CN112986569A - 一种单端交联肽去除方法及其在蛋白质复合物交联位点分析中的应用 - Google Patents

一种单端交联肽去除方法及其在蛋白质复合物交联位点分析中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112986569A
CN112986569A CN201911212235.6A CN201911212235A CN112986569A CN 112986569 A CN112986569 A CN 112986569A CN 201911212235 A CN201911212235 A CN 201911212235A CN 112986569 A CN112986569 A CN 112986569A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
protein
cross
group
enrichment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201911212235.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112986569B (zh
Inventor
张丽华
安雨馨
赵群
高航
张玉奎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Original Assignee
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian Institute of Chemical Physics of CAS filed Critical Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority to CN201911212235.6A priority Critical patent/CN112986569B/zh
Publication of CN112986569A publication Critical patent/CN112986569A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112986569B publication Critical patent/CN112986569B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明涉及一种基于化学交联质谱的蛋白质复合物分析中，单端反应肽段的去除方法及其在蛋白质复合物交联位点分析中的应用。应用分体式可断裂可富集交联试剂，使用与交联肽段富集基团相同的封闭试剂，可在不增加实验步骤的基础上，同时实现交联肽段的富集和单端反应肽段的去除，从而提高两端交联肽段的鉴定数目和可信度。该方法具有操作简便、高效、高通量、高可信度的优点并应用于蛋白质相互作用的分析。

Description

一种单端交联肽去除方法及其在蛋白质复合物交联位点分析 中的应用
技术领域
本发明涉及一种降低单端交联肽段丰度，从而降低交联样品复杂度，进而提高交联肽段鉴定及其在蛋白质复合物交联位点分析中的应用。
背景技术
交联质谱技术是近十多年来发展起来的新技术，它利用化学交联剂将细胞内空间距离足够接近、可以与交联剂反应的两个氨基酸以共价键连接起来，然后利用基于质谱技术的蛋白质组学对交联产物进行分析，从而实现对蛋白质的空间结构及蛋白质间相互作用方式的解析(Sinz,A.,Expert Rev.Proteomics.,2014,11(6):733-743.)。
然而，使用传统交联质谱技术对质谱鉴定要求很高。由于每个位点的实际交联效率往往远低于100％，所以交联肽段丰度偏低，交联谱图数目少、信号差，给交联谱图鉴定带来困难。此外，对于复杂蛋白质复合体样品，进入质谱分析之前，需要对其进行酶切。交联蛋白质在不同位置发生酶切会生成三种产物：a.被交联剂修饰的单肽，即交联剂一端发生水解，仅一端与肽段进行反应(Type-0型肽段)； b.肽段内部交联，即交联剂两端结合位点在同一条肽段上(Type-1 型交联肽段)；c.肽段间交联，即交联剂两端结合位点分别在两条肽段上(Type-2型交联肽段)。由于交联试剂两侧的反应基团水解速率快，Type-0型肽段含量远高于蛋白质相互作用解析所需的Type-1型和Type-2型交联肽段。
为提高交联肽段的丰度，目前已发展出含有不同类型富集基团(如炔基-叠氮、生物素-亲和素等)的交联试剂，然而，由于三种产物中均含有交联剂，因此使用含常规富集基团的交联试剂无法将交联肽段与Type-0型肽段进行分离，使得其大大干扰具有蛋白质结构及位点信息的Type-1和Type-2型交联肽段的鉴定。
本发明使用连接臂上含有富集把手的交联剂对细胞或提取的蛋白质样品进行交联，在交联反应完成后，对未反应且未水解的交联剂功能基团进行封闭使其修饰上富集基团；接着对交联蛋白样品进行点击化学反应，使其交联剂连接臂上的富集把手连接上与封闭试剂同样的富集基团。通过蛋白沉淀将多余的小分子试剂去除后，将蛋白质样品进行酶解，选择性富集交联肽段包括Type-0、Type-1和Type-2型。接着使用化学切割或者光切割方法使得Type-1和Type-2型肽段释放下来，而Type-0型肽段由于另一端封闭试剂的富集臂中并无断裂基团，因此并不会被释放下来，实现了单端反应肽段的去除从而降低交联肽段样品的复杂度；对交联肽段进行高准确度的鉴定，即可获取蛋白质结构及蛋白质相互作用信息。该方法具有操作简便、高效、高通量、高可信度的优点并可应用于蛋白质的结构分析及蛋白质复合体相互作用结合位点的分析。
发明内容
为了克服常规化学交联方法交联样品复杂，交联肽段丰度低，无法实现对交联肽段选择性富集等问题，本发明提供一种使用分体式交联试剂，在其交联反应结束后用封闭试剂对其未反应的功能基团进行封闭，随后采用高特异性富集材料选择性富集交联肽段并高效释放。该方法具有操作简便、高效、高通量、高可信度的优点并应用于蛋白质的结构分析及蛋白质复合体相互作用结合位点的分析。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
(1)蛋白质/细胞样品溶液及交联剂溶液的配制：对于胰酶消化或细胞刮消化得到的活细胞样品，使用pH为7.1-10的碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中的一种或二种以上，且不含与所用交联剂上反应基团反应的基团的缓冲液冲洗去除培养液并使细胞悬浮；对于单一蛋白样品或混合蛋白样品，使用水或缓冲液配制成浓度为1 μg/mL-100mg/mL的蛋白溶液；使用水、缓冲液或乙腈、有机醇类、有机酸类、DMF或DMSO中的一种或二种以上的有机溶剂配制成浓度为1μM-1M的交联剂溶液，使用的交联剂两侧含有琥珀酰亚胺、卤代芳烃、亚胺酸酯、马来酰亚胺、2-巯基吡啶、硫代磺酸盐、卤代乙酰基、碳二亚胺、异氰酸盐、酰肼、苯基叠氮、双吖丙啶等上述的一种反应基团，且连接臂上含有叠氮基或炔基；
(2)交联反应：将交联剂溶液加入至细胞样品或蛋白样品中进行反应，对于细胞样品，反应体系中细胞浓度为106-109个/mL，对于蛋白样品，反应体系中蛋白浓度为1nM-1mM，交联剂的浓度为10 nM-100mM；所述的反应条件为15-40℃反应10min-2h或0-10℃反应10min-10h；
(3)封闭反应：向交联样品中加入一定浓度的封闭试剂，一般浓度为交联剂浓度的2-10倍，细胞样品可以超声辅助破碎细胞；所述的反应条件为15-40℃反应10min-2h或0-10℃反应10min-10h；
(1)点击化学反应：向细胞中加入分体式富集试剂，即2-10 倍于交联剂摩尔量的叠氮/炔基-偶氮苯基-生物素，催化剂为CuSO4与THPTA或BTTAA孵育5min以上与抗环血酸钠孵育2min以上的混合溶液，25-60℃反应10min-2h；
(2)多余小分子试剂的去除：向样品中加入四倍体积的预冷丙酮或八倍体积的预冷甲醇混匀，负二十度沉淀蛋白4-24h；离心，加入预冷的丙酮或甲醇清洗沉淀1-3次，挥干；
(3)蛋白质样品的溶解、变性及还原：采用pH为1-6.5的甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸等酸性缓冲溶液或pH为7.5-14的碱性缓冲溶液配制的溶有表面活性剂或有机溶剂的溶解液来溶解蛋白质样品，加入DTT、TCEP或β-巯基乙醇等还原剂中的一种或二种以上，在40-100℃水浴下孵育1min-10h，同时进行蛋白质样品的变性及还原；
(4)蛋白质样品的烷基化及酶解：加入碘代乙酸或碘乙酰胺中的一种或二种对蛋白质样品进行烷基化反应后，向蛋白质样品中加入胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶、胰凝乳蛋白酶、胞内蛋白酶Lys-C/N、蛋白内切酶Glu-C/N、Asp-C/N中的一种或二种以上，使用二种以上时，同时使用或顺序使用；
(5)向步骤(7)的产物中加入带有单体为链霉亲和素、亲和素等中的一种或二种以上的琼脂糖凝胶球、硅球、聚合物球等有机/无机材料制备的富集材料，并与样品反应；
(6)使用高浓度盐溶液如1M氯化钾溶液或表面活性剂如 2％SDS等清稀溶液洗去富集材料上非特异性吸附的肽段；
(7)使用具有切割连接臂上断裂基团能力的如连二亚硫酸钠溶液还原重氮键将富集材料上键合的肽段释放出来，除盐，冻干并重溶进行质谱分析和数据检索。
(8)将上述样品预处理方法用于机体信号通路及蛋白质结构解析领域中蛋白质相互作用的研究。
本发明具有以下优点：
1、操作简便。实验步骤简单，可在不增加实验步骤的前提下同时实现交联肽段富集和单端反应肽段的去除。
2、富集选择性高。亲和素与生物素结合快速高效。
3、回收率高。连二亚硫酸钠对于重氮键的还原效率高且速度快。
4、可信度高。非交联肽段干扰大幅度降低，交联肽段丰度大幅度提高，极大提高交联肽段的鉴定灵敏度，从而提高鉴定结果的可信度。
具体实施方式
实施例1
1.蛋白质样品的交联反应
使用pH为7.4的20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液 (HEPES)溶解10μg牛血清白蛋白样品(BSA)，蛋白质终浓度为1 mg/mL,使用二甲基亚砜(DMSO)配制浓度为25mM的炔丙硝基庚二琥珀酰亚胺酯(BSPNO)，将交联剂加入至BSA溶液中使其终浓度为1mM，室温下反应1h。
2.未反应的NHS基团的封闭
加入终浓度为10mM的氨基-PEG3-生物素，室温反应2h。
3.点击化学反应
向样品中加入20mM CuSO4、160mM THPTA以及500mM Vc 使其终浓度分别为100μM、800μM和2.5mM，加入20mM使其终浓度为200μM的Diazo Biotin-Azide，60℃反应2h。
4.蛋白沉淀
向样品中加入其四倍体积预冷-80℃的丙酮，-20℃沉淀过夜；离心用预冷-20℃丙酮清洗沉淀2次，挥干丙酮。
5.向挥干后的交联BSA样品加入尿素及DTT,使溶液中尿素终浓度为8M,DTT终浓度为10mM，37℃水浴反应30min。
6.蛋白溶液的烷基化及酶解
向步骤5中的BSA溶液中加入碘代乙酸，并使其终浓度为20mM，避光反应30min。烷基化反应结束后，将样品溶液用50mM碳酸氢铵溶液稀释8倍，并加入1μg丝氨酸蛋白酶Lys-C，37℃水浴反应 4h。反应结束后，向样品溶液中加入2μg胰蛋白酶，37℃水浴反应过夜。
7.交联肽段的富集及单端反应肽段的去除
使用50mM碳酸氢铵溶液将键合有链霉亲和素的琼脂糖凝胶球清洗三遍，加入肽段样品中，直至上清完全无色，即修饰上Diazo Biotin-azide的肽段全部结合在琼脂糖球上。
6.非特异性吸附肽段的去除
依次使用H2O、1M KCl溶液、体积浓度10％ACN溶液以及H2O 各清洗三次洗去琼脂糖凝胶球上的非特异性吸附的肽段。
7.肽段的释放
加入洗脱液300mM Na2S2O4(含6M尿素，2M硫脲，20mM HEPES)，37℃反应30min。
8.交联位点的确定
将释放得到的交联肽段进行除盐冻干后，重溶于体积浓度0.1％甲酸溶液，进入质谱分析。
鉴定结果：
在交联肽段的鉴定中，在应用可富集型交联试剂进行蛋白质的交联后，同时应用该发明中加入封闭试剂使其与单端交联肽段反应的方法，从而在富集交联肽段的同时进行了单端肽段的去除，使得鉴定到的交联肽段比例从16.8％提升到了87.5％，而水解肽段由78％降至0.4％，提供了大量高可信度的交联肽段即包含有蛋白质复合物交联位点的鉴定结果。
Figure BDA0002298451900000071
鉴定到的部分交联肽段：
Figure BDA0002298451900000072
Figure BDA0002298451900000081
实施例2
1.蛋白质样品的交联反应
使用pH为7.4的20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液 (HEPES)溶解10μg牛血清白蛋白样品(BSA)，蛋白质终浓度为1 mg/mL,使用二甲基亚砜(DMSO)配制浓度为25mM的叠氮丙硝基庚二琥珀酰亚胺酯，将交联剂加入至BSA溶液中使其终浓度为1mM，室温下反应1h。
2.未反应的NHS基团的封闭
加入终浓度为10mM的氨基-PEG3-生物素，室温反应2h。
3.点击化学反应
向样品中加入20mM CuSO4、160mM THPTA以及500mM Vc 使其终浓度分别为100μM、800μM和2.5mM，加入20mM，终浓度为200μM的Alkyne Biotin-Azide，60℃反应2h。
4.蛋白沉淀
向样品中加入八倍体积预冷的甲醇，-20℃沉淀过夜；离心用预冷甲醇清洗沉淀2次，挥干甲醇。
5.向挥干后的交联BSA样品加入盐酸胍及TCEP,使溶液中盐酸胍终浓度为6M,TCEP终浓度为10mM，37℃水浴反应30min。
6.蛋白溶液的烷基化及酶解
向步骤5中的BSA溶液中加入碘代乙酸，并使其终浓度为20mM，避光反应30min。烷基化反应结束后，将样品溶液用50mM碳酸氢铵溶液稀释8倍，并加入1μg丝氨酸蛋白酶Lys-C，37℃水浴反应 4h。反应结束后，向样品溶液中加入2μg胰蛋白酶，37℃水浴反应过夜。
7.交联肽段的富集及单端反应肽段的去除
使用50mM碳酸氢铵溶液将键合有链霉亲和素的磁球清洗三遍，加入肽段样品中，直至上清完全无色，即修饰上Diazo Biotin-azide 的肽段全部结合在磁球上。
6.非特异性吸附肽段的去除
使用H2O、1M KCl溶液、10％ACN溶液以及H2O各清洗三次洗去磁球上的非特异性吸附的肽段。
7.肽段的释放
加入洗脱液300mM Na2S2O4(6M尿素，2M硫脲，20mM HEPES)，37℃反应30min。
8.交联位点的确定
将释放得到的交联肽段进行除盐冻干后，重溶于0.1％甲酸溶液，进入质谱分析。
鉴定结果
在应用化学交联结合质谱方法解析蛋白质结构及相互作用时，交联肽段的数目及准确度至关重要。在应用可富集型交联试剂进行蛋白质的交联后，同时应用该发明中加入封闭试剂使其与单端交联肽段反应的方法，实现了对于交联肽段95％的高选择性富集，非交联肽段仅占5％；对于一个单独的蛋白，其一次实验可鉴定到近200 条高可信度的交联肽段，提供了大量高可信度的交联肽段信息。
Figure BDA0002298451900000101
鉴定到的部分交联肽段：
Figure BDA0002298451900000102
Figure BDA0002298451900000111
Figure BDA0002298451900000121
Figure BDA0002298451900000131
实施例3
1.蛋白质样品的交联反应
使用pH为7.4的50mM磷酸缓冲盐溶液(PBS)溶解10μg兔肌酸激酶蛋白样品(CK)，蛋白质终浓度为1mg/mL,使用二甲基甲酰胺(DMF)配制浓度为25mM的炔丙硝基庚二琥珀酰亚胺酯 (BSPNO)，将交联剂加入至CK溶液中使其终浓度为1mM，室温下反应1h。
2.未反应的NHS基团的封闭
加入终浓度为10mM的氨基-PEG11-生物素，室温反应2h。
3.点击化学反应
向样品中加入20mM CuSO4、160mM BTTAA以及500mM Vc 使其终浓度分别为100μM、800μM和2.5mM，加入20mM，终浓度为200μM的Diazo Biotin-Azide，37℃反应1h。
4.蛋白沉淀
向样品中加入四倍体积预冷的丙酮，-20℃沉淀过夜；离心用预冷丙酮清洗沉淀2次，挥干丙酮。
5.向挥干后的交联BSA样品加入尿素及DTT,使溶液中尿素终浓度为8M,DTT终浓度为10mM，37℃水浴反应30min。
6.蛋白溶液的烷基化及酶解
向步骤5中的BSA溶液中加入碘代乙酸，并使其终浓度为20mM，避光反应30min。烷基化反应结束后，将样品溶液用50mM碳酸氢铵溶液稀释8倍，并加入1μg丝氨酸蛋白酶Lys-C，37℃水浴反应 4h。反应结束后，向样品溶液中加入2μg胰蛋白酶，37℃水浴反应过夜。
7.交联肽段的富集及单端反应肽段的去除
使用50mM碳酸氢铵溶液将键合有链霉亲和素的琼脂糖凝胶球清洗三遍，加入肽段样品中，直至上清完全无色，即修饰上Diazo Biotin-azide的肽段全部结合在琼脂糖球上。
6.非特异性吸附肽段的去除
使用H2O、1M KCl溶液、10％ACN溶液以及H2O各清洗三次洗去琼脂糖凝胶球上的非特异性吸附的肽段。
7.肽段的释放
加入洗脱液300mM Na2S2O4(6M尿素，2M硫脲，20mM HEPES)，37℃反应30min。
8.交联位点的确定
将释放得到的交联肽段进行除盐冻干后，重溶于0.1％甲酸溶液，进入质谱分析。
鉴定结果：
在交联肽段的鉴定中，在应用可富集型交联试剂进行蛋白质的交联后，同时应用该发明中加入封闭试剂使其与单端交联肽段反应的方法，整个处理流程在2-3天内可完成，与普通交联方法处理时间并无增加，但对于交联肽段的鉴定数目从300条提高到970条，水解肽段从2000条减少到5条，提供了大量可供解析的高可信度的交联肽段即包含有蛋白质复合物交联位点信息的鉴定结果。
Figure BDA0002298451900000151
鉴定到的部分交联肽段：
SIKGYTLPPHCSR(3)-IEEIFKK(6)
VISMEK(3)-FCVGLQKIEEIFKK(7)
VISEKGGNK(5)-GGVHVKLAHLSK(6)
LAHLSKHPK(6)-LQKR(3)
TGKSIKGYTLPPHCSRGER(3)-LSVEALNSLTGEFKGK(2)
LNYKSEEEYPDLSK(4)-AVEKLSVEALNSLTGEFK(4)
GKYYPLK(2)-VISMEKGGNMKEVFRR(6)
LNYKSEEEYPDLSK(4)-VLTPDLYKK(8)
GGVHVKLAHLSK(6)-LQKR(3)
GGDDLDPHYVLSSR(9)-VISEKGGNK(5)
GGVHVKLAHLSK(6)-LEKGQSIDDIPAQK(3)

Claims (10)

1.一种单端交联肽去除方法，其特征在于：在蛋白进行化学交联后，使用一端为与交联剂连接臂上富集基团相同、另一端为可与交联剂功能基团反应的基团的试剂进行封闭，从而实现将交联剂单端未反应的基团连接上富集基团，进而在对交联肽段进行富集的同时对其进行去除，只释放两端交联肽段，降低交联样品的复杂度，提交质谱鉴定的数目及可信度，为匹配其在蛋白质复合物的位点信息提供依据。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：具体包括：
(1)对于细胞样品，使用缓冲液冲洗去除培养液并使细胞悬浮，得细胞样品溶液；或，对于从细胞中提取出的蛋白样品，使用水或缓冲液配制成溶液，得蛋白样品溶液；对于交联剂，使用水、缓冲液或有机溶剂中的一种或二种以上配制成交联剂溶液；
(2)将交联剂溶液加入至细胞样品溶液或蛋白样品溶液中进行反应；
(3)交联反应完成后，对于细胞样品，加入封闭试剂，进行细胞破碎；对于蛋白样品，直接加入封闭试剂进行单端肽段的封闭反应；
(4)加入分体式富集试剂，使交联蛋白修饰上富集臂；
(5)进行一步蛋白沉淀，去除多余未反应的富集试剂；
(6)采用pH为1-6.5的酸性缓冲溶液或pH为7.5-14的碱性缓冲溶液配制的溶有表面活性剂或有机溶剂的溶解液来溶解交联蛋白样品，加入还原剂，高温孵育，同时进行蛋白质样品的变性及还原；
(7)加入烷基化试剂对变性及还原后的蛋白质样品进行烷基化反应后，向蛋白质样品中加入蛋白酶溶液进行酶解；
(8)向步骤(7)的酶解产物中加入富集材料；
(9)使用高浓度的盐溶液或表面活性剂洗去富集材料上非特异性吸附的肽段；
(10)使用具有洗脱能力的溶液将富集材料上键合的肽段释放出来，除盐，冻干并重溶，进行质谱分析得到交联肽段的序列信息，数据检索得到交联肽段对应的酶解前蛋白质结构及蛋白相互作用的信息。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的缓冲液为pH为7.1-10的碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中的一种或二种以上，且不含能与所用交联剂上反应基团反应的基团；
步骤(1)中所述的细胞样品，为胰蛋白酶消化或细胞刮消化得到的活细胞样品；步骤(1)中所述的蛋白样品，为单一蛋白样品或二种以上蛋白的混合蛋白样品，配制的蛋白质量与溶液的体积比为1μg/mL-100mg/mL；步骤(1)中所述的交联剂，为两侧含有与蛋白反应的基团，且连接臂上含有化学断裂基团的交联剂，配制的交联剂浓度为1μM-1M；
步骤(1)中所述的有机溶剂，为乙腈、有机醇类、有机酸类、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中的一种或二种以上；
所述的交联剂为两侧具有相同的与蛋白上氨基反应的活性基团的化学物，活性基团为琥珀酰亚胺基团、卤代芳烃基团、亚胺酸酯基团中的一种；或为与蛋白上巯基反应的活性基团的化学物，活性基团为马来酰亚胺基团、2-巯基吡啶基团、硫代磺酸基团、卤代乙酰基团中的一种；或为与蛋白上羧基反应的活性基团的化学物，活性基团为碳二亚胺基团、异氰酸基团中的一种；或为两侧具有与蛋白上糖链反应的活性基团的化学物，活性基团为酰肼基团、氨基基团中的一种；或为两侧具有与蛋白上任意基团反应的活性基团的化学物，活性基团为苯基叠氮基团、双吖丙啶基团中的一种；所述的交联剂，其两端活性反应基团为上述任一反应基团；所述的交联剂，其连接臂上的化学富集基团，为叠氮基或炔基，连接臂为C3-C20的烷烃。
4.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的反应体系中细胞浓度为106-109个/mL，蛋白终浓度为1nM-1mM，交联剂的终浓度为10nM-100mM；所述的反应条件为15-40℃反应10min-2h或0-10℃反应10min-10h。
5.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的封闭试剂结构为一端具有能与交联剂功能基团特异性反应的基团包括氨基、巯基、羧基等基团中的一种，一端为与交联剂相同的如生物素、磷酸基团等具有富集功能的基团中的一种；步骤(4)中分体式富集试剂一端为炔基或叠氮基团可与交联剂连接臂上的富集把手反应，一端为生物素等具有富集功能的基团，中间具有一个高效的化学断裂基团如重氮苯可被连二亚硫酸钠迅速还原。
6.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的细胞裂解方法为机械裂解或反复冻融法等裂解方法中的一种或二种以上；
上述机械裂解方法，具体为在蛋白质提取液与生物样本的混合物中加入蛋白酶抑制剂后，使用匀浆器、超声仪、研钵或组织捣碎机等对组织或细胞样品进行裂解；
上述蛋白酶抑制剂为下列物质中的一种或二种以上：4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐、抑肽酶、抑氨肽酶、焦磷酸钠、反-环氧丁二酰基-L-亮氨酰胺基(4-胍基)丁烷、乙二胺四乙酸二钠、亮抑蛋白酶肽或胃酶抑素A、本甲磺酰基氟化物中的一种或二种以上；
上述物质中每种蛋白酶抑制剂在蛋白质提取液中的浓度范围分别在1-200mg/mL之间；
步骤(6)中所述的蛋白沉淀方法包括甲醇沉淀、丙酮沉淀或甲醇氯仿沉淀法。
7.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(7)中所述的蛋白质样品溶解液中，pH为1-6.5的酸性缓冲溶液，由甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸溶液中的一种或二种以上配制而成；所述的pH为7.5-14的碱性缓冲溶液为碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中的一种或二种以上；
所述的蛋白质溶解液中，所述的表面活性剂包括下述中的一种或二种以上：
1)十二烷基磺酸钠、脱氧胆酸钠、烷基糖苷、100(聚乙二醇辛基苯基醚)(Triton X-100)、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)、RapiGest SF或乙基苯基聚乙二醇(NP-40d)中的一种或二种以上，质量体积浓度按表面活性剂的质量(以g为单位)与缓冲溶液的体积(以mL为单位)之比计为0.1％-30％；
2)阳离子部分为烷基链部分含2个以上碳的咪唑类、吡啶类、季铵类、或季鏻类阳离子中的一种或二种以上；阴离子部分为卤素离子、NO3 -、ClO4 -、AlCl4 -、BF4 -、PF4 -、CF3COO-、CF3SO3 -、(CF3SO2)2N-或SbF6 -中的一种或二种以上的离子液体；质量体积浓度按离子液体的质量(以g为单位)与碱性缓冲溶液的体积(以mL为单位)之比计为0.1％-30％；
3)尿素、硫脲或盐酸胍等去垢剂中的一种或二种以上，摩尔浓度按去垢剂的物质的量与缓冲溶液的体积之比计为0.1-20M；
所述的有机溶剂为有机醇类或有机酸类中的一种或二种以上，体积浓度按有机溶剂与缓冲溶液的体积之比计为0.1％-100％；有机醇类为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、乙二醇中的一种或二种以上，有机酸类为甲酸、乙酸、丙酸中的一种或二种以上；
所述的还原剂为二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或β-巯基乙醇等还原剂中的一种或二种以上，摩尔浓度按还原剂的物质的量与碱性缓冲溶液的体积之比计为0.1-1000mM；
所述的高温孵育法，具体为将蛋白质提取液与生物样本的混合物在40-100℃水浴下孵育1min-10h。
8.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(7)中所述的烷基化试剂为碘代乙酸或碘乙酰胺中的一种或二种，溶于上述碱性缓冲溶液后的摩尔浓度为1-200mM；
所述的蛋白酶为胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶、胰凝乳蛋白酶、胞内蛋白酶赖氨酸-C/N、蛋白内切酶Glu-C/N、Asp-C/N中的一种或二种以上，使用二种以上时，选用的酶可同时使用或顺序使用，蛋白酶与蛋白质的质量比为1:500–500:1。
9.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(8)中所述的富集基团为可与富集基团如亲和素高特异性结合的如链霉亲和素等；富集基团连接在基质上；
所述富集材料的基质为琼脂糖凝胶球、磁球或聚合物球等有机/无机材料；
步骤(10)中所述的清洗溶液为下述中的一种：浓度为0.1-8M的氯化钠溶液、0.1-8M的氯化钾溶液、0.1-1M的碳酸钠溶液、2-10M的尿素溶液、1-8M的盐酸胍溶液或10-1000mM的碳酸氢铵溶液；乙腈、甲醇、异丙醇、十二烷基磺酸钠、Triton X-100、Chaps或Tween；
步骤(11)中所述的交联肽段释放溶液为切割化学可断裂基团的试剂，如连二亚硫酸钠溶液将重氮键还原为氨基。
10.按照权利要求1所述的方法在蛋白质复合物交联位点分析中的应用，可用于机体信号通路及蛋白质结构解析领域中蛋白质相互作用研究的应用。
CN201911212235.6A 2019-12-02 2019-12-02 一种单端交联肽去除方法及其在蛋白质复合物交联位点分析中的应用 Active CN112986569B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911212235.6A CN112986569B (zh) 2019-12-02 2019-12-02 一种单端交联肽去除方法及其在蛋白质复合物交联位点分析中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911212235.6A CN112986569B (zh) 2019-12-02 2019-12-02 一种单端交联肽去除方法及其在蛋白质复合物交联位点分析中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112986569A true CN112986569A (zh) 2021-06-18
CN112986569B CN112986569B (zh) 2022-05-06

Family

ID=76331043

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911212235.6A Active CN112986569B (zh) 2019-12-02 2019-12-02 一种单端交联肽去除方法及其在蛋白质复合物交联位点分析中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112986569B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113687003A (zh) * 2021-09-14 2021-11-23 谱天（天津）生物科技有限公司 一种提高蛋白质和/或肽段组质谱鉴定数的方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998013119A1 (en) * 1996-09-24 1998-04-02 Altus Biologics Inc. Crosslinked protein crystals as universal separation media
US20120028285A1 (en) * 2010-07-08 2012-02-02 Sohn Chang Ho Clickable cross-linker
CN104926920A (zh) * 2015-06-15 2015-09-23 浙江医药高等专科学校 蛋白多肽类药物n端定点聚乙二醇修饰的方法
CN105693816A (zh) * 2016-03-17 2016-06-22 复旦大学 一种二/三甲基化肽段富集和质谱分析的方法
CN107525842A (zh) * 2016-06-22 2017-12-29 中国科学院大连化学物理研究所 一种用于研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的分析方法
CN109839303A (zh) * 2017-11-29 2019-06-04 中国科学院大连化学物理研究所 一种交联肽段富集方法及其在蛋白质相互作用研究中的应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998013119A1 (en) * 1996-09-24 1998-04-02 Altus Biologics Inc. Crosslinked protein crystals as universal separation media
US20120028285A1 (en) * 2010-07-08 2012-02-02 Sohn Chang Ho Clickable cross-linker
CN104926920A (zh) * 2015-06-15 2015-09-23 浙江医药高等专科学校 蛋白多肽类药物n端定点聚乙二醇修饰的方法
CN105693816A (zh) * 2016-03-17 2016-06-22 复旦大学 一种二/三甲基化肽段富集和质谱分析的方法
CN107525842A (zh) * 2016-06-22 2017-12-29 中国科学院大连化学物理研究所 一种用于研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的分析方法
CN109839303A (zh) * 2017-11-29 2019-06-04 中国科学院大连化学物理研究所 一种交联肽段富集方法及其在蛋白质相互作用研究中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DANIELLE VELLUCCI 等: "Selective Enrichment and Identification of Azide-tagged Cross-Linked Peptides Using Chemical Ligation and Mass Spectrometry", 《JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY FOR MASS SPECTROMETRY》 *
HANSUK BUNCHERD 等: "Selective enrichment and identification of cross-linked peptides to study 3-D structures of protein complexes by mass spectrometry", 《JOURNAL OF PROTEOMICS》 *
陈玲凡 等: "基于二辛基化标记的蛋白质组N末端肽富集方法", 《中国科学:生命科学》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113687003A (zh) * 2021-09-14 2021-11-23 谱天（天津）生物科技有限公司 一种提高蛋白质和/或肽段组质谱鉴定数的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112986569B (zh) 2022-05-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107525842B (zh) 一种用于研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的分析方法
CN109839303B (zh) 一种交联肽段富集方法及其在蛋白质相互作用研究中的应用
Hanai et al. Protein footprinting by the combined use of reversible and irreversible lysine modifications.
CN112986570B (zh) 基于肽段两末端准等重双标记用于氨基酸序列测定方法
US20120100565A1 (en) High pressure enzymatic digestion system for protein characterization
CN112986569B (zh) 一种单端交联肽去除方法及其在蛋白质复合物交联位点分析中的应用
WO2023093133A1 (zh) 一种基于固相糖蛋白富集和Tn糖肽酶切的分析方法和应用
Smith [17] Reversible blocking at arginine by cyclohexanedione
CN111208244A (zh) 一种非抗体依赖的蛋白质甲基化修饰富集分析方法
CN108089004B (zh) 一种硫巯化翻译后修饰肽段的定性与定量方法
JP2005509134A (ja) 複合ペプチド混合物の単純化方法およびキット
US20050042713A1 (en) Characterising polypeptides
Oyler et al. Rapid denaturing organic digestion method for targeted protein identification and characterization
CN111208300B (zh) 一种赖氨酸氮连接磷酸化翻译后修饰富集和鉴定的方法
US20210148925A1 (en) Qualitative analysis of proteins
CN114057827B (zh) 一种标记蛋白的方法
CN109900814B (zh) 基于糖苷键质谱可碎裂型化学交联剂的分析方法及应用
CN112285265B (zh) 一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法及应用
Ding et al. One-step asparaginyl endopeptidase (Oa AEP1)-based protein immobilization for single-molecule force spectroscopy
CN111381048A (zh) 一种抗体游离巯基位点和比例的分析方法及其应用
CN109900834B (zh) 一种基于肽段c末端选择性酶标记的质谱从头测序方法
CN118130592A (zh) 一种基于光敏酶激活的靶向标记rna结合蛋白质的分析方法
KR102047906B1 (ko) 당쇄를 조제하는 방법
CN114609306A (zh) 非抗体依赖的泛素化修饰富集方法和检测方法
WO2019169799A1 (zh) 一种生物素化的insulin抗原及其生物素化工艺

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant