KR101139355B1 - 화학적 변형을 이용한 질산화단백체의 농축 방법 및 그 키트 - Google Patents

화학적 변형을 이용한 질산화단백체의 농축 방법 및 그 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 질산화단백체의 분리 농축 방법 및/또는 그 키트에 관한 것으로, 체내에서 산화적 스트레스에 의해 발현되는 번역 후 변형과정 중 하나인 질산화가 타이로신에 일어난다는 사실을 규명하고 적은 양으로 존재하는 질산화 단백질을 펩타이드 수준에서 선택적으로 분리 농축하는 방법 및/또는 그 키트에 관한 것이다.
질산화, 분리 농축법, 타이로신

Description

화학적 변형을 이용한 질산화단백체의 농축 방법 및 그 키트{An Enrichment method of nitroproteome using chemical modification and a kit thereof}
본 발명은 질산화단백체의 분리 농축 방법 및 그 키트에 관한 것으로, 체내에서 산화적 스트레스에 의해 발현되는 번역 후 변형과정 중 하나인 질산화가 타이로신에 일어난다는 사실을 규명하고 적은 양으로 존재하는 질산화 단백질을 펩타이드 수준에서 선택적으로 분리 농축하는 방법 및 그 키트에 관한 것이다.
본 발명은 교육과학기술부의 세포응용연구사업[과제 고유번호 : SC-2120, 과제명 : 기능성 프로테오믹스를 이용한 배아줄기세포 유지 및 분화 조절인자 발굴과 기전연구]과 교육과학기술부의 프로테오믹스 이용기술개발 사업[과제 고유번호 : FPR08 A1-032, 과제명 : 단백질 수식 프로테옴 질량 분석법 확립 및 활용기술개발]의 일환으로 수행된 연구로부터 도출된 것이다.
생물시료는 수많은 단백질들이 혼합되어 존재하는 상태이며, 1차원 SDS-PAGE 또는 액체 크로마토그래피 등의 방법으로 단백질 또는 단백질을 가수분해하여 얻은 펩타이드들을 분리한 뒤에 질량 분석기를 이용하여 펩타이드의 탠덤 질량 스펙트럼을 얻는다.　
단백질 서열 데이터베이스를 사용하면, 각각의 탠덤 질량 스펙트럼에 해당되는 펩타이드의 아미노산 서열을 찾을 수 있으며, 이들을 통합 분석하면 단백질을 동정할 수 있다.　 이러한 단백질 검색 과정에는 SEQUEST®(Eng et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 5:976-989, 1994; Thermo Electron Corp.,USA), Mascot(Perkins et al., Electrophoresis, 20:3551-3567, 1999; Matrix Science Ltd., USA,http://www.matrixscience.com/search_form_select.html), Sonar(Field, H. I. et al., Proteomics, 2:36-47,2002; http://knxs.bms.umist.ac.uk/prowl/sonar/sonar_cntrl.html), X!Tandem(Craig et al.,　Bioinformatics, 20:1466-1467, 2004; Proteom Software Inc., USA), Phenyx, PeptideProphet(Keller A., et al., Anal. Chem. 2002, 74, 5383-5392), ProteinProphet(Nesvizhskii A.I., et al., Anal. Chem. 2003, 75,4646-4658), DTASelect(Tabb D. L., et al., Proteome Res. 2002, 1, 21-26) 또는 OMSSA(Syka JE, et al.,Proc Natl Acad Sci USA. 2004. Jun 29, 101(26). 9528-33) 등의 소프트웨어를 사용한다.
기존 특허에 서로 다른 동위원소로 처리된 펩타이드의 질량스펙트럼을 비교하여 단백질의 정량 분석을 수행(US2005/0233399)하는 것이 있으나 동위원소 처리에 의한 정량 분석은 동일한 수식화 상태인 단백질의 서로 다른 시료에서의 정량 분석 방법으로, 한 시료 내에서의 단백질의 서로 다른 상태의 정량 분석에는 적용할 수 없다.
표준 시료를 사용하고 특정 단백질에 표지자를 붙여서 질량스펙트럼으로 정 량 분석을 하는 것(US2006/0078960)은 특정 단백질의 정확한 정량 분석의 용도인 표준 시료의 사용으로 표준 시료와 양의 차이가 많이 나는 단백질의 분석이 어려우며, 한 단백질의 상태 분석용으로는 적합하지 않다.　
G. W. Park 등은 인간 혈장 시료와 박테리아 시료의 탠덤 질량분석에 의한 단백질 동정 결과를 1차원 SDS-PAGE에서의 밴드 위치와 비교하여 단백질 동정 결과를 확인하였으나(G. W. Park, et al., Proteomics, 2006, 6,1121-1132) 이는 각 단백질에서 SDS-PAGE 에서의 밴드 위치 중에 가장 많은 펩타이드가 검출된 밴드만을 고려하였다.
한편, 질산화는 번역 후 변형(Post Translational Modifications) 과정의 하나로 타이로신의 3번 위치에 NO2가 붙는 현상을 말한다. 이 질산화는 특별히 몇 번의 화학 반응을 통해서 이루어지게 되는데 이 반응에서 ONOO-(peroxynitrite)가 중요한 역할을 한다. ONOO-는 NO·(nitric oxide)와 O2·-(superoxide anion)의 결합에 의해 형성된다. 먼저 NO·는 아미노산 중 하나인 arginine으로부터 NADPH와 같은 보조인자의 존재 하에서 nitric oxide synthase(NOS)의 영향으로 형성된다. 이 NO·가 체내에서 있는 O2·-, 일종의 활성산소와 반응하면 ONOO-를 형성하게 된다.
이러한 경로로 발생하는 질산화는 그 양이 극소량이다. 질산화를 연구하는 각 연구팀에 따라 100pmol/mg 정도의 농도로 존재한다고 주장하는 연구팀도 있고 10,000개의 tyrosine 중 1-5개(1개의 단백질에 평균 tyrosine은 약 3.2% 존재) 정 도 질산화가 되어있다고 주장하는 등 각 연구팀에 따른 견해가 나뉘고 있다. (Protein and lipid nitration: Role in redox signaling and injury, Rubbo H et al., Biochim Biophys Acta, 1318-24, 2008).
이와 같이 극소량 존재하는 질산화는 그 양에 비해 체내에서 생화학적, 의학적으로 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 질산화와 관련된 명확한 발병 원인이 밝혀지진 않았지만 산화적 스트레스 관련 질병, 특히 뇌졸중, 급성 호흡기 질환, 천식 등에 연관되어 있으며 노화와 퇴행성 신경질환에 관련하여 알츠하이머병, 파킨슨병, 루게릭병에 연관되어 있다. 그밖에 미토콘드리아 단백질의 질산화를 매개로 한 미토콘드리아 기능 상실에 의한 당뇨, 만성 염증반응을 통한 암의 발생 그리고 다양한 세포 안에서의 신호전달 기작에도 영향을 끼치고 있다(Chronic inflammation and oxidative stress in human carcinogenesis., Federico A et al., Int. J. Cancer., 2381-86, 2007).
특별히 질산화는 인산화와 같은 아미노산을 두고 경쟁을 하기 때문에 더욱 중요한 의미를 갖는다.(Protein Tyrosine Nitration: Selectivity, Physicochemical and Biological Consequences, Denitration, and Proteomics Methods for the Identification of Tyrosine-Nitrated Proteins., Abello N et al., J Proteome Res., 3222-38, 2009).
질산화는 앞에 열거된 질병들의 생체표지 인자이기 때문에 이러한 질산화 단백질의 조기 발견이 질병 치료에 있어서 중요하다. 하지만 분석하기에 그 양이 적기 때문에 획기적인 농축(enrichment) 방법이 필요 되고 있다. 최근까지도 발표되 고 있는 연구 자료들은 대부분이 웨스턴 블랏이나 면역학적 분석법을 사용한 자료들이다. 따라서 질산화 유무 판별은 가능하지만 직접적인 질산화 단백질이나 그 위치를 찾기에는 어려운 부분이 있는 것이 사실이다. 본 발명자들은 질량분석기를 사용하여 질산화가 일어난 단백질과 그 위치를 찾을 수 있는 방법을 고안하였다.
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 질산화 단백질의 선택적인 분리 농축 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 질산화 단백질의 선택적인 분리 농축용 키트를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a) 단백질을 펩타이드화를 시키는 단계; b) 상기 펩타이드를 아세틸화시키고, 아세틸화된 질산화 펩타이드를 환원시키는 단계; c) 상기 환원된 펩타이드를 퍼플루오린화 시키는 단계; d) 퍼플루오린화 된 펩타이드를 선택적으로 분리하는 단계를 포함하며, 상기 각 단계에서 생성된 결과물을 질량분석기를 사용하여 확인하는 것을 특징으로 하는 질산화 된 펩타이드를 선택적으로 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체 예에 있어서 상기 펩타이드화 과정에서는 단백질 가수분해 효소를 사용하는 것이 바람직하고 상기 단백질 가수분해 효소는 트립신인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 실시 예에서, 상기 퍼플루오린화된 펩타이드를 선택적으로 분리하는 단계는 퍼플루오린화 된 실리카 입자에 의하여 수행되는 것이 바람직하고,
상기 실리카 입자는 탄소 사슬에 플루오린 원자가 붙어있는 실리카 입자인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명의 일 구체 예에 있어서, 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸화 된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 a)단백질 분해효소;b)실리카 입자; 및 c) 펩타이드의 아미노기를 불록킹화하는 화합물을 유효성분으로 하는 질산화된 펩타이드를 선택적으로 분리하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 단백질 분해효소는 트립신인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 실리카 입자는 퍼플루오린화된 실리카 입자인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 펩타이드의 아미노기를 불록킹화하는 화합물은 설포-NHS-아세테이트, NHS-benzoate, NHS-propionate, 또는 NHS-butylate인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 키트는 환원제를 더욱 포함하는 것이 바람직하고 상기 환원제는 sodium hydrosulfite, 또는 sodium borohydride인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 키트는 퍼플루오린화제를 더욱 포함하는 것이 바람직하고 상기 퍼플루오린화제는 N-succimidyl 3-perfluorohexyl propinate, 또는 N-succimidyl 3-perfluorooctyl propinate인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 키트는 질산화된 단백질에 사용되는 것 이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 키트는 상기 구성성분 이외에도 SDS-PAGE 방법을 사용하기 위한 각종 시약 및/또는 전기영동 결과를 시각화할 수 있는 예를 들어 쿠마시블루 염색용 시약 및/또는 사용자 설명서 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 1차원 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis)는 단백질에 SDS(sodium dodecyl sulphate)를 사용하여 단백질의 분자량에 대한 전하의 비율을 일정하게 만든 다음 폴리아크릴아마이드젤 (polyacrylamide gel)을 사용한 전기영동으로 분자량에 따라 단백질을 분리하는 방법이다.
본 발명에서 사용된 '질량 분석법'이란 용어는 1차원 SDS-PAGE 또는 액체 크로마토그래피 등의 방법으로 단백질 또는 단백질을 가수분해하여 얻은 펩타이드들을 분리한 뒤에 질량 분석기를 이용하여 펩타이드의 탠덤 질량 스펙트럼을 얻는다.　이 스펙트럼을 단백질 서열 데이터베이스에 적용시키면, 각각의 탠덤 질량 스펙트럼에 해당되는 펩타이드의 아미노산 서열을 찾을 수 있으며, 이들을 통합 분석하여 단백질을 동정하는 것을 의미한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서는 단백질의 특정 타이로신에 질산화가 일어난다는 것을 밝혀내기 위해 적은 양으로 존재하는 질산화 단백질을 펩타이드 수준에서 분리 농축하기 위한 방법을 개발하고자 하였다. 이를 통해 질산화 단백질의 종류와 그 단백질 주변 환경 그리고 질환과의 관계를 밝힘으로써 신약개발과 진단 등에 유용하게 사용 할 수 있는 정보 획득이 가능할 것으로 생각된다.
생체내의 질산화된 단백질의 양의 매우 적기 때문에 그 종류에 대한 정확한 정보가 부족하기 때문에 정확한 분석을 위해서는 실제 생체 시료에서 질산화되지 않은 단백질 혹은 펩타이드를 제거하여 순수하게 질산화 펩타이드만을 분리할 수 있어야만 한다.
이러한 목적을 위하여 질산화된 타이로신 잔기만을 선택적으로 변형하여 반응성이 있는 물질로 만들고 이 물질에 질산화되지 않은 펩타이드와는 구별되는 태그를 붙여줌으로써 궁극적으로 질산화된 타이로신을 포함하는 펩타이드만을 선별적으로 분리하고자 하였다.
질산화된 잔기만을 선택적으로 변형하는 방법으로 반응성이 낮은 질산기를 반응성이 높은 아민기로 환원시키는 방법을 사용하였고 아민기의 선별적인 반응성을 이용하여 분리 가능한 플루오린 태그를 붙여 퍼플로오린화 펩타이드 형성을 유도하고 이 후 친화성 크로마토그래피를 통해 질산기를 포함하는 펩타이드만을 선택적으로 분리할 수 있도록 하였다.
또한 이렇게 분리, 농축된 시료를 질량분석기를 사용하여 분석하였기 때문에 정확한 질산화 위치와 양을 분석할 수 있다는 장점을 갖는다.
본원에 기재된 본 발명은, 달라질 수 있는 것으로 기재된 특정 방법, 프로토콜 및 시약으로 한정되지 않는 것으로 고려된다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 기술하기 위한 것일 뿐이며 어떠한 식으로든지 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아닌 것으로 이해된다.
달리 정의하지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 당업계의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본 발명을 실시 또는 시험하는데 있어서 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료를 사용할 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 재료를 이하에 기재한다.
본 발명의 실시에 있어서, 분자생물학 및 세포생물학의 다수의 통상의 기술을 사용한다. 이들 기술은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II and III, 1997 (F. M. Ausubel ed.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.]에 설명되어 있다.
본 발명의 방법은 극소량으로 존재하는 질산화 된 단백질을 선택적으로 분리 농축하여 질산화 된 단백질과 질환과의 관계, 다른 단백질과의 상호작용, 질산화 관련 대사 경로 등을 밝힘으로 각 질병에 대한 신약개발과 진단 등에 유용하게 쓰일 수 있는 정보의 확보가 가능할 것이다.
이하, 비한정적인 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시 예는 본 발명을 설명하기 위한 것이지 본 발명의 범위가 하기 실시 예에 의하여 제한되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
실시 예 1: 소혈청유래 알부민( BSA )과 간암세포( Huh7 )의 트립신을 이용한 펩타이드 화 과정
BSA를 변성시켜 약한 수소 결합들을 끊어 주기 위해 50mM 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate) 50㎕에 녹이고 5분간 끓여준 뒤 상온에서 식힌다. 단백질은 이황화결합들로 연결되어있기 때문에 최종 농도가 5mM이 되도록 하여 다이티오쓰레이톨(dithiothreitol, DTT)을 넣어주고 60℃에서 30분간 반응시킨다. 앞선 반응에 의해 끊어진 -SH기가 다시 서로 붙지 못하게 하기 위해 50mM 아이오도아세트아마이드(iodoacetamide)를 어둠 속에서 30분간 반응시켜 -SH에 알킬레이션을 한다. 단백질을 가수분해하기 위해 trypsin을 단백질과 적절한 비율로 넣어주고 37℃에서 12시간 동안 반응시키고 spin column을 이용하여 염을 제거하였다.
간암세포는 SDS-PAGE 방법을 사용하였고 트립신을 이용하여 펩타이드화 하였다. 젤은 4-12% 비스 트리스 젤을 사용하였고 쿠마시블루 염색을 통해 젤 안에 있는 단백질을 염색하였고 젤은 가로, 세로 1mm 크기로 잘라서 탈색, 탈수과정을 거쳐 트립신을 사용하여 젤 안에 있는 단백질을 가수분해 하고 이후 펩타이드 회수과정을 통해 가수분해된 펩타이드를 수득한다. 이 펩타이드는 sep pak을 이용하여 염을 제거하였다.
실시 예 2: 펩타이드의 아세틸화 및 질산기의 환원
질산화 단백질을 분리하기 위해서는 퍼플루오린 태그를 붙이는 과정이 필요 하다. 이 태그는 아민과 반응하기 때문에 비특이적 결합을 방지하기 위해 라이신의 ε-아민과 N-말단을 아세틸화해야 한다. 100mM HEPES(pH 8.2) 100㎕에 펩타이드를 녹이고 sulfo-NHS-acetate를 펩타이드 몰수의 15배 과량으로 넣어 상온에서 30분간 반응시켰다.
이 후, 켄칭(quenching) 과정을 거치는데 이것은 NaOH를 사용하여 pH를 14까지 급격히 높인 뒤 15분 후에 다시 HCl을 사용하여 pH를 중성으로 낮춰주면 각 아미노산 작용기의 pka 값 때문에 비특이적으로 결합한 아세틸기를 떨어뜨릴 수 있다. 반응이 끝난 펩타이드는 ziptip을 통해 탈염과정을 거친 뒤 건조시켰다.
환원 반응은 질산화가 일어난 타이로신의 질산기를 태그가 붙을 수 있는 형태인 아민으로 변환시키는 과정이다. 아세틸화된 펩타이드(nitro-AngII, 질산화 안지오텐신 II)를 100 mM HEPES(pH 8.2) 100㎕에 녹이고 소듐 다이사이오나이트(soduim di-thio--nite, Na2S2O4)를 펩타이드 몰수의 500배 과량으로 넣어 상온에서 30분간 반응시켰다. 이 후 탈염과정을 거치고 건조시켰다.
실시 예 3: 펩타이드의 퍼플루오린화
아민화된 AngII를 플루오린화 시키기 위하여 시료를 pH 8.5 소듐 바이카보네이트(sodium bicarbonate) 50㎕에 녹이고 N-succimidyl 3-perfluorobutyl propinate를 아세토나이트릴(acetonitrile, ACN)에 250mM이 되게 하여 녹이고 시료와 섞어주고 상온에서 2시간 반응시킨 뒤 건조시켰다. 반응하고 남아있는 시약을 제거해주기 위하여 건조된 시료에 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran, THF)를 넣어 혼합시켜주고 원심분리를 통해 상층액을 제거하고 다시 건조시켰다. 아세틸화 반응과 마찬가지로 비특이적인 퍼플루오린화를 방지하기 위하여 켄칭(quenching) 과정을 거친 뒤 건조시켰다.
실시 예 4: 퍼플루오린화된 펩타이드의 분리
퍼플루오린화된 펩타이드는 플루오린 고체상 추출법(fluorous solid phase extraction, FSPE), 일종의 친화성 크로마토그래피를 이용하여 분리한다. 먼저 크기가 40㎛인 퍼플루오린화 된 실리카 입자 5밀리그램을 spin column에 넣은 후 80% 메탄올을 10mM 암모늄 포르메이트(ammonium formate)를 이용하여 만든 활성화 용액(activation buffer)을 200㎕ 넣고 원심분리를 하였다. 이때 원심분리 속도는 1500rcf로 1분 동안 하고 이 과정을 두 번 반복한다. 플루오린화된 펩타이드가 실리카 입자에 붙을 때와 비슷한 환경을 만들어주기 위해 평형화 용액(equilibration buffer)을 200㎕ 넣어주었다. 이 용액의 조성은 30% 메탄올을 10mM 암모늄 포르메이트(ammonium formate)를 이용하여 만들었다. 이 과정역시 앞에서와 같은 원심분리 조건과 반복 횟수를 갖는다.
평형화 과정 이후 평형화 용액에 녹인 시료를 역시 마찬가지 방법으로 spin column에 흘려줌으로써 퍼플루오린화된 AngII가 실리카 입자에 붙을 수 있게 하였다. 이 후 평형화 용액과 같은 조성의 용액으로 실리카 입자에 비특이적으로 결합한 퍼플루오린화되지 않은 펩타이드들을 제거해 주었다. 원심분리 조건은 동일하고 10회 반복 실시한다. 마지막으로 실리카 입자와 플루오린-플루오린 상호작용으로 붙어있는 퍼플루오린화된 AngII는 100% 메탄올을 column 안에 넣어주고 원심분리 해줌으로써 수득할 수 있었다. 이후 FSPE 자체가 탈염과정의 기능 또한 갖고 있기 때문에 별도의 탈염과정을 거치지 않고 MALDI-TOF, ESI-IT-MS로 분석하였다.
실시 예 5: 질량분석기를 사용한 데이터 분석
질량분석은 Autoflex III MALDI-TOF/TOF(Bruker Daltonics, Germany)와 LTQ-ion-trap mass spectrometry (Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA)를 이용하여 수행하였다. 우선 AutoFlex III를 이용한 경우 이온화를 위하여 Smart beam laser를 사용하였고 메트릭스로 알파-시아노-4-하이드록시시나믹 산(a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA) 1mg/ml을 사용하였다. 30% 아세토나이트릴, 0.1% TFA를 포함하는 70% 물을 이용하여 메트릭스를 만들어 사용하였다. 건조된 상태의 시료에 이 메트릭스 용액 1㎕를 넣어 녹인 뒤 MALDI 타겟 위에 점적화 한 후 상온에서 건조하였으며 MALDI는 positive 이온, reflector 모드, 19kV accelerating voltage, 50 Hz repetition rate 등의 기본적인 설정 값을 사용하여 기기를 작동하였고 모든 분석은 평균 1000번 정도의 레이저 샷으로 부터 얻은 스펙트럼을 이용하였다.
LTQ-IT-MS를 사용한 경우는 우선 액상 크로마토그래피(Liquid Chromatography) 조건은 다음과 같다.
용액A의 0.1% 포름산(formic acid)이 섞여있는 100% 물이고 용액B의 조성은 0.1% 포름산이 섞여 있는 100% 아세토나이트릴이다. 용액A와 B의 혼합에 의해 농도구배를 이루어 질량분석기 안으로 들어가게 되는데 그 농도 구배는 10분까지는 97% 용액A, 이 후 35분까지는 60% 용액 B, 이 후 45분까지는 100% 용액B, 이후 60분까지는 다시 97% 용액A로 해줘서 전체 작동시간은 60분이며 유속은 0.2ul/min으로 한다. 스프레이가 되는 미세관은 내경이 75㎛이고 길이는 12cm인 것을 사용하고 이 관 안에 C18 입자를 충진해서 사용하며 스프레이가 될 때 걸리는 전하는 2.0kV이고 MS/MS를 위해 35% 충격 에너지(collision energy)를 사용하였다.
LTQ-IT-MS로 얻은 결과를 분석하기 위해 서치도구로 SEQUEST(Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA)를 사용하였고 데이터베이스는 the National Center for Biotechnology Information database(NCBI, Bethesda, MD, USA) human reference 데이터베이스를 사용하였다.
실시 예 6: 질량분석법을 통한 분석 결과의 해석
가) 질산화 펩타이드가 퍼플루오린화 되기 전까지 있는 화학반응 단계에서 정상적으로 반응이 이루어졌는지를 확인하기 위하여 위에서 설명한 각 실험단계별로 생성된 결과물을 MALDI-TOF를 이용하여 확인하였다.
(도 2)의 a)는 AngII와 nitro-AngII의 피크(각각 m/z 1046.3, m/z 1092.4)를 보여주는 스펙트럼이고 b)는 아세틸화 반응이 종결되었을 때의 결과(각각 m/z 1088.1, m/z 1134.2), c)는 질산기를 아민기로 치환시키는 환원단계로 질산기를 포함하는 nitro-AngII만 m/z 1134.2에서 m/z 1104.2로 변하는 것을 볼 수 있다. d)는 퍼플루오린화 반응 단계이며 반응에 참여할 수 있는 아민기가 있는 nitro-AngII만 m/z 1104.2에서 m/z 1379.0로 피크가 변하는 것을 확인할 수 있다.
나) 퍼플루오린화 된 실리카 입자를 이용하여 퍼플루오린화 된 nitro-AngII를 분리한 후 스펙트럼을 얻었다.(도 3) a) AngII와 퍼플루오린화 된 AngII 펩타이드 혼합물의 스펙트럼이고 b)는 퍼플루오린화 된 실리카 입자와 반응하지 못한 펩타이드들의 스펙트럼(m/z 1088.1), c) 세척과정에서 실리카 입자와 비특이적으로 결합했던 퍼플루오린화 되어있지 않은 AngII 펩타이드가 제거됨을 확인할 수 있다.(m/z 1088.1) d)는 실리카 입자와 플루오린-플루오린 상호작용에 의해 붙어있던 퍼플루오린화 된 nitro-AngII가 메탄올에 의해 용출되어 나옴을 확인 할 수 있다.(m/z 1379)
다) BSA 단백질을 트립신을 사용하여 가수분해한 펩타이드 혼합물 속에 nitro-AngII 펩타드를 혼합한 뒤 선택적으로 질산화 펩타이드만 분리됨을 확인하였다. (도 4) a)는 BSA 펩타이드와 nitro-AngII 펩타이드 혼합물의 스펙트럼으로 는 nitro-AngII를 표시하고 나머지 피크는 BSA 유래 펩타이드를 나타낸다. b) 플루오린 고체상 추출법(Fluorine Solid Phase Extraction, FSPE)을 이용하여 BSA 유래 펩타이드들은 제거되고 순수하게 퍼플루오린화 된 nitro-AngII 스펙트럼(m/z 1378.6)만 얻었다. 이를 통해 복잡한 혼합물 속에 묻혀있던 질산화 펩타이드도 분리가 가능함을 확인하였다.
라) (표 1)은 간암세포(Huh7)에서 질산화 되어있는 펩타이드를 분리 농축과정을 통해 확인한 질산화 펩타이드 리스트이다. (표 1)에서 보이는 펩타이드 리스 트는 SEQUEST 서치결과를 토대로 각각의 스펙트럼의 MS/MS 패턴을 전부 확인하는 방식으로 확인하였다. [@, perfluorination(mass shift of +274 Da) on tyrosine; ^, acetylation(mass shift of +42 Da) on lysine; ], acetylation(mass shift of +42 Da) on N-terminal; #, oxidation(mass shift of +16 Da) on methionine; *, alkylation(mass shift of +56 Da) on cystein]
Figure 112009071202465-pat00001
도 1은 퍼플루오린화 펩타이드의 형성과정의 화학반응 상세도를 나타낸 그림이다.
도 2는 질산화 펩타이드의 퍼플루오린화 과정을 스펙트럼으로 나타낸 그림이다.
도 3은 퍼플루오린화 된 펩타이드의 선택적 분리 결과를 나타낸 그림이다.
도 4는 BSA 펩타이드와 nitro-AngII 혼합물에서 nitro-AngII 만의 선택적으로 분리 결과를 나타낸 그림이다.
도 5는 간암세포에서 분리한 질산화 펩타이드 중 LTQ-IT-MS를 통해 확인한 대표적인 MS/MS 스펙트럼이다.

Claims (15)

  1. a) 질산화된 단백질에 대하여 펩타이드화를 시키는 단계;
    b) 상기에서 얻어진 질산화 펩타이드를 아세틸화시키고, 아세틸화된 질산화 펩타이드를 환원시키는 단계;
    c) 상기 환원된 펩타이드들을 퍼플루오린화 펩타이드로 만들고 이를 수득하는 단계; 및
    d) 상기 퍼플루오린화된 펩타이드를 선택적으로 분리하는 단계를 포함하며,
    상기 각 단계에서 생성된 결과물을 질량 분석법을 이용하여 확인하는 질산화된 펩타이드를 선택적으로 분리하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 펩타이드화는 단백질 분해효소에 의하여 얻는 것을 특징으로 하는 질산화된 펩타이드를 선택적으로 분리하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 단백질 분해효소는 트립신인 것을 특징으로 하는 질산화된 펩타이드를 선택적으로 분리하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 퍼플루오린화된 펩타이드를 선택적으로 분리하는 단계는 실리카 입자에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 질산화된 펩타이드를 선택적으로 분리하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 실리카 입자는 플루오러스 클로로실레인(fluorous chlorosilane)과 반응시켜 얻은 퍼플루오린화된 실리카 입자인 것을 특징으로 하는 질산화된 펩타이드를 선택적으로 분리하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸화된 것을 특징으로 하는 질산화된 펩타이드를 선택적으로 분리하는 방법.
  7. a)단백질 분해효소;
    b)실리카 입자;
    c) 펩타이드의 아미노기를 불록킹화하는 설포-NHS-아세테이트 화합물; 및
    d) N-석시미딜(succimidyl) 3-퍼플루오로 프로피네이트(perfluorohexyl propinate), 및 N-석시미딜 3-퍼플루오로옥틸 프로피네이트로 구성된 군으로부터 선택된 퍼플루오린화제를 유효성분으로 포함하는 질산화된 펩타이드를 선택적으로 분리하기 위한 키트.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 단백질 분해효소는 트립신인 것을 특징으로 하는 질산화된 펩타이드를 선택적으로 분리하기 위한 키트.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 실리카 입자는 퍼플루오린화된 실리카 입자인 것을 특징으로 하는 질산화된 펩타이드를 선택적으로 분리하기 위한 키트.
  10. 삭제
  11. 제 7항에 있어서, 상기 키트는 환원제를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 질산화된 펩타이드를 선택적으로 분리하기 위한 키트.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 환원제는 소디움 하이드로설파이트(sodium hydrosulfite), 또는 소디움 보로하이드라이드(sodium borohydride)인 질산화된 펩타이드를 선택적으로 분리하기 위한 키트.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제 7항에 있어서, 상기 키트는 질산화된 단백질에 사용되는 것을 특징으로 하는 질산화된 펩타이드를 선택적으로 분리하기 위한 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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J. Proteome Res., Vol. 6, No. 4, pp. 1492~1499 (2007)
J. Proteome Res., Vol. 6, No. 6, pp. 2257~2268 (2007)
Nat. Biotechnol., Vol. 23, No. 4, pp. 463~468 (2005)

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