CN112485339A - 一种基于相分离的交联剂载体及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于相分离的交联剂载体及其制备和应用。载体在相分离过程中通过溶剂的极性的变化使高分子材料团聚为纳米球体，形成一个新相，该相对于药物和疏水性交联剂有着更高的分配比，从而包裹药物或者疏水性交联剂。对已有的载体的制作工艺进行优化，并且通过载体与交联剂之间的疏水‑疏水相互作用使交联剂的半衰期大大提高，此外由于交联剂与载体的结合力较弱，在细胞基质中有着良好的释放效果。该专利以能与水相互溶的有机相为分散质，水作为分散剂，通过分散质缓慢滴入分散剂，纳米级高分子载体球逐渐形成。本专利有可跨膜性与缓释的特点，又降低载体生物毒性，可进一步用于生物分析、生物技术领域中的胞内原位蛋白复合物的鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于相分离方法而开发的用于细胞内蛋白质复合物原位分析的载体及其制备方法和应用。本发明属于功能性生物材料及其制备和在蛋白质复合物原位分析的应用。
背景技术
最近几年，由于丙交酯-乙交酯(PLGA)具有可降解、生物低毒性、优良生物相容性以及对大多数药剂具有化学惰性，使其迅速成为研究热点，其中以皮克林乳液为模式的制作的以丙交酯-乙交酯(PLGA)为骨架的载体是新兴的研究热点。但由于皮克林乳液的制作需要经过超声形成初乳的过程，该过程会导致对于一些化学性质活泼或者在水溶液中半衰期较短的药物迅速失效。因此基于相反转的纳米载体方式成为这些药物的主要制作方式。
此外，由于相分离的易挥发溶剂的挥发速率具有可以计算的特点，相分离所制作的粒子的粒径可受两项体积比浓度调节，相分离具有良好的鲁棒性，受杂质的干扰小等特点(Journal of Drug Delivery Science and Technology，50(2019)42-47)在近几年来成为活泼药物载体的研究重点。
而用于细胞内蛋白质复合物原位分析的交联剂是一种独立于冷冻电镜解析蛋白复合物的手段。该手段可以在蛋白质组的层面上理解蛋白与蛋白之间的相互作用，并在作用瞬间将两个作用蛋白结合，从而更加真实地反应蛋白之间的相互作用的过程及特点。目前交联剂的种类繁多，从交联的位置上大致可以分为：胺类交联剂(例如：双琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)，交联位置：赖氨酸(K)侧链的氨基或者蛋白质N端的氨基)、巯基交联剂(例如：顺丁烯二酸亚胺，交联位置：半胱氨酸的巯基)和非特异性交联剂(例如：双吖丙啶、重氮化合物、甲醛等，交联位置：所有氨基酸，无特异性)等类型。但这些交联剂大多都含有一个共同的问题——生物毒性过大。
结合以上问题，一种基于相分离的用于细胞内蛋白质复合物原位分析的载体便产生。这种载体可以极大减少活泼交联剂在制作过程中的损失与失效问题，并且可以降低交联剂对于细胞的生物毒性，使我们能在活泼状态的细胞中更多获得交联信息。极大减少假阳性的可能，并为此设计的载体对于亚细胞器有着良好的定位作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于相分离的交联剂载体及其制备和应用，通过本发明开发的载体具有能有效降低交联剂药物毒性，较强的亚细胞器定位效果，明显降低交联剂在制备过程的损失，减小假阳性出现的可能等优点，是一种用于蛋白复合物的解析极好的新型生物材料。
本发明提供一种基于相分离的交联剂载体及其制备和应用，其中载体担载了用于蛋白质复合物分析的交联剂：载体中包裹了用于蛋白质复合物分析的交联剂；以聚丙交酯-乙交酯(PLGA)为载体骨架；以双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)为骨架上的电荷驱动试剂；以乙腈或丙酮作为丙交酯-乙交酯(PLGA)、交联剂以及双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)的溶解试剂；以乙腈或者丙酮作为其中上述组分的分散质，聚乙烯醇的水溶液为分散剂；其中，以线状聚丙交酯-乙交酯为载体骨架，整个载体为球状，载体表面分布羧基，交联剂和双十二烷基二甲基溴化铵为被包载物质，被包载的物质均匀地分布在线状聚交酯-乙交酯中间(文献中也报道了这种交联剂在聚合物中的分布形式：Journal of Colloid andInterface Science 351(2010)19–29)；
上述材料的质量比为：
聚丙交酯-乙交酯(分子量为5000-100000。)5-200质量份；双十二烷基二甲基溴化铵1-10质量份；用于蛋白质复合物分析的交联剂1-80质量份；乙腈或丙酮100-10000质量份；含有聚乙烯醇(分子量为5000-100000)的水溶液(质量百分浓度为0-5％)。
交联剂为：其两侧基团均为与蛋白上氨基反应的含有琥珀酰亚胺基团的化合物、卤代芳烃、亚胺酸酯；或均为与蛋白上巯基反应的含有马来酰亚胺基团的化合物、2-巯基吡啶、硫代磺酸盐、含有卤代乙酰基化合物、吡啶基二硫化物；或均为与蛋白上羧基反应的碳化二亚胺、异氰酸盐；或均为与蛋白上糖链反应的含有酰肼基团化合物；或均为与蛋白中的氨基酸残基发生反应的含有非特异反应基团苯基叠氮基团化合物、双吖丙啶；所述的交联剂，其两侧基团分别为上述任一反应基团。
含有琥珀酰亚胺基团的化合物为磺酸基-琥珀酰亚胺和羟基-琥珀酰亚胺中的一种或两种以上；所述的含有苯基叠氮基团化合物为硝基苯叠氮基团和卤代苯叠氮基团中的一种或两种以上。
本发明中通过相分离的方式制备交联剂，具体包括如下步骤：
1.聚丙交酯-乙交酯(分子量为5000-100000)5-200质量份，双十二烷基二甲基溴化铵1-10质量份，用于蛋白质复合物分析的交联剂1-80质量份，溶于100-10000质量份的乙腈或丙酮中，搅拌0.5-5h。
2.将上述混合物通过流动注射泵以恒定速度滴加至含有2000-1000000质量份聚乙烯醇(分子量为5000-100000)溶液或者盐溶液；聚乙烯醇溶液为质量百分浓度为0-5％的聚乙烯醇水溶液；盐溶液为质量百分浓度为0-5％的NaCl水溶液；继续搅拌1-24h,搅拌速度为200-800转每分钟。
其中乙腈和丙酮具有优良的溶解能力，可以与水任意比例混溶，而且易挥发等特点，保证相分离可以获得理想粒径的纳米载体。
其中聚乙烯醇水溶液中的聚乙烯醇有降低纳米载体的表面能的作用，而且其表面形成一层保护层防止纳米载体聚沉。
本方法以极性不同的但能互相溶解的两种液体混合时产生的相分离为设计出发点，开发了用于蛋白复合物原位分析的交联剂的载体材料。该方法开发的载体材料形貌以球形为主，能够有效地运输进入细胞，并电荷靶向至亚细胞器。
本发明还提供一种基于相分离的交联剂载体的粒径与zeta电势测试方法：载体经过三次超纯水洗涤离心后，采用动态光散射(DLS)进行粒径与zeta电势的测试与数据采集。
本发明还提供一种基于相分离的交联剂载体的包载量测试方法：载体经过三次超纯水洗涤离心后，用乙腈或者丙酮溶解，经过固相萃取柱后，经高效液相色谱测试用于蛋白复合物原位分析的交联剂的绝对含量。
本发明还提供了一种用于细胞内蛋白质复合物原位分析的载体的应用，包括：载体与细胞在DMEM培养液中进行共孵育，孵育1-12小时后，收集细胞，然后利用离子液体从细胞提取蛋白质和蛋白质复合物，采用膜上变性、还原、烷基化的方法对提取蛋白质和蛋白质复合物进行预处理。
对蛋白质复合物进行胞内交联后，进行样品预处理后，最后利用nano LC-MS/MS进行蛋白质组数据采集。
其中，蛋白质复合物的来源为：细胞蛋白质提取液、胞浆蛋白质提取液、血浆蛋白质提取液、组织蛋白质提取液、单一蛋白质复合物中的一种或二种以上。
本发明还提供一种基于相分离的交联剂载体的释放量测试方法：载体经过三次超纯水洗涤离心后将其加入含有50-150质量分磷酸盐缓冲溶液(PBS)、0-20质量份吐温(T-20，T-60，T-80)和0-5质量份二甲基亚砜(DMSO)的复合体系中，采取如权利要求9中的方法测试剩余载体中用于蛋白复合物原位分析的交联剂的绝对含量，并取该体系混合溶液用高效液相色谱测试溶液体系中用于蛋白复合物原位分析的交联剂。
本发明还提供一种基于相分离的交联剂载体的固化为粉末与复溶方法：载体经过三次超纯水洗涤离心后，采用冷冻冻干机固化为粉末。固化的粉末加入适量的超纯水经超声复溶分散。
本发明具有如下优点：
1.本发明可以有效降低由交联剂的生物毒性对细胞的活力所造成的伤害，并可以进一步降低假阳性的出现，获得细胞在活跃的状态下的蛋白复合物的交联信息。
2.本发明解决了在制作过程中交联剂水解失效的问题，延长了交联剂在水溶液中的半衰期。
3.本发明以双十二烷基二甲基溴化铵为骨架上的靶向驱动试剂，可以起到很好的定向作用，使载体较容易进入载体，并可以近一步定位至带有负电的亚细胞器。
4.本方法开发的载体在经过处理固化成粉末后仍有优良的再次分散在水中的特性。
附图说明
图1：模拟基于相分离的交联剂载体在细胞基质中释放曲线；
图2：一种基于相分离的交联剂载体的TEM表征图。
具体实施方式
实施例1
将聚丙交酯-乙交酯(分子量为5000)40质量份，双十二烷基二甲基溴化铵7质量份，交联剂(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)40质量份，溶于3000质量份的丙酮中，搅拌5h。然后用流动注射泵将上述溶液滴加至500000质量份聚乙烯醇水溶液(聚乙烯醇的分子量为5000，聚乙烯醇水溶液质量百分浓度为2％)以700转每分钟搅拌12小时进行聚合物溶液在相分离操作。
成功制备载体。
实施例2
将聚丙交酯-乙交酯(分子量为9000)15质量份，双十二烷基二甲基溴化铵2质量份，交联剂(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)6质量份，溶于2000质量份的乙腈中，搅拌3h。然后用流动注射泵将上述溶液滴加至20000质量份聚乙烯醇水溶液(聚乙烯醇的分子量为分子量为20000，聚乙烯醇水溶液质量百分浓度为0.1％)以500转每分钟搅拌14小时进行相分离操作。本次实施得到的粒径和zeta电势如表所示：
表2.DLS测试数据(1,2,3为载体三次平行测试)
| 1 | 2 | 3 | |
| 粒径/nm | 244.5 | 240.7 | 248.7 |
| PDI | 0.160 | 0.179 | 0.095 |
| Zeta电势/mV | 47.5 | 52.4 | 50.0 |
由动态光散射(DLS)测试可知，合成的包含交联剂的形状均匀，粒径较传统方法较小，粒径在244.5±4.2nm有着优越地被细胞胞吞进入细胞的优势。分散度指标(PDI)为0.160±0.065，说明该载体的形貌和颗粒大小基本一致。水合电势(zeta电势)在50.0±2.5mV，对于具有负电的细胞膜有刺激产生胞吞的效果，而且可以在细胞基质中定位带有负电的线粒体，但是电势过高可能有撕裂细胞膜的风险。综上分析该载体很容易进入细胞。
载体经过三次超纯水洗涤离心后，采用冷冻冻干机固化为粉末。然后用所固化的粉末进行TEM的表征，所得如附图2所示，所得粉末大小在微米级别，适合保存与再次复溶。
实施例3
将聚丙交酯-乙交酯(分子量为12000)120质量份，双十二烷基二甲基溴化铵1质量份，交联剂(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)55质量份，溶于5000质量份的乙腈中，搅拌1.5h。然后用流动注射泵将上述溶液滴加至800000质量份聚乙烯醇水溶液(聚乙烯醇分子量为50000，聚乙烯醇水溶液质量百分浓度为0.1％)以350转每分钟搅拌20小时进行相分离操作。
成功制备载体。
实施例4
将聚丙交酯-乙交酯(分子量为50000)150质量份，双十二烷基二甲基溴化铵10质量份，交联剂(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)65质量份，溶于7500质量份的乙腈中，搅拌3h。然后用流动注射将上述溶液滴加至900000质量份的聚乙烯醇水溶液(聚乙烯醇分子量为70000，聚乙烯醇水溶液质量百分浓度为0.01％)以240转每分钟搅拌8小时进行相分离操作。
成功制备载体。
实施例5
将聚丙交酯-乙交酯(分子量为10000)10质量份，双十二烷基二甲基溴化铵1.4质量份，交联剂(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)4质量份，溶于5000质量份的乙腈中，搅拌2h。然后用流动注射泵将上述溶液滴加至50000质量份的含有0％聚乙烯醇水溶液(聚乙烯醇分子量为20000)以600转每分钟搅拌15小时进行相分离操作。本次实施得到的粒径和zeta电势如表所示：
表3.DLS测试数据(1,2,3为载体三次平行测试)
| 1 | 2 | 3 | |
| 粒径/nm | 265.0 | 256.3 | 253.0 |
| PDI | 0.134 | 0.130 | 0.122 |
| Zeta电势/mV | 41.0 | 41.7 | 43.0 |
由动态光散射(DLS)测试可知，合成的包含交联剂的形状均匀，粒径较传统方法较小，粒径在256.3±8.7nm有着优越地被细胞胞吞进入细胞的优势。分散度指标(PDI)为0.130±0.008，说明该载体的形貌和颗粒大小基本一致。水合电势(zeta电势)在41.7±1.3mV，对于具有负电的细胞膜有刺激产生胞吞的效果，而且可以在细胞基质中定位带有负电的线粒体。综上分析该载体很容易进入细胞。该载体的包载量测试：载体经过三次超纯水洗涤离心后，用乙腈或者丙酮溶解，经过固相萃取柱后，经高效液相色谱测试用于蛋白复合物原位分析的交联剂的绝对含量，峰面积为53536189，经过标注曲线所算得包载量为2.20mg，包载率为48.0％
实施例6
将聚丙交酯-乙交酯(分子量为15000)10质量份，双十二烷基二甲基溴化铵6质量份，交联剂(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)25质量份，溶于10000质量份的乙腈中，搅拌4h。然后用流动注射泵将上述溶液滴加至200000质量份聚乙烯醇水溶液(聚乙烯醇分子量为20000，聚乙烯醇水溶液质量百分浓度为5％)以470转每分钟搅拌4小时进行相分离操作。
成功制备载体。
实施例7
将聚丙交酯-乙交酯(分子量为9000。)10质量份，双十二烷基二甲基溴化铵1.4质量份，交联剂(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)4质量份，溶于2000质量份的乙腈中，搅拌1.5h。然后用流动注射泵将上述溶液滴加至20000质量份的聚乙烯醇水溶液(聚乙烯醇分子量为20000，聚乙烯醇水溶液质量百分浓度为0.1％)以700转每分钟搅拌15小时进行相分离操作。本次实施得到的粒径和zeta电势如表所示：
表1.DLS测试数据(1,2,3为载体三次平行测试)
| 1 | 2 | 3 | |
| 粒径/nm | 191.0 | 189.4 | 193.1 |
| PDI | 0.076 | 0.118 | 0.106 |
| Zeta电势/mV | 39.4 | 41.4 | 38.9 |
由动态光散射(DLS)测试可知，合成的包含交联剂的形状均匀，粒径较传统方法较小，粒径在191.0±2.1nm有着优越地被细胞胞吞进入细胞的优势。分散度指标(PDI)为0.106±0.030，说明该载体的形貌和颗粒大小基本一致。水合电势(zeta电势)在39.4±1.0mV，对于具有负电的细胞膜有刺激产生胞吞的效果，而且可以在细胞基质中定位带有负电的线粒体。综上分析该载体很容易进入细胞。
在交联剂载体用于蛋白质复合物原位分析的研究中，载体与细胞在DMEM培养液中进行共孵育，孵育6小时后，收集细胞，然后利用离子液体从细胞提取蛋白质和蛋白质复合物，采用膜上变性、还原、烷基化的方法对提取蛋白质和蛋白质复合物进行预处理，对蛋白质复合物进行胞内交联后，进行样品预处理后，最后利用nano LC-MS/MS进行蛋白质组数据采集，鉴定到的交联肽段(Cross-linked Peptides Pairs)为62条，鉴定到的内部交联的肽段(Loop-linked Peptides Pairs)为59条，鉴定到的单交联的肽段(Mono-linkedPeptides Pairs)为533条。
实施例8
将聚丙交酯-乙交酯(分子量为20000)10质量份，双十二烷基二甲基溴化铵4质量份，交联剂(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)10质量份，溶于1000质量份的乙腈中，搅拌1h。然后用流动注射泵将上述溶液滴加至20000质量份聚乙烯醇水溶液(聚乙烯醇分子量为10000，聚乙烯醇水溶液质量百分浓度为3％)以650转每分钟搅拌10小时进行相分离操作。
成功制备载体。
实施例9
将聚丙交酯-乙交酯(分子量为10000)10质量份，双十二烷基二甲基溴化铵1.4质量份，交联剂(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)4质量份，溶于2000质量份的乙腈中，搅拌1h。然后用流动注射泵将上述溶液滴加至20000质量份的质量百分浓度为0.9％NaCl水溶液中(分析纯)以700转每分钟搅拌16小时进行相分离操作。本次实施得到的粒径和zeta电势如表所示：
表4.DLS测试数据(1,2,3为载体三次平行测试)
| 1 | 2 | 3 | |
| 粒径/nm | 1946 | 1927 | 1695 |
| PDI | 0.363 | 0.383 | 0.361 |
| Zeta电势/mV | N/A | N/A | N/A |
由动态光散射(DLS)测试可知，合成的包含交联剂的形状不均匀，粒径在1927±232nm无法被细胞胞吞进入细胞。分散度指标(PDI)为0.363±0.020，说明该载体为多分散，粒径大小差别大。水合电势(zeta电势)无法测量。综上分析，该载体无法应用于蛋白复合物的解析中。
实施例10
将聚丙交酯-乙交酯(分子量为80000)200质量份，双十二烷基二甲基溴化铵10质量份，交联剂(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)80质量份，溶于10000质量份的乙腈中，搅拌3h。然后用流动注射将上述溶液滴加至含有100000质量份的聚乙烯醇水溶液(聚乙烯醇分子量为10000，聚乙烯醇水溶液质量百分浓度为1％)以700转每分钟搅拌14小时进行相分离操作。
成功制备载体。
实施例11
将聚丙交酯-乙交酯(分子量为10000)10质量份，双十二烷基二甲基溴化铵1.4质量份，交联剂(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)4质量份，溶于5000质量份的乙腈中，搅拌2h。然后用流动注射泵将上述溶液滴加至50000质量份的聚乙烯醇水溶液(聚乙烯醇分子量为20000，聚乙烯醇水溶液质量百分浓度为0.1％)以630转每分钟搅拌14小时进行相分离操作。本次实施得到的粒径和zeta电势如表所示：
表3.DLS测试数据(1,2,3为载体三次平行测试)
| 1 | 2 | 3 | |
| 粒径/nm | 251.4 | 248.8 | 251.0 |
| PDI | 0.027 | 0.118 | 0.139 |
| Zeta电势/mV | 40.6 | 41.6 | 41.1 |
由动态光散射(DLS)测试可知，合成的包含交联剂的形状均匀，粒径较传统方法较小，粒径在251.0±2.2nm有着优越地被细胞胞吞进入细胞的优势。分散度指标(PDI)为0.118±0.091，说明该载体的形貌和颗粒大小基本一致。水合电势(zeta电势)在41.1±0.5mV，对于具有负电的细胞膜有刺激产生胞吞的效果，而且可以在细胞基质中定位带有负电的线粒体。综上分析该载体很容易进入细胞。
本专利载体的释放量测试：载体经过三次超纯水洗涤离心后将其加入含有100质量分磷酸盐缓冲溶液、和1质量份二甲基亚砜的复合体系中，利用高效液相色谱测试释放曲线如附图1所示。
Claims (13)
1.一种基于相分离的交联剂载体，其特征在于：包括：
载体中包裹了用于蛋白质复合物分析的交联剂；以聚丙交酯-乙交酯为载体骨架；以双十二烷基二甲基溴化铵为骨架上的电荷驱动试剂；
整个载体为球状，载体表面分布羧基，交联剂和双十二烷基二甲基溴化铵为被包载物质，被包载的物质均匀地分布在线状聚交酯-乙交酯中间。
2.如权利要求1所述的一种基于相分离的交联剂载体，其特征在于：载体分散在分散剂中，所述分散剂为超纯水、盐溶液或含有聚乙烯醇的水溶液。
3.如权利要求1所述的一种基于相分离的交联剂载体，其特征在于：
所述的交联剂为：其两侧基团均为可以与蛋白上氨基反应的含有琥珀酰亚胺基团的化合物、卤代芳烃或亚胺酸酯；或均为与蛋白上巯基反应的含有马来酰亚胺基团的化合物、2-巯基吡啶、硫代磺酸盐、含有卤代乙酰基的化合物或吡啶基二硫化物；或均为与蛋白上羧基反应的碳化二亚胺、异氰酸盐；或均为与蛋白上糖链反应的含有酰肼基团的化合物；或均为与蛋白质中的氨基酸残基发生反应的非特异反应基团的含有苯基叠氮基团化合物或双吖丙啶；所述的交联剂，其两侧基团分别为上述任一反应基团的化合物。
4.如权利要求3所述的一种基于相分离的交联剂载体，其特征在于：所述的含有琥珀酰亚胺基团的化合物为磺酸基-琥珀酰亚胺和羟基-琥珀酰亚胺中的一种或两种；所述的含有苯基叠氮基团化合物为硝基苯叠氮基团和卤代苯叠氮基团中的一种或两种。
5.如权利要求2所述的一种基于相分离的交联剂载体，其特征在于：所述聚丙交酯-乙交酯的分子量为5000-100000；所选用的聚乙烯醇的分子量为5000-100000。
6.一种权利要求1-5任一项所述的基于相分离的交联剂载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：载体通过相反转的方式制备，将聚丙交酯-乙交酯、用于蛋白质复合物分析的交联剂、双十二烷基二甲基溴化铵溶于乙腈或者丙酮并搅拌，搅拌时间为0.2h-5h；将以上混合物用流动注射泵滴加至分散剂中，同时搅拌混合溶液，在滴加完毕混合液体后继续搅拌1-24h,搅拌速度为200-800转每分钟。
7.如权利要求6所述的一种基于相分离的交联剂载体的制备方法，其特征在于：其中各组分的质量比为：
聚丙交酯-乙交酯5-200质量份；双十二烷基二甲基溴化铵1-10质量份；用于蛋白质复合物分析的交联剂1-80质量份；乙腈或丙酮100-10000质量份；分散剂2000-1000000质量份。
8.如权利要求6所述的基于相分离的交联剂载体的制备方法，其特征在于：所述分散剂为超纯水、质量百分浓度为0-5％的聚乙烯醇水溶液或质量百分浓度为0-5％的NaCl水溶液。
9.一种权利要求1-5任一项所述的基于相分离的交联剂载体中的交联剂的包载量测试方法，其特征在于：载体经过三次超纯水洗涤离心后，用乙腈或者丙酮溶解，经过固相萃取柱后，经高效液相色谱测试用于蛋白复合物原位分析的交联剂的绝对含量。
10.一种权利要求1-5任一项所述的基于相分离的交联剂载体中的交联剂的释放量测试方法，其特征在于：每一质量份的载体经过三次超纯水洗涤离心后将其加入含有50-150质量份磷酸盐缓冲溶液(PBS)、0-20质量份吐温(T-20，T-60，T-80)和0-5质量份二甲基亚砜(DMSO)的复合体系中，采取如权利要求8中的方法测试剩余载体中用于蛋白复合物原位分析的交联剂的绝对含量，并取该体系混合溶液用高效液相色谱测试溶液体系中用于蛋白复合物原位分析的交联剂。
11.一种权利要求1-5任一项所述的基于相分离的交联剂载体的应用，其特征在于：载体与细胞在1640培养液或者DMEM培养液中进行共孵育，孵育1-12小时后，收集细胞，然后利用离子液体从细胞提取蛋白质和蛋白质复合物，采用膜上变性、还原、烷基化的方法对提取蛋白质和蛋白质复合物进行预处理。
12.如权利要求10所述的应用，其特征在于：对蛋白质复合物进行胞内交联后，进行样品预处理后，最后利用nano LC-MS/MS进行蛋白质组数据采集。
13.如权利要求10所述的应用，其特征在于：用于鉴定的蛋白质复合物的来源为：细胞蛋白质提取液、胞浆蛋白质提取液、血浆蛋白质提取液、组织蛋白质提取液、单一蛋白质复合物中的一种或二种以上。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20210312 |