD3-甲硫氨酸对细胞进行代谢标记,使用含有4M尿素的20mM的HEPES为裂解液,对蛋白质进行提取,使用BCA试剂盒对蛋白质进行定量,根据BCA定量结果,将蛋白质配置成浓度为1mg/mL,加入终浓度为10mM的二硫苏糖醇,56℃反应30min打开蛋白质中的二硫键,然后加入终浓度为30mM的碘乙酰胺,室温避光反应30min,将蛋白质上的巯基进行烷基化,最后使用终浓度为60mM二硫苏糖醇终止过量的碘乙酰胺。使用10kDa的超滤管去除蛋白质溶液中的尿素及小分子标记试剂。首先将蛋白质裂解液转移至超滤管中,15000g离心30min,然后加入400μL 8M的尿素水溶液,15000g离心30min,重复尿素清洗三次,然后使用400μL 20mM的HEPES继续洗三遍。将蛋白质重悬于20mM的HEPES中,调节pH为7.4,按照LysargNase与蛋白质的质量比为1:50对蛋白质进行酶切,45℃消化4h。使用除盐柱对LysargNase酶切肽段进行除盐及干燥。将干燥的肽段溶解在水溶液中,使用冰乙酸调节pH为2.0,加入终浓度为20mM的氰基硼氢化钠和100mM的甲醛,25℃标记30min,然后对标记的肽段立刻进行除盐及干燥。将干燥的肽段溶解在20mMHEPES中至终浓度为1mg/mL,调节pH为7.4,按照消化酶与肽段的质量比为1:50的比例分别加入trypsin、Lys-C以及Arg-C对肽段进行酶切,37℃消化12h。然后将胰蛋白酶酶切得到的肽段加入至N-羟基琥珀酰亚胺酯活性琼脂糖,37℃反应1h。3000g离心分离N-羟基琥珀酰亚胺酯活性琼脂糖,得到含有甲基化修饰肽段,使用C18对得到的肽段进行除盐和干燥,对干燥得到的肽段进行LC-MS/MS分析以及原始文件的Mascot搜索,实现蛋白质甲基化修饰肽段的鉴定。
实施例8
以血浆为样品,取20μL的血尿,加入1mL 8M尿素后,使用BCA试剂盒对蛋白质进行定量,根据BCA定量结果,取1mg的蛋白质配置成浓度为1mg/mL,加入10μL浓度为1M的二硫苏糖醇,56℃反应30min打开蛋白质中的二硫键,然后加入30μL浓度为1M的碘乙酰胺,室温避光反应30min,将蛋白质上的巯基进行烷基化,最后使用终浓度为30mM二硫苏糖醇终止过量的碘乙酰胺。使用10kDa的超滤管去除蛋白质溶液中的尿素及小分子标记试剂,首先将蛋白质裂解液转移至超滤管中,16000g离心30min,然后加入400μL 8M的尿素水溶液,16000g离心30min,重复尿素清洗三次,然后使用400μL 20mM的HEPES继续洗三遍。将蛋白质重悬于20mM的HEPES中,按照LysargNase与蛋白质的质量比为1:20对蛋白质进行酶切,37℃过夜。使用除盐柱对LysargNase酶切肽段进行除盐及干燥。将干燥的肽段溶解在1mL 1.5%的乙酸水溶液中,加入20μL 1M的氰基硼氢化钠,25℃标记1h,然后对标记的肽段立刻进行除盐及干燥。将干燥的肽段溶解在20mM HEPES中,按照胰蛋白酶与肽段的质量比为1:30对肽段进行酶切,37℃过夜。然后将胰蛋白酶酶切得到的肽段加入至16mg的超支化多聚醛高分子材料HPG-ALD中,加入氰基硼氢化钠至终浓度为20mM,37℃反应过夜。最后利用10kDa的超滤管将聚合物HPG-ALD分离,过滤得到的溶液既含有甲基化修饰肽段,使用C18对得到的肽段进行除盐和干燥,对干燥得到的肽段进行LC-MS/MS分析以及原始文件的MaxQuant搜索,实现蛋白质甲基化修饰肽段的鉴定。
Claims (10)
1.一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)利用胰蛋白酶N端羧肽酶酶切蛋白质甲基化修饰和无甲基化修饰的赖氨酸和精氨酸N段肽键;
(2)对步骤(1)得到的肽段进行N端α氨基的选择性标记;
(3)对步骤(2)得到的N端α氨基的选择性标记的肽段中的无甲基化修饰的赖氨酸和精氨酸C端肽键进行特异性酶切,使无甲基化修饰肽段产生一个N端自由α氨基;
(4)继续使用氨基活性材料去除含有N端自由α氨基的无甲基化修饰肽段,分离氨基活性材料实现赖氨酸甲基化修饰和精氨酸甲基化修饰肽段的反向富集,得到甲基化修饰的肽段;所述的氨基活性材料为与氨基进行共价反应的材料;
(5)采用LC-MS/MS分析得到的甲基化修饰肽段。
2.按照权利要求1的基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法,其特征在于:步骤(2)中:在pH为1-5条件下,使用醛基化合物对肽段N端的α-氨基进行标记反应。
3.按照权利要求1的基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法,其特征在于:步骤(3)进行酶切时,包括:采用胰蛋白酶,或将胞内蛋白酶和梭菌蛋白酶联合使用,或者胞内蛋白酶、梭菌蛋白酶和胰蛋白酶联合使用,实现无甲基化修饰赖氨酸和精氨酸C端肽键的水解。
4.按照权利要求1的基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法方法,其特征在于:步骤(4)中:利用醛基或者活性酯与氨基的反应,将无甲基化修饰肽段固定到氨基活性材料上,通过分离氨基活性材料实现甲基化修饰肽段的富集;步骤(4)包括:将氨基活性材料与步骤(3)酶切后得到的肽段进行抚育,调节pH为3-12,25℃-50℃度0.16h-24h。
5.按照权利要求1的基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法,其特征在于:步骤(5)采用LC-MS/MS分析得到的甲基化修饰肽段包括:利用反向C18-LC对肽段进行分离,利用ESI电离方式对分离的肽段进行离子化,通过高分辨率质谱分析离子化的肽段一级谱和二级谱,并利用搜索软件对质谱数据进行解析,从而鉴定出甲基化修饰肽段的信息。
6.按照权利要求1所述的基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法,其特征在于:步骤(1)中对蛋白质进行酶切时,酶用量为蛋白质质量的1/5-1/500,25℃-65℃,酶解2-48h,酶解体系pH为6-9。
7.按照权利要求2所述的基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法,其特征在于:所述醛基化合物为甲醛或乙醛,标记时醛基化合物终浓度为5mM-1000mM,反应温度为4℃-37℃,反应时间为0.16h-48h,pH为1-5。
8.按照权利要求3所述的基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法,其特征在于:进行酶切,酶用量为蛋白质质量的1/5-1/500,25℃-50℃,酶解2-48h,酶解体系pH为6-9。
9.按照权利要求4所述的基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法,其特征在于:所述的氨基活性材料为含有有醛基的材料和活性酯的材料,包括N-羟基琥珀酰亚胺酯活性琼脂糖、溴化氰活性琼脂糖、异氰酸树脂、醛基功能化材料中的一种或二种以上。
10.按照权利要求5所述的基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法,其特征在于:高分别率质谱仪,包括Orbitrap Elite、Q Exactive、Q Exactive Focus、QExactive Plus、Q Exactive HF-X、Orbitrap Fusion Tribrid、Orbitrap Fusion LumosTribrid;对甲基化进行数据解析的搜索软件包括Mascot、MaxQuant、pFide、SEQUEST,PEAKS中的一种或二种以上。
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