CN107525842B - 一种用于研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的分析方法 - Google Patents
一种用于研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及用于研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的分析方法。使用两侧具有反应活性基团且具有可断裂基团的交联剂将细胞内蛋白质复合体进行交联并酶解，取一部分酶解产物进行衍生化反应后进入质谱分析；另一部分酶解产物使用化学法断裂交联剂后，使用富集材料将肽段进行富集，将富集出的肽段洗脱后进入质谱分析，根据搜库结果可确定发生交联的肽段，从而建立肽段库。通过交联肽段质谱谱图中确定的发生交联肽段的N端氨基酸信息可在肽段库中找到候选肽段，结合交联肽段质谱谱图m/z和肽段特征离子可确定交联肽段序列，从而获取蛋白质结构及蛋白质相互作用信息。该方法具有操作简便等优点并应用于蛋白质的结构分析及蛋白质复合体相互作用的分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的分析方法。
背景技术
蛋白质的空间结构信息以及蛋白质间的相互作用信息对于研究蛋白质的功能有重要意义。生物体中的蛋白质空间构象的变化及蛋白质间的相互作用，构成细胞中一系列重要生理活动的基础。因此，研究蛋白质的空间结构信息及蛋白质间相互作用的方式和程度，将有助于蛋白质功能的分析、疾病致病机理的阐明和治疗及新型药物的开发等众多难题的解决。然而，研究蛋白质结构与相互作用的传统技术，如核磁共振技术(NMR)、X射线晶体衍射技术等，对于蛋白质的纯度、结晶性和绝对量均有比较高的要求，限制了其广泛应用。
交联质谱技术是近十多年来发展起来的新技术，它利用化学交联剂将细胞内空间距离足够接近、可以与交联剂反应的两个氨基酸以共价键连接起来，然后利用基于质谱技术的蛋白质组学对交联产物进行分析。交联质谱技术在研究蛋白质结构和蛋白质相互作用上具有以下优势：a.同时进行多种蛋白质的结构和相互作用分析；b.通过交联剂的共价交联作用，可以固定原本不稳定的蛋白质相互作用，从而可以研究易解离、结构松散的蛋白质复合物；c.相对于NMR和X射线晶体衍射技术，交联质谱技术灵敏度高、对蛋白质性状要求低、需要样品绝对量小；d.可以进行体内交联，有助于研究体内蛋白质结构和相互作用；e.使用不同臂长、不同反应基团的交联剂可以得到丰富的蛋白质空间结构和相互作用信息。(Andrea Sinz.Mass Spectrom Rev.2006,25,663-682.)
然而，使用传统交联质谱技术对交联质谱鉴定要求很高。由于交联肽段搜索空间随肽段数据库规模平方级增长，大部分搜索引擎只能用于纯化样品或简单蛋白质复合物，新发展的搜索引擎也只能用于酵母或大肠杆菌等低等生物，在人体细胞等复杂生物样本的全蛋白质组水平难以实现。同时，基于数据库搜索方法的质谱谱图鉴定，在一定程度上会发生随机匹配，使鉴定结果中存在不正确的结果。此外，由于多肽交联鉴定问题相对二肽交联鉴定，数据库规模更大、谱图离子更多、样品复杂度更高，目前的研究方法难以得到多肽交联形式的相关结果。
本发明使用两侧具有反应活性基团且具有可断裂基团的交联剂将细胞内蛋白质复合体进行交联并酶解，取一部分酶解产物进行衍生化反应后进入质谱分析，通过软件分析质谱谱图可挑选出含交联肽段的谱图，同时获取交联肽段的m/z及发生交联的肽段的a1离子信息，即N端氨基酸信息；另一部分酶解产物使用化学法断裂交联剂后，使用富集材料将肽段进行富集，将富集出的肽段洗脱后进入质谱分析，根据搜库结果可确定发生交联的肽段，从而建立肽段库。通过交联肽段质谱谱图中确定的发生交联肽段的N端氨基酸信息可在肽段库中找到候选肽段，结合交联肽段质谱谱图m/z和肽段特征离子可确定交联肽段序列，从而获取蛋白质结构及蛋白质相互作用信息。该方法具有操作简便、高效、高通量、高可信度的优点并可应用于蛋白质的结构分析及蛋白质复合体相互作用结合位点的分析。
发明内容
为了克服传统交联质谱技术无法实现复杂生物样本的全蛋白质组交联信息分析，鉴定结果误匹配多及难以实现多肽交联鉴定等不足，本发明提供一种使用带有可断裂基团的交联剂将细胞内蛋白质复合体进行交联并酶解，一部分交联肽段进行衍生化反应；一部分交联肽段进行交联剂断裂及肽段富集反应。通过分析衍生化反应后的交联肽段及富集的肽段可确定交联肽段序列。该方法具有操作简便、高效、高通量、高可信度的优点并应用于蛋白质的结构分析及蛋白质复合体相互作用结合位点的分析。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
(1)蛋白质/细胞样品溶液及交联剂溶液的配制：对于胰酶消化或细胞刮消化得到的活细胞样品，使用pH为7.1-10的碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中的一种或二种以上，且不含与所用交联剂上反应基团反应的基团的缓冲液冲洗去除培养液并使细胞悬浮；对于单一蛋白样品或混合蛋白样品，使用水或缓冲液配制成浓度为1μg/mL-100mg/mL的蛋白溶液；使用水、缓冲液或乙腈、有机醇类、有机酸类、DMF或DMSO中的一种或二种以上的有机溶剂配制成浓度为1μM-1M的交联剂溶液，使用的交联剂两侧含有琥珀酰亚胺(磺酸基-琥珀酰亚胺或羟基-琥珀酰亚胺)、卤代芳烃、亚胺酸酯、马来酰亚胺、2-巯基吡啶、硫代磺酸盐、卤代乙酰基、碳二亚胺、异氰酸盐、酰肼、苯基叠氮(硝基苯叠氮、卤代苯叠氮)、双吖丙啶等上述一种或两种反应基团，且连接臂上含有邻二羟基、酯类基团等化学断裂基团；
(2)交联反应：将交联剂溶液加入至细胞样品或蛋白样品中进行反应，对于细胞样品，反应体系中细胞浓度为106-109个/mL，对于蛋白样品，反应体系中蛋白浓度为1nM-1mM，交联剂的浓度为10nM-100mM；所述的反应条件为15-40℃反应10min-2h或0-10℃反应10min-10h；
(3)多余交联剂的去除：对于细胞样品，离心弃去细胞样品中的反应液后，向细胞中加入裂解液，使用机械裂解或高温孵育法中的一种或二种细胞裂解法进行细胞裂解，获得交联的蛋白质样品；对于蛋白样品，向反应体系中加入反应终止液，或通过透析、滤膜或凝胶去除反应液，得交联蛋白样品，室温下反应10min-2h或冰上反应10min-10h；
(4)蛋白质样品的溶解、变性及还原：采用pH为1-6.5的甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸等酸性缓冲溶液或pH为7.5-14的碱性缓冲溶液配制的溶有离子液体、表面活性剂、去垢剂或有机溶剂的溶解液来溶解蛋白质样品，加入DTT、TCEP或β-巯基乙醇等还原剂中的一种或二种以上，在40-100℃水浴下孵育1min-10h，同时进行蛋白质样品的变性及还原；
(5)蛋白质样品的烷基化及酶解：加入碘代乙酸或碘乙酰胺中的一种或二种对蛋白质样品进行烷基化反应后，向蛋白质样品中加入胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶、胰凝乳蛋白酶、胞内蛋白酶赖氨酸-C/N、蛋白内切酶Glu-C/N、Asp-C/N中的一种或二种以上，使用二种以上时，同时使用或顺序使用，并将酶解产物分成两份进行除盐并冻干；
(6)取出一份冻干的酶解产物，对肽段末端氨基进行二甲基化反应等可增强肽段a1离子信号强度的末端氨基衍生反应，对衍生物使用体积排阻、离子交换分离中的一种或二种方法进行样品分级，除盐，冻干并重溶进行质谱分析；
(7)取出另一份冻干的酶解产物，向内加入由缓冲液配制的氧化剂、碱性溶液、盐酸羟胺等交联剂断裂剂溶液将酶解产物中的交联剂进行断裂；
(8)反应结束后，使用还原剂或酸性溶液终止剂终止断裂反应，或通过透析/滤膜/凝胶去除交联剂断裂剂溶液；
(9)向步骤(8)的产物中加入带有能与交联剂断裂生成基团发生共价键合基团的琼脂糖凝胶球、硅球、聚合物球等有机/无机材料制备的富集材料，并与样品反应；
(10)使用盐溶液或有机溶剂等洗脱液洗去富集材料上非特异性吸附的肽段；
(11)使用盐酸羟胺溶液或碱性溶液将富集材料上键合的肽段释放出来，除盐，冻干并重溶进行质谱分析和数据检索。
(12)由步骤(6)中得到的交联肽段的质谱谱图中挑选出含交联肽段的谱图，并通过谱图中的a1离子得到对应的N端氨基酸，由步骤(11)中得到的富集出的肽段的搜库结果可建立肽段库，通过交联肽段质谱谱图中确定的发生交联肽段的N端氨基酸信息可在肽段库中找到候选肽段，结合交联肽段质谱谱图m/z和肽段特征离子可确定交联肽段序列，从而获取蛋白质结构及蛋白质相互作用信息。
本发明具有以下优点：
1、操作简便。可供选择的交联剂种类多，实验步骤简单，无需特殊的离子碎裂方法，无需超大内存的服务器，且无需特定的搜索引擎。
2、可实现复杂样品全蛋白质组的交联鉴定分析。由于使用交联肽段自身断裂后形成的候选肽段库，并可利用交联肽段的a1离子确定N端氨基酸，大大减小了肽段数据库规模，可实现复杂样品全蛋白质组的交联鉴定分析。
3、通量高。由于肽段数据库规模大大减小，因此搜索引擎对交联肽段的鉴定分析时间大大降低。
4、可信度高。本发明通过交联肽段质谱谱图中的a1离子信息在肽段库中找到候选肽段，并结合交联肽段质谱谱图m/z和肽段特征离子确定交联肽段序列，因此鉴定结果具有很高的可信度。
具体实施方式
实施例1
1.蛋白质样品的交联反应
使用pH为7.4的20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液(HEPES)溶解10μg牛血清白蛋白样品(BSA)，蛋白质终浓度为1mg/mL,使用二甲基亚砜(DMSO)配制浓度为25mM的双琥珀酰亚胺基酒石酸盐(DST)，将交联剂加入至BSA溶液中使其终浓度为1mM，室温下反应1h。
2.多余交联剂的去除
向步骤1中的反应液中加入碳酸氢铵溶液(ABC)，使其终浓度为50mM以终止交联反应。
3.蛋白质样品的溶解、变性及还原
向步骤2中经交联后的BSA溶液中加入尿素及DTT,使溶液中尿素终浓度为8M,DTT终浓度为10mM，37℃水浴反应30min。
4.蛋白溶液的烷基化及酶解
向步骤3中的BSA溶液中加入碘代乙酸，并使其终浓度为20mM，避光反应30min。烷基化反应结束后，将样品溶液用水稀释4倍，并加入1μg丝氨酸蛋白酶Lys-C，37℃水浴反应4h。反应结束后，向样品溶液中加入2μg胰蛋白酶，37℃水浴反应过夜。将酶解产物按1:1分成两份进行除盐并冻干。
5.交联肽段的衍生化及质谱分析
取出步骤4中一份冻干的BSA交联酶解产物，并用100mM三乙胺-碳酸缓冲液(TEAB)，pH 8进行重溶。进行二甲基化反应后，除盐，冻干并使用0.1％甲酸溶液重溶进行质谱分析。
6.交联肽段的断裂
取出步骤4中另一份冻干的BSA交联酶解产物，使用氧化缓冲液(100mM醋酸钠，150mM氯化钠,pH 5.5)将其重溶，向内加入高碘酸钠并使其终浓度为10mM。避光反应1h。氧化反应结束后，向样品溶液中加入亚硫酸钠(终浓度20mM)，反应20min。
7.肽段的富集
向步骤6中的反应液中加入带有氨基基团的磁球，室温反应过夜。
8.非特异性吸附肽段的去除
分别使用2M氯化钠、0.1M碳酸钠、8M尿素、6M盐酸胍及10mM ABC溶液清洗磁球上的非特异性吸附的肽段。
9.肽段的释放
使用200mM盐酸羟胺溶液重悬步骤8中所得到的磁球，室温反应过夜。所得上清除盐，冻干并使用0.1％甲酸溶液重溶进行质谱分析和数据检索。
10.交联位点的确定
由步骤(5)中得到的交联肽段的质谱谱图中挑选出不同交联肽段对应的a1离子，从而得到对应的N端氨基酸，从步骤(9)中得到的富集肽段的数据检索结果中挑选出对应于N端氨基酸的肽段，结合交联肽段中质谱谱图的m/z及特征离子确定对应的交联的肽段。
鉴定结果
实施例2
1.BSA蛋白质样品的交联反应；多余交联剂的去除；蛋白质样品的溶解、变性及还原、烷基化及酶解步骤同实施例1。
2.交联肽段的衍生化、分级及质谱分析
取出步骤1中一份冻干的BSA交联酶解产物，并用100mM三乙胺-碳酸缓冲液(TEAB)，pH 8进行重溶。进行二甲基化反应后，除盐，冻干后使用阳离子交换分离对样品进行分级，除盐，冻干并使用0.1％甲酸溶液重溶进行质谱分析。
3.交联肽段的断裂、富集、非特异性吸附肽段的去除、肽段的释放同实施例1。
4.富集交联肽段的分级
将步骤(4)中释放得到的富集后的交联肽段进行除盐，冻干，使用阳离子交换分离对样品进行分级，除盐，冻干并使用0.1％甲酸溶液重溶进行质谱分析。
5.交联位点的确定
由步骤(2)中得到的交联肽段的质谱谱图中挑选出不同交联肽段对应的a1离子，从而得到对应的N端氨基酸，从步骤(4)中得到的富集肽段的数据检索结果中挑选出对应于N端氨基酸的肽段，结合交联肽段中质谱谱图的m/z及特征离子确定对应的交联的肽段。
鉴定结果
实施例3
1.蛋白质样品的交联反应
使用pH为7.4的50mM磷酸缓冲盐溶液(PBS)溶解10μg兔肌酸激酶蛋白样品(CK)，蛋白质终浓度为1mg/mL,使用二甲基甲酰胺(DMF)配制浓度为25mM的DST，将交联剂加入至CK溶液中使其终浓度为1mM，室温下反应1h。
2.多余交联剂的去除
向步骤1中的反应液中加入三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液(Tris)，使其终浓度为50mM以终止交联反应。
3.蛋白质样品的溶解、变性及还原
向步骤2中经交联后的CK溶液中加入尿素及DTT,使溶液中尿素终浓度为8M,DTT终浓度为10mM，37℃水浴反应30min。
4.蛋白溶液的烷基化及酶解
向步骤3中的CK溶液中加入碘代乙酸，并使其终浓度为20mM，避光反应30min。烷基化反应结束后，将样品溶液用水稀释4倍，并加入1μg丝氨酸蛋白酶Lys-C，37℃水浴反应4h。反应结束后，向样品溶液中加入2μg胰蛋白酶，37℃水浴反应过夜。将酶解产物按1:1分成两份进行除盐并冻干。
5.交联肽段的衍生化及质谱分析
取出步骤4中一份冻干的CK交联酶解产物，并用100mM三乙胺-碳酸缓冲液(TEAB)，pH 8进行重溶。进行二甲基化反应后，除盐，冻干并使用0.1％甲酸溶液重溶进行质谱分析。
6.交联肽段的断裂
取出步骤4中另一份冻干的CK交联酶解产物，使用氧化缓冲液(100mM醋酸钠,150mM氯化钠,pH 5.5)将其重溶，向内加入高碘酸钠并使其终浓度为10mM。避光反应1h。氧化反应结束后，向样品溶液中加入亚硫酸钠(终浓度20mM)，反应20min。
7.肽段的富集
向步骤6中的反应液中加入带有酰肼基团的磁球，室温反应过夜。
8.非特异性吸附肽段的去除
分别使用2M氯化钠、0.1M碳酸钠、8M尿素、6M盐酸胍及10mM ABC溶液清洗磁球上的非特异性吸附的肽段。
9.肽段的释放
使用200mM盐酸羟胺溶液，并加入苯胺溶液(终浓度10mM)，重悬步骤8中所得到的磁球，室温反应4h。所得上清除盐，冻干并使用0.1％甲酸溶液重溶进行质谱分析和数据检索。
10.交联位点的确定
由步骤(5)中得到的交联肽段的质谱谱图中挑选出不同交联肽段对应的a1离子，从而得到对应的N端氨基酸，从步骤(9)中得到的富集肽段的数据检索结果中挑选出对应于N端氨基酸的肽段，结合交联肽段中质谱谱图的m/z及特征离子确定对应的交联的肽段。
鉴定结果
该方法具有操作简便、高效、高通量、高可信度的优点并应用于蛋白质的结构分析及蛋白质复合体相互作用的分析。
Claims (12)
1.一种用于研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的分析方法，其特征在于：使用可化学断裂的交联剂对细胞或提取的蛋白质样品进行交联，将蛋白质样品进行酶解后，一部分酶解产物进行衍生化反应后进入质谱分析，通过软件分析质谱谱图可挑选出含交联肽段的谱图，同时获取交联肽段的m/z及发生交联的肽段的N端氨基酸信息；将另一部分酶解产物使用化学法断裂交联剂后，使用富集材料将肽段进行富集，将富集出的肽段洗脱后进入质谱分析，根据搜库结果可确定发生交联的肽段，从而建立肽段库；通过交联肽段质谱谱图中确定的发生交联肽段的N端氨基酸信息可在肽段库中找到候选肽段，结合交联肽段质谱谱图m/z和肽段特征离子可确定交联肽段序列，从而获取蛋白质结构及蛋白质相互作用信息；
具体包括：
（1）对于细胞样品，使用缓冲液冲洗去除培养液并使细胞悬浮；对于已提取出的蛋白样品，使用水或缓冲液配制成溶液；对于交联剂，使用水、缓冲液或有机溶剂配制成溶液；
（2）将交联剂溶液加入至细胞样品溶液或蛋白样品溶液中进行反应；
（3）对于细胞样品，离心弃去反应体系中的反应液，然后对细胞样品进行裂解，得交联蛋白样品；对于蛋白样品，向反应体系中加入反应终止液，或通过透析、滤膜或凝胶去除反应液，得交联蛋白样品；
（4）采用pH为1-6.5的酸性缓冲溶液或pH为7.5-14的碱性缓冲溶液配制的溶有离子液体、表面活性剂、去垢剂或有机溶剂的溶解液来溶解交联蛋白样品，加入还原剂，高温孵育，同时进行蛋白质样品的变性及还原；
（5）加入烷基化试剂对变性及还原后的蛋白质样品进行烷基化反应后，向蛋白质样品中加入蛋白酶溶液进行酶解，并将酶解产物分成两份进行除盐并冻干；
（6）取出步骤（5）中一份冻干的酶解产物，对肽段末端氨基进行衍生反应，对衍生物进行样品分级，除盐，冻干并重溶进行质谱分析；
（7）取出步骤（5）中另一份冻干的酶解产物，向内加入交联剂断裂剂溶液将酶解产物中的交联剂进行断裂；
（8）步骤（7）反应结束后，使用终止剂终止断裂反应，或通过透析、滤膜、凝胶中的一种或者二种以上方法去除交联剂断裂剂溶液；
（9）向步骤（8）的产物中加入带有能与交联剂断裂生成基团发生共价键合基团的富集材料，并反应；
（10）使用洗脱液洗去富集材料上非特异性吸附的肽段；
（11）使用溶液将富集材料上键合的肽段释放出来，除盐，冻干并重溶进行质谱分析和数据检索；
（12）由步骤（6）中得到的交联肽段的质谱谱图中挑选出含交联肽段的谱图，并通过谱图中的a1离子得到对应的N端氨基酸，由步骤（11）中得到的富集出的肽段的搜库结果可建立肽段库，通过交联肽段质谱谱图中确定的发生交联肽段的N端氨基酸信息可在肽段库中找到候选肽段，结合交联肽段质谱谱图m/z和肽段特征离子可确定交联肽段序列，从而获取蛋白质结构及蛋白质相互作用信息。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的缓冲液为pH为7.1-10的碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中的一种或二种以上，且不含能与所用交联剂上反应基团反应的基团；
步骤（1）中所述的细胞样品，为胰酶消化或细胞刮消化得到的活细胞样品；步骤（1）中所述的蛋白样品，为单一蛋白样品或二种以上蛋白的混合蛋白样品，配制的蛋白质量与溶液的体积比为1 µg/mL-100 mg/mL；步骤（1）中所述的交联剂，为两侧含有与蛋白反应的基团，且连接臂上含有化学断裂基团的交联剂，配制的交联剂浓度为1 µM-1 M；
步骤（1）中所述的有机溶剂，为乙腈、有机醇类、有机酸类、二甲基甲酰胺(DMF）或二甲基亚砜 (DMSO) 中的一种或二种以上。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的交联剂，其两侧基团分别为下述任一反应基团的化学物：两侧具有与蛋白上氨基反应的活性基团的化学物；或为两侧具有与蛋白上巯基反应的活性基团的化学物；或为两侧具有与蛋白上羧基反应的活性基团的化学物；或为两侧具有与蛋白上糖链反应的活性基团的化学物；且其连接臂上的化学断裂基团，为经氧化断裂的邻二羟基基团；或为碱性/盐酸羟胺断裂的酯类基团。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的交联剂，为两侧具有与蛋白上氨基反应的活性基团的化学物，活性基团为琥珀酰亚胺基团、卤代芳烃基团、亚胺酸酯基团中的一种或二种；或为两侧具有与蛋白上巯基反应的活性基团的化学物，活性基团为马来酰亚胺基团、2-巯基吡啶基团、硫代磺酸基团、卤代乙酰基团中的一种或二种；或为两侧具有与蛋白上羧基反应的活性基团的化学物，活性基团为碳二亚胺基团、异氰酸基团中的一种或二种；或为两侧具有与蛋白上糖链反应的活性基团的化学物，活性基团为酰肼基团、氨基基团中的一种或二种；或为两侧具有与蛋白上基团反应的活性基团的化学物，活性基团为苯基叠氮基团、双吖丙啶基团中的一种或二种。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的琥珀酰亚胺基团为磺酸基-琥珀酰亚胺、羟基-琥珀酰亚胺；苯基叠氮基团为硝基苯叠氮基团、卤代苯叠氮基团。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的反应体系中细胞浓度为106-109个/mL，蛋白浓度为1 nM-1 mM，交联剂的浓度为10 nM-100 mM；对于细胞样品反应体系，所述的反应条件为15-40 ℃反应10 min-2 h或0-10℃反应10 min-10 h；对于蛋白样品反应体系，所述的反应条件为15-40 ℃反应10 min-2 h或0-10℃反应10 min-10 h。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的反应终止液为具有能与交联剂两侧反应基团反应的基团的物质，所述的终止反应条件为15-40 ℃反应10 min-2 h或0-10℃反应10 min-10 h。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的细胞裂解方法为机械裂解或高温孵育法中的一种或二种；
上述机械裂解方法，具体为在细胞样本中加入蛋白酶抑制剂后，使用匀浆器、超声仪或研钵对细胞样品进行裂解；
上述高温孵育法，具体为细胞样本在40-100 ℃水浴下孵育1-60 min；
上述蛋白酶抑制剂为：4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐、抑肽酶、抑氨肽酶、焦磷酸钠、反-环氧丁二酰基-L-亮氨酰胺基(4-胍基)丁烷、乙二胺四乙酸二钠、亮抑蛋白酶肽或胃酶抑素A、苯甲磺酰基氟化物中的一种或二种以上；
上述每种蛋白酶抑制剂在细胞样品中的浓度范围分别在 1-200 mg/mL 之间。
9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中所述的蛋白质样品溶解液中，pH为1-6.5的酸性缓冲溶液，为甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸溶液；所述的pH为7.5-14的碱性缓冲缓冲溶液为碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中的一种或二种以上；
所述的蛋白质溶解液中，离子液体的阳离子部分为烷基链部分含2个以上碳的咪唑类、吡啶类、季铵类、或季鏻类中的一种或二种以上；阴离子部分为卤素离子、NO3 -、ClO4 -、AlCl4 -、BF4 -、PF4 -、CF3 COO- 、CF3 SO3 -、(CF3 SO2) 2N-或SbF 6 -中的一种或二种以上；质量体积浓度按离子液体的质量 (g) 与碱性缓冲溶液的体积 (mL) 之比计为0.1%-30%；
所述的表面活性剂为十二烷基磺酸钠、脱氧胆酸钠、烷基糖苷、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐 (CHAPS)、RapiGest SF或乙基苯基聚乙二醇 (NP-40) 中的一种或二种以上，质量体积浓度按表面活性剂的质量 (g) 与缓冲溶液的体积 (mL) 之比计为0.1%-30%；
所述的去垢剂为尿素、硫脲或盐酸胍中的一种或二种以上，摩尔浓度按去垢剂的物质的量与缓冲溶液的体积之比计为0.1-20 M；
所述的有机溶剂为有机醇类或有机酸类中的一种或二种，体积浓度按有机溶剂与缓冲溶液的体积之比计为0.1%-100%；
所述的还原剂为二硫苏糖醇（DTT）、磷酸三(2-氯乙基)酯（TCEP）或β-巯基乙醇中的一种或二种以上，摩尔浓度按还原剂的物质的量与碱性缓冲溶液的体积之比计为0.1-1000mM；
所述的高温孵育，具体为将蛋白质提取液与生物样本的混合物在40-100 ℃水浴下孵育1 min-10 h。
10.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）中所述的烷基化试剂为碘代乙酸或碘乙酰胺中的一种或二种，溶于上述碱性缓冲溶液后的摩尔浓度为1-200 mM；
所述的蛋白酶为胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶、胰凝乳蛋白酶、胞内蛋白酶赖氨酸-C/N、蛋白内切酶Glu-C/N、Asp-C/N中的一种或二种以上，使用二种以上时，选用的酶同时使用或顺序使用，蛋白酶与蛋白质的质量比为1:500 –500:1；
步骤（6）中所述的肽段末端氨基反应，为使用醛基及氰基硼氢化钠进行的二甲基化末端氨基衍生反应，以增强肽段a1离子信号强度；所述的分级方法包括体积排阻分级、离子交换分离中的一种或二种。
11.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（7）中所述的交联剂断裂剂为氧化剂、碱性溶液、盐酸羟胺中的一种或二种以上；
上述氧化剂为高碘酸盐、高氯酸盐、高锰酸盐、重铬酸盐、过氧化钠、过氧化氢、硝酸中的一种或二种以上；上述碱性溶液为氢氧根盐溶液和氨水中的一种或二种；
步骤（8）中所述的终止剂为对应于中和交联剂断裂剂的试剂，为还原剂或酸性溶液；
上述还原剂为硫代硫酸盐、亚硫酸盐、卤素离子中的一种或二种以上；
上述酸性溶液为盐酸、磷酸、硝酸或硫酸中的一种或二种以上。
12.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（9）中所述的富集材料为在琼脂糖凝胶球、硅球或聚合物球上键合能与交联剂断裂生成基团反应的物质；
步骤（10）中所述的洗脱液为下述中的一种：浓度为0.1-8 M的氯化钠溶液、0.1-8 M的氯化钾溶液、0.1-1 M的碳酸钠溶液、2-10 M的尿素溶液、1-8 M的盐酸胍溶液或10-1000 mM的碳酸氢铵溶液；乙腈、甲醇、异丙醇；十二烷基磺酸钠、Triton X-100、Chaps、Tween；
步骤（11）中所述的键合肽段释放溶液为浓度为0.1-1 M的盐酸羟胺溶液；或为pH为8-12的碱性溶液，碱性溶液为氢氧根化合物、碳酸盐、氨水中的一种或两种以上。
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