CN114609306A - 非抗体依赖的泛素化修饰富集方法和检测方法 - Google Patents
非抗体依赖的泛素化修饰富集方法和检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114609306A CN114609306A CN202210220908.8A CN202210220908A CN114609306A CN 114609306 A CN114609306 A CN 114609306A CN 202210220908 A CN202210220908 A CN 202210220908A CN 114609306 A CN114609306 A CN 114609306A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- sample
- ubiquitination
- modification
- reagent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 title claims abstract description 78
- 230000004048 modification Effects 0.000 title claims abstract description 59
- 238000012986 modification Methods 0.000 title claims abstract description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 81
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 81
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 31
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 27
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims abstract description 16
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims abstract description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 claims abstract description 12
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 59
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 54
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 claims description 31
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 30
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 23
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 23
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 23
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 22
- 101000939517 Homo sapiens Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 2 Proteins 0.000 claims description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 18
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 18
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 101000607872 Homo sapiens Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 21 Proteins 0.000 claims description 11
- 101000807540 Homo sapiens Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 25 Proteins 0.000 claims description 11
- 102100029643 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 2 Human genes 0.000 claims description 11
- 102100037179 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 25 Human genes 0.000 claims description 10
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 10
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 10
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 9
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 9
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 9
- 239000012042 active reagent Substances 0.000 claims description 9
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 9
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 9
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 9
- ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N butyric aldehyde Natural products CCCC=O ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 9
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 claims description 9
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 9
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 8
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 8
- 108091034406 USP family Proteins 0.000 claims description 7
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 claims description 7
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 claims description 7
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N Propionic aldehyde Chemical compound CCC=O NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 101000607909 Homo sapiens Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100039865 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 4
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 claims description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 4
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 4
- RBZRMBCLZMEYEH-UHFFFAOYSA-N 1h-pyrazol-1-ium-1-carboximidamide;chloride Chemical compound Cl.NC(=N)N1C=CC=N1 RBZRMBCLZMEYEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 claims description 3
- 108010086291 Deubiquitinating Enzyme CYLD Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 claims description 3
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 3
- IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N acetaldehyde Chemical compound [14CH]([14CH3])=O IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N 0.000 claims description 3
- YHASWHZGWUONAO-UHFFFAOYSA-N butanoyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OC(=O)CCC YHASWHZGWUONAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 claims description 3
- 108090001092 clostripain Proteins 0.000 claims description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 claims description 3
- 229940055729 papain Drugs 0.000 claims description 3
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 3
- WYVAMUWZEOHJOQ-UHFFFAOYSA-N propionic anhydride Chemical compound CCC(=O)OC(=O)CC WYVAMUWZEOHJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HGBOYTHUEUWSSQ-UHFFFAOYSA-N valeric aldehyde Natural products CCCCC=O HGBOYTHUEUWSSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 2
- 101000721382 Homo sapiens OTU domain-containing protein 3 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000809243 Homo sapiens Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 10 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000841471 Homo sapiens Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 15 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000644815 Homo sapiens Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 16 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000607865 Homo sapiens Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 20 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000748141 Homo sapiens Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 32 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000809257 Homo sapiens Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 4 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000643890 Homo sapiens Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 5 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000643895 Homo sapiens Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 6 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000841466 Homo sapiens Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 8 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100025196 OTU domain-containing protein 3 Human genes 0.000 claims description 2
- 101150020913 USP7 gene Proteins 0.000 claims description 2
- -1 USP9x Proteins 0.000 claims description 2
- 102100038426 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 10 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100029164 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 15 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100039920 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 20 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100039918 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 21 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100038463 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 4 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100021017 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 5 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100021015 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 6 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100021013 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 7 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100029088 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 8 Human genes 0.000 claims description 2
- 108700011958 Ubiquitin-Specific Peptidase 7 Proteins 0.000 claims description 2
- 229940126752 Ubiquitin-specific protease 7 inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 claims description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 claims description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 claims 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 17
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 abstract description 8
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 19
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 12
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108010093668 Deubiquitinating Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 102000001477 Deubiquitinating Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 239000011665 D-biotin Substances 0.000 description 9
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 9
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 8
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 6
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 5
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 5
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N 0.000 description 4
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 4
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 4
- DTLVBHCSSNJCMJ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-[2-[2-[2-[2-[5-(2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanoylamino]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]propanoate Chemical compound S1CC2NC(=O)NC2C1CCCCC(=O)NCCOCCOCCOCCOCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O DTLVBHCSSNJCMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 3
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 101001057508 Homo sapiens Ubiquitin-like protein ISG15 Proteins 0.000 description 2
- 102100031911 NEDD8 Human genes 0.000 description 2
- 108700004934 NEDD8 Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 102100027266 Ubiquitin-like protein ISG15 Human genes 0.000 description 2
- 108010005705 Ubiquitinated Proteins Proteins 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000721404 Homo sapiens Ubiquitin thioesterase otulin Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101001018085 Lysobacter enzymogenes Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100025187 Ubiquitin thioesterase otulin Human genes 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 125000004177 diethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000005014 ectopic expression Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000002608 ionic liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 239000012070 reactive reagent Substances 0.000 description 1
- 230000015909 regulation of biological process Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
- G01N2030/067—Preparation by reaction, e.g. derivatising the sample
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明公开了一种非抗体依赖的蛋白质泛素化修饰富集方法，包括全蛋白质提取、蛋白水平自由氨基完全封闭、底物蛋白上泛素链水解、含有可富集标签试剂标记泛素化修饰位点处的自由氨基、蛋白质的酶切、标记的泛素化修饰肽段的富集。本发明还涉及检测方法，即对富集后的泛素化修饰肽段通过液相‑质谱检测。本发明不需要利用抗体识别酶切后产生的泛素残留基序，即可实现蛋白质泛素化修饰的无差别富集及鉴定。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种非抗体依赖的泛素化修饰富集方法和检测方法。
背景技术
蛋白质翻译后修饰在生物应对各种刺激并快速准确地调控生物过程中发挥重要作用。泛素化是一种广泛存在的可逆蛋白质翻译后修饰，它能调节底物蛋白的多种基本特征，包括稳定性、活性或定位等。泛素是真核生物中一种高度保守的含有76个氨基酸的小蛋白质。泛素的C端甘氨酸通过E1-E2-E3级联反应与底物蛋白上赖氨酸残基共价连接，同时该过程可由去泛素化酶逆转。单个泛素分子修饰底物蛋白上的单个赖氨酸残基，可形成单泛素化修饰。多个泛素分子修饰底物蛋白上的多个赖氨酸残基，可形成多泛素化修饰。由于泛素分子本身含有7个赖氨酸残基(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)，已经共价修饰到底物蛋白上的泛素分子自身携带的7个赖氨酸残基还可继续被其他泛素分子共价修饰，形成泛素链。此外，泛素分子蛋白N端的甲硫氨酸也有一个自由的氨基(M1)，该氨基也可被其他泛素分子共价修饰，形成线性泛素链。因此，细胞中可存在单泛素化、多泛素化以及8类不同形式的同质泛素链修饰。如果一个泛素链上结合泛素本身不同的赖氨酸残基，形成混合或分支泛素链，则会进一步增加泛素链连接类型的复杂性。不同连接类型的泛素链被具有不同泛素结合域的效应蛋白识别，介导不同的信号通路。另外，泛素化修饰的动态变化控制着许多重要的生物过程，如细胞分裂、命运调控和迁移等。泛素化酶的功能或调控异常导致蛋白质泛素化修饰水平紊乱与多种疾病密切相关，如癌症、神经退行性变等。泛素化蛋白质及其修饰位点的鉴定是研究泛素化修饰发挥何种生物功能的先决条件。因此，深度覆盖的蛋白质泛素化修饰分析对研究其发挥生物学功能的分子机制具有重要意义。目前，基于质谱的蛋白质组学是研究蛋白质翻译后修饰非常有效的方法但是，蛋白质泛素化修饰底物由于含量较低，难以进行直接分析。为了提高蛋白质泛素化修饰底物的鉴定灵敏度和覆盖度，研究人员开发了一系列的富集方法对泛素化修饰蛋白质或肽段进行富集，如利用泛素结合结构域(UBDs)、泛素异位表达(Ectopic Expression)以及稳定的标记泛素交换体系(StableTagged Ubiquitin Exchange,StUbEx)对泛素化蛋白质或肽段进行富集，但是这些富集策略难以提供泛素化修饰位点的准确信息或样品适用类型狭窄。由于泛素化修饰蛋白质经胰蛋白酶水解后，泛素化修饰位点会残留双甘氨酸修饰的赖氨酸(K-ε-GG)，因此通过抗K-ε-GG泛抗体富集及质谱分析可实现泛素化修饰位点准确鉴定。该实验策略已广泛应用于泛素化修饰组学研究(然而泛素样蛋白质NEDD8和ISG15修饰底物的胰蛋白酶水解肽也含有K-ε-GG结构，因此抗K-ε-GG泛抗体难以将泛素化修饰肽段与泛素样蛋白质的修饰肽段进行区分。Vyacheslav等使用胞内蛋白酶Lys-C对蛋白质进行酶切后，泛素化修饰位点残留十三个氨基酸修饰的赖氨酸(K-ε-ESTLHLVLRLRGG)，避免了泛素样蛋白质NEDD8和ISG15修饰底物的干扰。然而，泛素化位点上残留的十三个氨基酸长度较长，会影响质谱对蛋白质泛素化位点的有效鉴定。另外，抗体对底物序列识别具有偏好性，不同批次抗体特异性存在差异，抗体富集方法成本也较高。因此，建立一种非抗体依赖的富集方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种非抗体依赖的蛋白质泛素化修饰富集方法。
实现上述目的技术方案包括如下。
一种蛋白质泛素化修饰富集方法，包括以下步骤：
S1、从待检测生物样品中提取获得全蛋白质样品；
S2、利用化学修饰方法对释放出来的全蛋白质样品中自由氨基进行封闭，得底物蛋白；
S3、对封闭后的底物蛋白进行上泛素链水解：底物蛋白中加入去泛素化家族酶,进行酶切，得到泛素化位点修饰处赖氨酸的ε氨基暴露的S3样品；
S4、用含有可富集标签试剂标记泛素化修饰赖氨酸的ε-氨基位点，得到S4样品；
S5、对S4样品进行蛋白水解酶进行酶切，得到S5样品；
S6、对应S4中可富集标签的方式，将S5样品中标记的泛素化修饰肽段进行富集。
本发明的另一目的是提供一种蛋白质泛素化的检测方法。
一种蛋白质泛素化的检测方法，包括按照上述方法得到富集后的泛素化修饰肽段，使用液相-质谱联用技术对富集的泛素化修饰肽段进行检测。
在其中一些实施例中，所述USP家族酶的用量为底物蛋白的1/50-1/500(质量比)，25℃-45℃条件下，酶切1-12h。
在其中一些实施例中，所述去泛素化家族酶包括USP家族酶，CYLD去泛素化酶，或OTUD3，或vOTU。
进一步地，所述USP家族酶包括USP1、USP2、USP4、USP5、USP6、USP7、USP8、USP9x、USP10、USP15、USP16、USP20、USP21、USP25、USP27x、USP28中的一种或多种。
在其中一些实施例中，所述全蛋白质样品提取包括：利用7-9M尿素或3-5％SDC(脱氧胆酸钠)或5-7M GuaHCl(盐酸胍)裂解液重悬待检测样品，然后再通过超声进一步裂解并释放细胞或组织中全蛋白，离心后取上清，即得。
在其中一些实施例中，S2步骤中：在全蛋白质样品中加入浓度为10-200mM的氨基活性试剂，加入浓度为5-100mM的氰基硼氢化钠，在16℃-80℃条件下，封闭0.25-12h，得到底物蛋白。
在其中一些实施例中，S4步骤中：在S3样品中加入浓度为5mM-50mM含有可富集标签的试剂，在16℃-80℃条件下，标记0.25-12h，利用超滤管或者分子排阻色谱对标记后样品中残留反应试剂进行去除，得到样品D；
在其中一些实施例中，S5步骤中：向S4样品中加入蛋白质水解酶，酶的用量为蛋白质的1：20-1：200，在16℃-45℃条件下，酶切2-24h，得到S5样品；所述蛋白质水解酶优选为胰蛋白酶trypsin、梭菌蛋白酶Arg-C、蛋白内切酶Glu-C、金属蛋白质内切酶Lys-N、胰凝乳蛋白酶chymotrypsin、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、胃蛋白酶中的一种或一种以上。
可富集标签的试剂例如NHS-SS-Biotin，NHS-Biotin，NHS-PEG4-Biotin。
在其中一些实施例中，S6步骤中：向S5样品中加入10μL-100μL可对富集标签进行富集的材料(例如链霉亲和素基质材料，如链霉亲和素凝胶球，链霉亲和素磁珠)，孵育0.5-12h，得到结合修饰肽段的材料，利用洗脱液将富集的肽段从材料上洗脱下来，即得。
在其中一些实施例中，S2步骤中对自由氨基进行封闭的试剂为甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐、乙酸-N-琥珀酰亚胺、丙酸-N-琥珀酰亚胺、丁酸-N-琥珀酰亚胺、1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐中的一种及一种以上。优选甲醛。
在其中一些实施例中，S4步骤中所述可富集标签的试剂为有生物素标签的氨基活性试剂(如NHS-SS-Biotin，NHS-Biotin，NHS-PEG4-Biotin)，S6步骤中的富集标记肽段的材料为链霉素亲和素基质材料。
对于含有二硫键的生物素-氨基活性试剂(如NHS-SS-Biotin)，洗脱液为20mMDTT，16℃-50℃反应0.5-2h，最终加入50mM IAA避光条件下进行烷基化；
对于不含二硫键的的生物素-氨基活性试剂(如NHS-Biotin，NHS-PEG4-Biotin)，洗脱液为10mM EDTA(pH 8.2)及95％甲酰胺，90℃反应10min。
在其中一些实施例中，对富集的肽段进行质谱分析，其检测器为Orbitrap、iontrap、tof、quadrupole。
在其中一些实施例中，待检测生物样品为真菌、细胞、组织、血液及体液中的一种及一种以上。
本发明利用去泛素化家族酶，构建了一套简单、实用、操作方便的非抗体依赖的蛋白质泛素化修饰富集方法和检测方法，所述方法可用于研究特定类型的泛素化修饰模式，补充了目前抗体识别泛素化修饰富集方法无法针对特定泛素链修饰底物进行研究及存在序列识别偏好性的缺点。
1、本发明涉及一种非抗体依赖的泛素化修饰富集方法，无需通过特异抗体即可富集泛素化修饰肽段；
2、本发明可以针对不同类型去泛素化酶，对特定类型的泛素化修饰底物及其修饰位点进行鉴定，如USP家族(USP1、USP2、USP4、USP5、USP6、USP7、USP8、USP9x、USP10、USP15、USP16、USP20、USP21、USP25、USP27x、USP28)去泛素化酶特异性较低，基本能水解所有类型(M1,K6,K11,K27,K29,K33,K48,K63)泛素链，CYLD去泛素化酶能特异性地水解K63及M1连接类型泛素链，OUTD3去泛素化酶能特异性地水解K6和K11连接类型泛素链，OTUB1去泛素化酶能高特异性地水解K48连接类型泛素链，OTULIN能高特异性地水解MI连接类型泛素链，AMSH及BRCC3去泛素化酶能高特异性地水解K63连接类型泛素链。
附图说明
图1、去泛素化酶USP2在不同反应体系中的泛素链去除效果检测。
图2、本发明实施例2中所述非抗体依赖的泛素化修饰富集方法流程图。
图3、HeLa细胞中的蛋白质泛素化修饰检测结果。
图4、本发明实施例5中所述非抗体依赖的泛素化修饰富集方法流程图。
具体实施方式
本发明下列实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本发明的一些实施例中，涉及了一种非抗体依赖的蛋白质泛素化修饰富集方法，整个泛素化肽段富集流程包含以下几个部分：(S1)首先裂解细胞或组织，提取蛋白质；(S2)然后使用氨基活性试剂对蛋白质自由氨基进行封闭处理；(S3)使用能够去除泛素链的去泛素化酶水解底物蛋白质上的泛素链，蛋白泛素化修饰位点处会产生新的自由氨基；(S4)使用含有可富集标签的氨基活性试剂NHS-SS-Biotin标记新产生的赖氨酸侧链氨基；(S5)利用蛋白水解酶对蛋白质进行酶切处理；(S6)利用链霉亲和素球对标记的肽段进行富集，从而得到泛素化修饰肽段。
此后，可以利用液相-质谱联用对富集的肽段进行检测分析，得到蛋白质泛素化修饰位点信息。
在其中一些实施例中，非抗体依赖的蛋白质泛素化修饰富集方法以及检测方法，包括以下步骤：
1、全蛋白提取
配置8M尿素，0.1M HEPES，pH 8.0裂解缓冲液，细胞或组织样品中加入10倍体积裂解液，并通过超声或匀浆器进行进一步充分裂解，20000g，4℃离心后取上清，得到样品A。
2、蛋白水平自由氨基封闭
对总蛋白样品进行自由氨基封闭，样品A中加入浓度为10-200mM的氨基活性试剂，加入浓度为5-100mM的氰基硼氢化钠，在16℃-80℃条件下，封闭0.25-12h，并利用超滤管或分子排阻色谱去除封闭后样品中残留反应试剂，得到样品B。
蛋白自由氨基全封闭的氨基活性试剂为甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐、乙酸-N-琥珀酰亚胺、丙酸-N-琥珀酰亚胺、丁酸-N-琥珀酰亚胺、1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐中的一种及一种以上。
3、泛素链去除
样品B中加入0.1M HEPES,pH8.0，将尿素浓度稀释至2M以下，加入去除泛素化修饰链的酶，酶用量为蛋白1/50-1/200，25℃-45℃条件下，酶切1-12h，得到样品C。
用于泛素化修饰去除的酶为去泛素化酶家族蛋白质。
4、含有可富集基团的NHS-SS-Biotin试剂标记蛋白泛素化修饰位点处的自由氨基
向样品C中加入浓度为5mM-50mM的NHS-SS-Biotin试剂，在16℃-50℃条件下，标记0.5-2h，利用超滤管或分子排阻色谱去除样品中残留反应试剂，得到样品D。
5、蛋白质酶切
向样品D中加入0.1M HEPES，pH8.0，将溶液中尿素浓度稀释至2M以下，根据蛋白质的质量加入蛋白水解酶，蛋白质水解酶的用量为蛋白质的1/50-1/200，在16℃-45℃条件下，酶切2-24h，得到样品E。
蛋白质酶切所用的酶为胰蛋白酶trypsin、梭菌蛋白酶Arg-C、蛋白内切酶Glu-C、金属蛋白质内切酶Lys-N、胰凝乳蛋白酶chymotrypsin、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、胃蛋白酶中的一种及一种以上联合使用。
6、Biotin-pullown富集生物素标记的泛素化肽段
a.酶切肽段溶液中分别加入终浓度20mM Tris-HCl,pH 7.6，1mM EDTA，0.4％Triton X-100；
b.取40μL链霉素亲和素基质球，5,000g离心3min，去除上清，PBS清洗三次；
c.将酶切肽段溶液加入链霉素亲和素基质球中，室温孵育2h；
d.5,000g离心3min，去除上清，使用Washing buffer(20mM Tris-HCl,pH
7.6，1mM EDTA，0.4％Triton X-100，600mM NaCl)清洗结合了生物素标记的泛素化肽段的链霉素亲和素基质球4次，之后再用PBS清洗3次；
e.加入20mM二硫苏糖醇重悬结合了生物素标记的泛素化肽段的链霉素亲和素基质球，50℃条件下孵育30min；
f.加入终浓度50mM的碘乙酰胺，室温避光条件下孵育45min；
g.5,000g离心5min，取上清，即得到富集的泛素化肽段样品F；
7、液相-质谱分析
将样品F用C18 StageTip进行除盐，之后进行液相-质谱分析，对产生的质谱数据进行软件解析，得到蛋白质泛素化修饰位点信息。
对富集的肽段进行质谱分析所用的检测器为Orbitrap、ion trap、tof、quadrupole一种及一种以上。
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。以下实施例为本发明较优的实施方式，但是本发明的实施方式并不受下述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与基本思想下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应视为等效的置换方式，都应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1
为了验证本发明所述方法的可行性，我们首先纯化了低特异性链选择去泛素化酶USP2和USP21，并对在不同反应体系中泛素链去除效率进行评估。
将去泛素化酶USP2或者USP21与Hela裂解液在不同反应体系中孵育，之后通过western blot检测HeLa蛋白中泛素链修饰水平变化。
实验包括以下步骤：
S1:以宫颈癌HeLa细胞为样品，样品均分3份，分别使用①8M尿素,100mM HEPES，pH8.0；②4％脱氧胆酸钠，100mM HEPES，pH 8.0；③6M盐酸胍，100mM HEPES，pH 8.0为裂解液，对HeLa细胞进行裂解并提取蛋白质，进一步使用BCA试剂盒对HeLa裂解液进行蛋白定量。
S2:每一种细胞裂解液分别取100μg，用100mM HEPES，pH 8.0缓冲液分别稀释1倍、2倍、4倍和8倍。
S3：加入终浓度为5mM的二硫苏糖醇，按照酶与底物1:200(质量比)的比例加入去泛素化酶USP2或USP21，37℃孵育2h。
S4：进一步蛋白质免疫印迹实验用P4D1抗体来检测反应不同系统系中泛素化修饰蛋白信号强度。
如图1结果显示，USP2与稀释不同倍数的脱氧胆酸钠细胞裂解液或盐酸胍细胞裂解液孵育后，泛素化信号强度很高，相对于不加USP2孵育的样品无明显变化，说明USP2在脱氧胆酸钠和盐酸胍反应体系中USP2酶活性很低，无法将泛素化蛋白上的泛素链水解；USP2在稀释1倍(8M)和2倍(4M)的尿素细胞裂解液中孵育后，泛素化信号强度也很高，相对于不加USP2孵育的样品无明显变化，当细胞裂解液中尿素浓度稀释4倍(2M)和8倍(1M)后再与USP2共孵育，泛素化信号强度很弱，相对于不加USP2孵育的样品明显降低，说明USP2在2M及以下浓度尿素中酶活性非常高(实验结果表明，反应体系中如果含有脱氧胆酸钠或盐酸胍，即使稀释到比较低的浓度，也会使去泛素化酶USP2和USP21酶失活，而反应体系中如果含有尿素，尿素浓度稀释至2M及以下去泛素化酶USP2和USP21还能保持高活性。)，能够显著去除HeLa蛋白上的泛素链修饰，USP21实验结果与USP1完全一致，提示本发明所述方法能够通过去泛素化酶成功暴露蛋白泛素链修饰处赖氨酸ε氨基，并为后续进一步标记上可富集标签提供可能。
实施例2：
本实施例的非抗体依赖的蛋白质泛素化修饰富集方法，包括以下步骤：
S1:以宫颈癌Hela细胞为样品，按照图2的技术路线。使用8M尿素,100mM HEPES，pH8.0为裂解液，对Hela细胞进行裂解并提取蛋白质。进一步使用BCA试剂盒对HeLa裂解液进行蛋白定量，根据BCA定量结果，将Hela裂解液蛋白质浓度稀释为1mg/mL。
S1:取1mg HeLa蛋白溶液，加入终浓度为20mM的氰基硼氢化钠和40mM的甲醛，37℃孵育2h，之后加入终浓度为100mM的Tris-HCl,pH 8.0终止反应；
S2:将二甲基化标记的HeLa蛋白质裂解液转移至10kDa的超滤管中，14,000g离心30min，弃去流穿液；然后使用8M的尿素水溶液，清洗三次，再加入3倍体积100mM HEPES，pH8.0，将溶液中尿素浓度稀释至2M；
S3:加入终浓度为5mM的二硫苏糖醇，按照去泛素化酶USP2与蛋白质的质量比为1:200对底物蛋白上泛素链进行水解，37℃消化2h；14,000g离心30min，弃去流穿液；
S4:然后使用8M的尿素水溶液，清洗三次。加入终浓度为10mM的NHS-SS-Biotin试剂，30℃反应2h，之后加入终浓度为100mM的Tris-HCl,pH 8.0终止反应。14,000g离心30min，弃去流穿液；然后使用8M的尿素水溶液，清洗三次，再使用100mM HEPES,pH 8.0继续洗三遍；
S5:按照胰蛋白酶与蛋白质的质量比为1:50对蛋白质进行酶切，37℃消化12h。14,000g离心30min，收集流穿液，即酶切后肽段溶液。
S6:使用链霉素亲和素球对含有生物素标记的肽段进行富集，室温孵育2h。最后洗脱时加入终浓度20mM的二硫苏糖醇，50℃反应30min，打开生物素标记试剂与肽段间的二硫键，进一步加入50mM的碘乙酰胺，室温避光孵育30min，将洗脱下的肽段进行除盐及干燥处理。
S7:对干燥得到的肽段进行LC-MS/MS分析以及原始文件的MaxQuant搜索，实现对蛋白质泛素化修饰肽段的鉴定。
如图3所示，利用MaxQuant软件检索，三次技术重复实验分别鉴定到1167、1115、1138个泛素化修饰位点，分别对应896、847、897个泛素化肽段和666、649、672个泛素化蛋白，说明本发明的技术路线能够有效鉴定到蛋白质泛素化修饰，同时三次技术重复实验鉴定到的泛素化修饰位点、肽段和蛋白数目都相当，说明本发明的方法实验稳定性很高，能够很好的应用与生命科学问题研究中。
实施例3：
本实施例的非抗体依赖的针对蛋白质线性M1连接类型泛素化修饰富集方法，包括以下步骤：
S1:以宫颈癌Hela细胞为样品，按照图2的技术路线。使用8M尿素,100mM HEPES，pH8.0为裂解液，对Hela细胞进行裂解并提取蛋白质。进一步使用BCA试剂盒对HeLa裂解液进行蛋白定量，根据BCA定量结果，将Hela裂解液蛋白质浓度稀释为1mg/mL；
取1mg HeLa蛋白溶液，加入终浓度为20mM的氰基硼氢化钠和40mM的乙醛，37℃孵育2h，之后加入终浓度为100mM的Tris-HCl,pH 8.0终止反应；
S2:将二甲基化标记的HeLa蛋白质裂解液转移至10kDa的超滤管中，14,000g离心30min，弃去流穿液；然后使用8M的尿素水溶液，清洗三次，再加入3倍体积100mM HEPES，pH8.0，将溶液中尿素浓度稀释至2M；
S3:加入终浓度为5mM的二硫苏糖醇，按照去泛素化酶OTULIN与蛋白质的质量比为1:200对底物蛋白上泛素链进行水解，37℃消化2h；14,000g离心30min，弃去流穿液；
S4:然后使用8M的尿素水溶液，清洗三次。加入终浓度为10mM的NHS-SS-Biotin试剂，30℃反应2h，之后加入终浓度为100mM的Tris-HCl,pH 8.0终止反应。14,000g离心30min，弃去流穿液；然后使用8M的尿素水溶液，清洗三次，再使用100mM HEPES,pH 8.0继续洗三遍；
S5:按照胰蛋白酶与蛋白质的质量比为1:50对蛋白质进行酶切，37℃消化12h。14,000g离心30min，收集流穿液，即酶切后肽段溶液；
S6:使用链霉素亲和素球对含有生物素标记的肽段进行富集，室温孵育2h。最后洗脱时加入终浓度20mM的二硫苏糖醇，50℃反应30min，打开生物素标记试剂与肽段间的二硫键，进一步加入50mM的碘乙酰胺，室温避光孵育30min，将洗脱下的肽段进行除盐及干燥处理；
S7:对干燥得到的肽段进行LC-MS/MS分析以及原始文件的MaxQuant搜索，实现对蛋白质泛素化修饰肽段的鉴定。
实施例4：
本实施例的非抗体依赖的蛋白质泛素化修饰富集方法，包括以下步骤：
S1:以人血浆为样品，按照图2的技术路线。加入8M尿素,100mM HEPES，pH 8.0裂解液稀释血浆，并使血浆蛋白变性。进一步使用BCA试剂盒对血浆样品进行蛋白定量，根据BCA定量结果，将血浆蛋白质浓度进一步稀释为1mg/mL；
取1mg血浆蛋白溶液，加入终浓度为20mM的氰基硼氢化钠和40mM的甲醛，37℃孵育2h，之后加入终浓度为100mM的Tris-HCl,pH 8.0终止反应；
S2:将二乙基化标记的血浆蛋白质裂解液转移至10kDa的超滤管中，14,000g离心30min，弃去流穿液；然后使用8M的尿素水溶液，清洗三次，再加入3倍体积100mM HEPES，pH8.0，将溶液中尿素浓度稀释至2M；
S3:加入终浓度为5mM的二硫苏糖醇，按照去泛素化酶USP2与蛋白质的质量比为1:200对底物蛋白上泛素链进行水解，37℃消化2h；14,000g离心30min，弃去流穿液；
S4:然后使用8M的尿素水溶液，清洗三次。加入终浓度为10mM的NHS-SS-Biotin试剂，30℃反应2h，之后加入终浓度为100mM的Tris-HCl,pH 8.0终止反应。14,000g离心30min，弃去流穿液；然后使用8M的尿素水溶液，清洗三次，再使用100mM HEPES,pH 8.0继续洗三遍；
S5:按照胰蛋白酶与蛋白质的质量比为1:50对蛋白质进行酶切，37℃消化12h。14,000g离心30min，收集流穿液，即酶切后肽段溶液；
S6:使用链霉素亲和素球对含有生物素标记的肽段进行富集，室温孵育2h。最后洗脱时加入终浓度20mM的二硫苏糖醇，50℃反应30min，打开生物素标记试剂与肽段间的二硫键，进一步加入50mM的碘乙酰胺，室温避光孵育30min，将洗脱下的肽段进行除盐及干燥处理；
S7:对干燥得到的肽段进行LC-MS/MS分析以及原始文件的MaxQuant搜索，实现对蛋白质泛素化修饰肽段的鉴定。
实施例5：
本实施例的非抗体依赖的蛋白质泛素化修饰富集方法，包括以下步骤：
S1:以人结直肠癌组织为样品，按照图4的技术路线。将组织剪碎，加入8M尿素,100mM HEPES，pH 8.0，使用匀浆器将组织裂解。进一步使用BCA试剂盒对血浆样品进行蛋白定量，根据BCA定量结果，将人结直肠癌组织蛋白提取液蛋白浓度稀释为1mg/mL。
取1mg组织蛋白溶液，加入终浓度为20mM的氰基硼氢化钠和40mM的甲醛，37℃孵育2h，之后加入终浓度为100mM的Tris-HCl,pH 8.0终止反应；
S2:将二甲基化标记的组织蛋白质裂解液转移至10kDa的超滤管中，14,000g离心30min，弃去流穿液；然后使用8M的尿素水溶液，清洗三次，再加入3倍体积100mM HEPES，pH8.0，将溶液中尿素浓度稀释至2M；
S3:加入终浓度为5mM的二硫苏糖醇，按照去泛素化酶USP21与蛋白质的质量比为1:200对底物蛋白上泛素链进行水解，37℃消化2h；14,000g离心30min，弃去流穿液；
S4:然后使用8M的尿素水溶液，清洗三次。加入终浓度为10mM的NHS-Biotin试剂，30℃反应2h，之后加入终浓度为100mM的Tris-HCl,pH 8.0终止反应。14,000g离心30min，弃去流穿液；然后使用8M的尿素水溶液，清洗三次，再使用100mM HEPES,pH 8.0继续洗三遍；
S5:按照胰蛋白酶与蛋白质的质量比为1:50对蛋白质进行酶切，37℃消化12h。14,000g离心30min，收集流穿液，即酶切后肽段溶液；
S6:使用链霉素亲和素球对含有生物素标记的肽段进行富集，室温孵育2h。最后洗脱时加入10mM的EDTA(pH 8.2),95％的甲酰胺，90℃反应10min，将洗脱下的肽段进行除盐及干燥处理。
S7:对干燥得到的肽段进行LC-MS/MS分析以及原始文件的MaxQuant搜索，实现对蛋白质泛素化修饰肽段的鉴定。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种蛋白质泛素化修饰富集方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、从待检测生物样品中提取获得全蛋白质样品；
S2、利用化学修饰方法对释放出来的全蛋白质样品中自由氨基进行封闭，得底物蛋白；
S3、对封闭后的底物蛋白进行泛素链水解：底物蛋白中加入去泛素化家族酶，，进行酶切，得到泛素化位点修饰处赖氨酸的ε氨基暴露的S3样品；优选地，所述去泛素化家族酶包括USP家族酶，CYLD去泛素化酶，或OTUD3，或vOTU；
进一步优选地，所述USP家族酶包括USP1、USP2、USP4、USP5、USP6、USP7、USP8、USP9x、USP10、USP15、USP16、USP20、USP21、USP25、USP27x、USP28中的一种或多种；
S4、用含有可富集标签试剂标记泛素化修饰赖氨酸的ε氨基位点，得到S4样品；
S5、对S4样品进行蛋白水解酶进行酶切，得到S5样品；
S6、对应S4中可富集标签的方式，将S5样品中标记的泛素化修饰肽段进行富集。
2.根据权利要求1所述的蛋白质泛素化修饰富集方法，其特征在于，所述USP家族酶与底物蛋白的质量比为：1：50-500，25℃-45℃条件下，酶切1-12h。
3.根据权利要求1所述的蛋白质泛素化修饰富集方法，其特征在于，所述全蛋白质样品提取包括：利用7-9M尿素或3-5％脱氧胆酸钠或5-7M盐酸胍裂解液重悬待检测样品，再通过超声进一步裂解并释放细胞或组织中全蛋白，离心后取上清，即得。
4.根据权利要求1所述的蛋白质泛素化修饰富集方法，其特征在于，S2步骤中：在全蛋白质样品中加入浓度为10-200mM的氨基活性试剂，加入浓度为5-100mM的氰基硼氢化钠，在16℃-80℃条件下，封闭0.25-12h，得到底物蛋白。
5.根据权利要求1所述的蛋白质泛素化修饰富集方法，其特征在于，S4步骤中：在S3样品中加入浓度为5mM-50mM含有可富集标签的试剂，在16℃-80℃条件下，标记0.25-12h，利用超滤管或者分子排阻色谱对标记后样品中残留反应试剂进行去除，得到样品D。
6.根据权利要求1所述的蛋白质泛素化修饰富集方法，其特征在于，S5步骤中：向S4样品中加入蛋白质水解酶，酶与蛋白质质量比为1：20-1：200，在16℃-45℃条件下，酶切2-24h，得到S5样品；所述蛋白质水解酶优选为胰蛋白酶trypsin、梭菌蛋白酶Arg-C、蛋白内切酶Glu-C、金属蛋白质内切酶Lys-N、胰凝乳蛋白酶chymotrypsin、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、胃蛋白酶中的一种或一种以上。
7.根据权利要求1所述的蛋白质泛素化修饰富集方法，其特征在于，S6步骤中：向S5样品中加入10μL-100μL可对富集标签进行富集的试剂，孵育0.5-12h，得到结合修饰肽段的材料，利用洗脱液将富集的肽段从材料上洗脱下来，即得。
8.根据权利要求1-7任一项所述的蛋白质泛素化修饰富集方法，其特征在于，
S2步骤中对自由氨基进行封闭的试剂为甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐、乙酸-N-琥珀酰亚胺、丙酸-N-琥珀酰亚胺、丁酸-N-琥珀酰亚胺、1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐中的一种及一种以上，优选为甲醛。
9.根据权利要求1-7任一项所述的蛋白质泛素化修饰富集方法，其特征在于，
S4步骤中所述氨基活性试剂为生物素标记试剂，S6步骤中的富集标记肽段的试剂为链霉素亲和素；和/或待检测生物样品为真菌、细胞、组织、血液及体液中的一种及一种以上。
10.一种蛋白质泛素化的检测方法，其特征在于，包括按照权利要求1-9所述方法得到富集后的泛素化修饰肽段，然后使用液相-质谱联用对富集的泛素化修饰肽段进行检测。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210220908.8A CN114609306A (zh) | 2022-03-08 | 2022-03-08 | 非抗体依赖的泛素化修饰富集方法和检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210220908.8A CN114609306A (zh) | 2022-03-08 | 2022-03-08 | 非抗体依赖的泛素化修饰富集方法和检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114609306A true CN114609306A (zh) | 2022-06-10 |
Family
ID=81861638
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210220908.8A Pending CN114609306A (zh) | 2022-03-08 | 2022-03-08 | 非抗体依赖的泛素化修饰富集方法和检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114609306A (zh) |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040137597A1 (en) * | 2002-10-30 | 2004-07-15 | Meso Scale Technologies Llc | Substrates of N-end rule ubiquitylation and methods for measuring the ubiquitylation of these substrates |
| CN103776909A (zh) * | 2012-10-18 | 2014-05-07 | 上海交通大学医学院附属瑞金医院 | 一种蛋白质类泛素化修饰位点鉴定方法 |
| WO2015030585A2 (en) * | 2013-08-27 | 2015-03-05 | Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc | Methods for detecting post-translationally modified lysines in a polypeptide |
| CN105087619A (zh) * | 2015-05-29 | 2015-11-25 | 苏州大学 | 一种类泛素修饰蛋白底物鉴定方法 |
| CN109142611A (zh) * | 2017-06-15 | 2019-01-04 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种基于疏水基团修饰的sumo化肽段的富集方法 |
| US20200158737A1 (en) * | 2018-11-21 | 2020-05-21 | Regents Of The University Of Minnesota | Methods of measuring ubiquitin-like modifications |
| CN111208244A (zh) * | 2018-11-22 | 2020-05-29 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种非抗体依赖的蛋白质甲基化修饰富集分析方法 |
| CN112285265A (zh) * | 2019-07-24 | 2021-01-29 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法及应用 |
-
2022
- 2022-03-08 CN CN202210220908.8A patent/CN114609306A/zh active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040137597A1 (en) * | 2002-10-30 | 2004-07-15 | Meso Scale Technologies Llc | Substrates of N-end rule ubiquitylation and methods for measuring the ubiquitylation of these substrates |
| CN103776909A (zh) * | 2012-10-18 | 2014-05-07 | 上海交通大学医学院附属瑞金医院 | 一种蛋白质类泛素化修饰位点鉴定方法 |
| WO2015030585A2 (en) * | 2013-08-27 | 2015-03-05 | Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc | Methods for detecting post-translationally modified lysines in a polypeptide |
| CN105087619A (zh) * | 2015-05-29 | 2015-11-25 | 苏州大学 | 一种类泛素修饰蛋白底物鉴定方法 |
| CN109142611A (zh) * | 2017-06-15 | 2019-01-04 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种基于疏水基团修饰的sumo化肽段的富集方法 |
| US20200158737A1 (en) * | 2018-11-21 | 2020-05-21 | Regents Of The University Of Minnesota | Methods of measuring ubiquitin-like modifications |
| CN111208244A (zh) * | 2018-11-22 | 2020-05-29 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种非抗体依赖的蛋白质甲基化修饰富集分析方法 |
| CN112285265A (zh) * | 2019-07-24 | 2021-01-29 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dallas et al. | Current peptidomics: applications, purification, identification, quantification, and functional analysis | |
| Emmerich et al. | Optimising methods for the preservation, capture and identification of ubiquitin chains and ubiquitylated proteins by immunoblotting | |
| US20070202539A1 (en) | Methods for quantitative proteome analysis of glycoproteins | |
| Lopez-Ferrer et al. | Sample treatment for protein identification by mass spectrometry-based techniques | |
| US7115378B2 (en) | Peptide biomarker and method of identification | |
| Raasi et al. | Ubiquitin chain synthesis | |
| WO2013020557A1 (en) | Method and antibodies for the identification of ubiquitinated proteins and sites of ubiquitination | |
| US20050095661A1 (en) | Method for characterizing polypeptides | |
| WO2023193382A1 (zh) | 一种基于固相糖蛋白t抗原糖肽富集和酶切分析的方法 | |
| CN111777696B (zh) | 一种特异性可逆富集新生蛋白质的方法 | |
| CN102099685A (zh) | 用于蛋白性分子的标记和亲和力选择的化合物和方法 | |
| CN109884163B (zh) | 一种外膜蛋白酶t酶解组蛋白并进行质谱分析的方法 | |
| CN109342743B (zh) | 一种能够与类风湿因子高效结合的变性IgG的制备方法 | |
| CN111208244A (zh) | 一种非抗体依赖的蛋白质甲基化修饰富集分析方法 | |
| US20180163249A1 (en) | Methods and Systems for Determining ADAMTS13 Enzyme Activity | |
| Mansuri et al. | Optimal conditions for carrying out trypsin digestions on complex proteomes: From bulk samples to single cells | |
| RU2748540C1 (ru) | Способ детектирования вируса SARS-CoV-2 методом масс-спектрометрии | |
| JP2021523378A (ja) | タンパク質の定量分析 | |
| CN114609306A (zh) | 非抗体依赖的泛素化修饰富集方法和检测方法 | |
| CN112924562A (zh) | 一种蛋白质变体的定性定量方法 | |
| JP2003529605A (ja) | 高分子検出 | |
| JPS6023085B2 (ja) | アンジオテンシン転換酵素阻害剤 | |
| CN112285265B (zh) | 一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法及应用 | |
| US20100075356A1 (en) | Analysis of proteolytic processing by mass spectrometry | |
| CN112980908B (zh) | 基于去sumo化酶和sax的sumo化肽段富集方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |