CN108089004B - 一种硫巯化翻译后修饰肽段的定性与定量方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种硫巯化翻译后修饰肽段的定性与定量方法。所述的方法分为两条路线：路线A和路线B。其中，路线A是把蛋白酶解产生的肽段与碘乙酰胺的小球孵育，对巯基肽段和硫巯基肽段进行富集后；通过还原剂将硫巯基肽段的二硫键还原释放，进而用可断裂的同位素亲和标签标记释放下来的硫巯基肽段，最后使用裂解液将可断裂的同位素亲和标签的连接臂断裂。路线B是用可断裂的同位素亲和标签标记含巯基和硫巯基的蛋白、蛋白酶解、亲和富集巯基肽段和硫巯基肽段；最后用裂解液将连接在巯基肽段和硫巯基肽段上的可断裂的同位素亲和标签的连接臂断裂。该方法具有选择性好、假阳性低等优点，可实现复杂蛋白质组样品中规模化硫巯化肽段的定性与定量。

Description

一种硫巯化翻译后修饰肽段的定性与定量方法
技术领域
本发明涉及一种硫巯化翻译后修饰肽段的定性与定量方法及其在细胞、组织及体液等蛋白质组样品中规模化硫巯化肽段分析中的应用。
背景技术
20世纪90年代后期,H2S被证实是存在于体内的第3种新型的内源性气体分子，广泛参与机体多种生理与病理过程。目前研究表明，蛋白质的硫巯化翻译后修饰(将活性R-SH转化为R-SSH)是H2S信号传导的一个重要生物学途径之一。蛋白的硫巯化修饰在体内是普遍存在的，一些重要的蛋白质已被确认发生了硫巯化修饰，如：生理条件发生的Parkin-SSH能增强其泛素化活性，有利于帕金森疾病的治疗(Nat.Commun,2013,4,1-6)；抗凋亡转录因子(NF-κB)亚单元p65-SSH可以诱导抗凋亡基因的转录(Antioxid.Redox.Signal.,2014,21,2531-2541)。在组学水平大规模分析鉴定硫巯化蛋白/肽段有助于H2S信号通路的深入研究。然而，作为亲核试剂,R-SSH的性质与R-SH类似；作为亲电试剂，R-SSH的性质与R-SS-R类似；加之R-SSH的内在不稳定性导致富集鉴定存在较大的困难。目前，硫巯化蛋白/肽段的富集鉴定方法多采用间接法，丢失了硫巯化的位点信息，造成了一定的假阳性。因此，发展直接的硫巯化位点的富集鉴定策略十分必要，同时结合组学定量技术对硫巯化位点进行大规模定性定量分析将是硫巯化翻译后修饰的发展趋势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种规模化定性与定量分析复杂样品中硫巯化肽段的方法。为实现该目的，本方法采用的技术方案为：
(1)将碘乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯通过共价反应固载到带氨基的小球上。小球的基质为硅球、聚合物微球、四氧化三铁磁性纳米颗粒。反应得到的是碘乙酰胺的硅球、碘乙酰胺的聚合物微球、碘乙酰胺的四氧化三铁磁性纳米颗粒。反应体系为：在甲醇和磷酸盐缓冲盐中避光振荡反应0.5-24小时。其中甲醇加入量为总体积的30％-60％，磷酸盐缓冲盐浓度为0.01-0.1M,pH为7.5-8.5。
(2)将蛋白酶解产物与带有碘乙酰胺的硅球、碘乙酰胺的聚合物微球、碘乙酰胺的四氧化三铁磁性纳米颗粒在磷酸盐缓冲盐中(0.01-0.1M，pH7.5-8.5)孵育3-12h以富集巯基肽段和硫巯基肽段，使用30-60％的乙腈和0.5-2M的氯化钠洗涤去除非特异吸附。
(3)使用还原剂三(2-羧乙基)膦/二硫苏糖醇将固定到材料上的硫巯基肽段还原切断进而释放，其中三(2-羧乙基)膦/二硫苏糖醇的浓度为1-100mM，37℃还原，反应时间为30-120min。
(4)将还原洗脱下来的肽段用5-100μL的可断裂的同位素亲和标签进行标记，反应体系为0.01-0.1M，pH7.5-8.5的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，收集标记后的肽段。
(5)将标记后的肽段使用50-90μL的95％的三氟乙酸和5％的试剂盒提供的断裂试剂B，37℃孵育2h进行酸裂解，收集裂解后的肽段，进行液质联用质谱鉴定。将鉴定得到的肽段二级质谱信息生成参考库。
(6)将蛋白样品在50mM三羟甲基氨基甲烷,pH8.3,6M尿素,5mM乙二胺四乙酸进行变性后，用5-100μL的可断裂的同位素亲和标签进行标记蛋白上的巯基和硫巯基，随后转移到滤膜(截留分子量为3000Da-10000Da)去除过量的标记试剂。最后在50-200μL，50mM碳酸氢铵中进行酶解12-16h，胰蛋白酶加入量与蛋白量的质量比值在1:20-1:200。
(7)将蛋白酶解后的肽段用链霉亲和素的琼脂糖凝胶或链霉亲和素的磁珠在0.01-0.1M，pH7.2的磷酸盐缓冲体系中对带有可断裂的同位素亲和标签的巯基肽段和硫巯基肽段进行室温的特异性富集，富集时间0.5-2h。洗除非特异吸附之后，使用pH1.5-2的6M盐酸胍/0.1M乙酸/0.1M，pH 2.5的甘氨酸盐酸，将巯基肽段和硫巯基肽段进行洗脱。
(8)将洗脱的巯基肽段和硫巯基肽段用50-90μL的95％的三氟乙酸和5％的试剂盒提供的断裂试剂B，37℃孵育2h进行酸裂解，收集裂解后的肽段，进行液质联用质谱鉴定，得到的肽段二级质谱信息。
(9)：将(8)鉴定到的肽段二级质谱信息与(5)生成的参考库中的肽段二级质谱信息进行比对，从中挑取含有半胱氨酸的肽段序列和带有硫巯基修饰位点信息的高匹配度的肽段，即为硫巯化肽段的定性。利用可断裂的同位素亲和标签中的同位素13C和12C标签在一级质谱中的峰强度不同可实现硫巯基肽段的定量。
(10)将该方法应用于细胞、组织及体液等蛋白质组样品中规模化硫巯化肽段的定性定量分析。
(11)所述的可断裂的同位素亲和标签为，由特异结合巯基肽段和硫巯基肽段的碘乙酰胺基团、含同位素13C和12C标签、可裂解的连接臂以及亲和纯化的生物素通过化学键连接而成；连接臂可为酯基、二硫键和碳氮双键，可在pH＝1-2的酸性条件、还原条件或紫外光照射下断裂，进而使裂解后的肽段带上一个的标签。可断裂的同位素亲和标签可市购获得，如：AB SCIEX公司(P/N:4337337)。
本发明具有如下优点：
(1)建立了硫巯化修饰肽段的参考库，可显著降低硫巯化修饰肽段的鉴定假阳性率；
(2)通过建立参考库和PRM高选择性检测相结合的方式，可提高硫巯化肽段的检测效率和可信度；
(3)采用可断裂的同位素亲和标签标记硫巯基肽段，可获得硫巯化位点的信息。
附图说明
图1为鉴定硫巯基肽段的路线A、B示意图。
图2为用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱来评价可断裂的同位素亲和标签标记牛血清白蛋白中巯基肽段的标记效率。
图3为碘乙酰胺聚合物微球对硫巯基标肽的富集评价。
具体实施方式
实施例1
路线A：
碘乙酰胺聚合物微球的制备：称取13mg碘乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯，溶于400μL甲醇和200μL的50mM，pH 8.0磷酸盐缓冲盐的混合溶液中，振荡溶解后与10mg，5μm,
Figure BDA0001157449360000031
的氨基聚合物微球避光反应6h。反应完毕，用磷酸盐缓冲盐、甲醇各洗涤三次，真空干燥得到碘乙酰胺聚合物微球。
碘乙酰胺聚合物微球对硫巯基标肽的富集和洗脱：称取1mg的碘乙酰胺聚合物微球，用50mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲盐清洗三次后再分散在200μL磷酸盐缓冲盐。加入2μg的硫巯基标肽和巯基标肽混合物，其中硫巯基标肽和巯基标肽的质量比例为2:3，避光反应6h。反应完毕用30％乙腈和2M氯化钠洗涤去除非特异吸附，最后加入100μL，终浓度为5mM的三(2-羧乙基)膦在37℃还原1h以释放硫巯基标肽，富集效果如图2所示，可实现选择性的富集、洗脱硫巯基标肽。
用可断裂的同位素亲和标签(AB SCIEX公司，P/N:4337337)标记释放下来的硫巯基肽段：将100μL，还原释放的硫巯基标肽加入10μL的可断裂的同位素亲和标签(AB SCIEX公司，P/N:4337337)进行标记，37℃避光反应2h。反应完毕，将标记后的肽段除盐、冻干、最后加入76μL的三氟乙酸和4μL的试剂盒提供的断裂试剂B，37℃酸裂解2h，收集裂解后的肽段。
实施例2
路线B：
用可断裂的同位素亲和标签(AB SCIEX公司，P/N:4337337)标记牛血清白蛋白及牛血清白蛋白的酶解：称取100μg的牛血清白蛋白，溶于100μL，50mM三羟甲基氨基甲烷,pH8.3,6M尿素,5mM乙二胺四乙酸中并加入1M,1μL的三(2-羧乙基)膦，在37℃变性还原1h。接着加入20μL的可断裂的同位素亲和标签(AB SCIEX公司，P/N:4337337)中，37℃避光反应2h。标记完毕，将蛋白溶液转移到截留分子量为10000Da的滤膜上，多次离心清洗去除过多的标记试剂和尿素。最后，加入100μL碳酸氢铵，3μg的胰蛋白酶，在37℃中酶解12h。第二天早上，离心，收集酶解后的肽段。进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定，结果如图3所示。
亲和富集牛血清白蛋白酶解产物中带有可断裂的同位素亲和标签(AB SCIEX公司，P/N:4337337)的巯基肽段：取出100μL的链霉亲和素的琼脂糖凝胶，用200μL，pH7.2的磷酸盐缓冲盐洗三次。将酶解产物进行除盐、冻干后用100μL，pH7.2的磷酸盐缓冲盐复溶后转移到链霉亲和素的琼脂糖凝胶中，室温孵育2h。分别用pH7.2的磷酸盐缓冲盐、500mM氯化钠各洗三次以去除非特异吸附。最后加入100μL，pH1.5-2的6M盐酸胍，室温孵育0.5h,将结合到链霉亲和素的琼脂糖凝胶上的巯基肽段洗脱。将洗脱得到的肽段除盐、冻干、加入76μL的三氟乙酸和4μL的试剂盒提供的断裂试剂B，37℃酸裂解2h，收集裂解后的肽段。
实施例3
复杂样品中硫巯基肽段的鉴定和定量：在300μL，50mM三羟甲基氨基甲烷,pH8.3,6M尿素,5mM乙二胺四乙酸体系中提取1×107个人神经母瘤细胞的蛋白，测得蛋白浓度后，分为两条路线进行。
路线A
取出200μg的蛋白，转移到到滤膜上。置换溶剂，加入200μL碳酸氢铵，8μg的胰蛋白酶，在37℃中酶解12h。第二天早上，离心，收集酶解后的肽段。将酶解后的肽段与碘乙酰胺聚合物微球在50mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲盐中避光反应6h。反应完毕用30％乙腈和2M氯化钠洗涤去除非特异吸附，接着加入100μL，终浓度为5mM的三(2-羧乙基)膦在37℃还原1h以释放硫巯基肽段。将100μL，还原释放得到的肽段用40μL的可断裂的同位素亲和标签(ABSCIEX公司，P/N:4337337)标记，37℃避光反应2h。将标记后的肽段除盐、冻干、加入76μL的三氟乙酸和4μL的试剂盒提供的断裂试剂B，37℃酸裂解2h。收集裂解后的肽段，进行进行液质联用质谱鉴定。将鉴定得到的肽段二级质谱信息生成参考库。
路线B
取出200μg的蛋白，加入2份的可断裂的同位素亲和标签(AB SCIEX公司，P/N:4337337)，37℃避光反应2h。标记完毕，将蛋白溶液转移到滤膜上，多次离心清洗去除过多的标记试剂和尿素。最后，加入200μL碳酸氢铵，8μg的胰蛋白酶，在37℃中酶解12h。第二天早上，离心，收集酶解后的肽段。将酶解后的肽段冻干后，加入200μL的链霉亲和素的琼脂糖凝胶溶液，室温孵育2h。分别用pH7.2的磷酸盐缓冲盐、500mM氯化钠各洗三次以去除非特异吸附。最后加入100μL，pH1.5-2的6M盐酸胍，室温孵育0.5h将结合到链霉亲和素的琼脂糖凝胶的巯基肽段和巯基肽段洗脱。将洗脱的肽段除盐、冻干后加入76μL的三氟乙酸和4μL的试剂盒提供的断裂试剂B，37℃酸裂解2h。收集裂解后的肽段，进行进行液质联用质谱鉴定，得到的肽段二级质谱信息。
将路线B鉴定到的肽段二级质谱信息与路线A生成的参考库中的肽段二级质谱信息进行比对，从中挑取含有半胱氨酸的肽段序列和带有硫巯基修饰位点信息的高匹配度的肽段，即为硫巯化肽段的定性。利用可断裂的同位素亲和标签(AB SCIEX公司，P/N:4337337)中的同位素13C和12C标签在一级质谱中的峰强度不同可实现硫巯基肽段的定量。

Claims (6)

1.一种硫巯化翻译后修饰肽段的定性与定量方法，其特征在于：分为路线A和路线B；
其中，路线A是把蛋白酶解产生的肽段与碘乙酰胺的小球进行孵育，对巯基肽段和硫巯基肽段进行富集；通过还原剂将硫巯基肽段的二硫键还原释放，进而用可断裂的同位素亲和标签标记释放下来的硫巯基肽段，最后使用裂解液将可断裂的同位素亲和标签的连接臂断裂；
路线B是用可断裂的同位素亲和标签标记含巯基和硫巯基的蛋白、蛋白酶解、亲和富集巯基肽段和硫巯基肽段，最后使用裂解液将连接在巯基肽段和硫巯基肽段上的可断裂的同位素亲和标签的连接臂断裂；
将路线A得到的肽段进行质谱鉴定, 鉴定得到的肽段二级质谱信息生成参考库；利用质谱的离子监测技术PRM（parallel reaction monitoring）对路线B得到的肽段进行质谱鉴定，将路线B鉴定得到的肽段二级质谱信息与路线A生成的参考库中的肽段二级质谱信息进行比对，从而实现对硫巯化肽段的定性与定量；
对硫巯化肽段的定性与定量的过程为，将路线B鉴定到的肽段二级质谱信息与路线A生成的参考库中的肽段二级质谱信息进行比对，从中挑取含有半胱氨酸的肽段序列和带有硫巯基修饰位点信息的高匹配度的肽段，即为硫巯化肽段的定性；利用可断裂的同位素亲和标签中的同位素13C和12C标签在一级质谱中的峰强度不同可实现硫巯基肽段的定量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的碘乙酰胺的小球的制备过程为，将碘乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯通过共价反应固载到带氨基的小球上，避光振荡3-12 h；小球的基质为硅球或者聚合物微球或者四氧化三铁磁性纳米颗粒；小球粒径在100 纳米-10微米之间。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的通过还原剂将硫巯基肽段的二硫键还原释放的过程为，使用浓度为1-100 mM的还原剂三(2-羧乙基)膦/二硫苏糖醇在pH=5-8，25-56℃下孵育30-120 min，以切除硫巯基肽段的二硫键，进而释放出肽段。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的用可断裂的同位素亲和标签标记释放下来的硫巯基肽段的过程为，在缓冲体系为50 mM 三羟甲基氨基甲烷, pH8.3, 6M尿素, 5mM 乙二胺四乙酸或者50 mM 三羟甲基氨基甲烷, pH8.3, 6M 尿素, 5 mM 乙二胺四乙酸,0.1%十二烷基硫酸钠或者50 mM碳酸氢铵, pH 8.3, 6M盐酸胍中，加入5-100 μL的可断裂的同位素亲和标签，并与释放下来的巯基肽段避光反应2-4 h，以实现肽段的标记。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的亲和富集过程为，利用链霉亲和素的琼脂糖凝胶或链霉亲和素的磁珠在浓度为0.01-0.1M，pH为7.2的磷酸盐缓冲体系中对被可断裂的同位素亲和标签标记上的巯基肽段和硫巯基肽段进行孵育30-240 min，以实现特异性捕获。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的硫巯化翻译后修饰肽段的定性与定量方法，应用于细胞或者组织或者体液蛋白质组样品中规模化硫巯化肽段的定性与定量分析。
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