CN102933554A - 用于研究蛋白质-蛋白质相互作用的交联试剂、方法和组合物 - Google Patents

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CN102933554A CN201180011973XA CN201180011973A CN102933554A CN 102933554 A CN102933554 A CN 102933554A CN 201180011973X A CN201180011973X A CN 201180011973XA CN 201180011973 A CN201180011973 A CN 201180011973A CN 102933554 A CN102933554 A CN 102933554A
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Abstract

本发明提供用于研究蛋白质-蛋白质相互作用的试剂、方法和组合物。本发明的系统和方法使蛋白质-蛋白质相互作用的体内和体外分析成为可能。与现有光交联方法相比本发明的系统和方法的各实施方案提供的优点包括，例如，(i)新型可逆交联剂，其使交联产物易于分离、纯化和富集；(ii)基于三氟甲基苯基二氮丙啶或全氟苯基二氮丙啶的光交联剂，其提供高的标记特异性、无副产物和更高的光交联效率；(iii)多功能间隔基，其使接触位点的系统标测成为可能；(iv)基于可逆连接化学分离、纯化和检测交联产物的新方法；以及(v)能够在体外、原位和体内研究相互作用位点。

Description

用于研究蛋白质-蛋白质相互作用的交联试剂、方法和组合物
优先权要求
本申请要求2010年3月2日提交的第61/309,512号美国临时申请的优先权权益，且其全部内容为所有目的通过引用结合到本文中。
技术领域
本发明涉及用于研究和操纵蛋白质-蛋白质相互作用的交联试剂、方法和组合物。更具体而言，本发明涉及用于鉴定结合亚单位并从分子水平标测蛋白质-蛋白质相互作用接触位点的组合物和方法以及基于其的应用。
背景技术
蛋白质-蛋白质相互作用在调控细胞生理功能(例如基因表达、转运、信号转导和细胞周期控制)中起到重要作用。相互作用蛋白伴侣和相关接触位点的识别可以有助于理解蛋白质功能，并有助于发现和提供开发治疗和诊断方法和试剂的新途径。然而，由于蛋白质之间的多种相互作用为时短暂，由于技术困难如X光和NMR等用于探析复合物三维结构的一般技术不是特别有用。需要开发替代的生化方法进行蛋白质-蛋白质相互作用的结构-功能研究。
交联剂是很有发展前途的研究蛋白质-蛋白质相互作用的工具(例如，Freedman，R.B.Trends Biochem.Sci.1979，193-197；Herrmann，等Methods Cell Biol.2001，65，217-230；Fancy，D.A.Curr.Opin.Chem.Biol.2000，4，28-32；Fasold，等Angew.Chem.Internat.Edit.1971，10，795-801)。交联剂一般是有机小分子，含有两种与蛋白质侧链上的官能团反应的化学基团(双功能)。相互邻近的蛋白质可通过交联剂共价连接。交联剂有两类。第一类是可通过光解作用结合的可光活化交联剂。第二类是可在特定化学条件下结合的化学交联剂。采用可光活化试剂进行的共价交联是研究短时蛋白质-蛋白质相互作用的优选方法，因为这些试剂与任何邻近C-H键的反应活性高并具有非特异性插入的特性。
过去数十年来科兰纳(Khorana)实验室在以视紫质为模型系统，开发用于从分子水平研究蛋白质-蛋白质相互作用的结构和功能的实用光交联策略方面处于前沿地位。例如，针对研究视紫质-转导素相互作用设计了具有多项特定性质的3-(4-(((4-硝基-3-羧苯基)二硫代)甲基-t)-苯基)-3-(三氟甲基)-3H-二氮丙啶交联剂(DTDA，图7a；Resek，等J.Org.Chem.1993，58，7598-7601)。DTDA能够与附近的半胱氨酸形成二硫键。DTDA可通过结合位点特异性的视紫质突变体被靶定于蛋白质的唯一位置。此外，在碳烯形成以后，放射性标记可在二硫键断裂后被转移至插入位点。这种化合物已经成功应用于采用凝胶电泳和荧光摄影成像技术进行的转导素结合亚单位的确定(Resek，等等Pro.Natl.Acad.Sci.USA.1994，91，7643-7647)。但是，由于合成工艺困难和放射性，DTDA并未得到广泛应用。
为表征相互作用蛋白的接触位点，科兰纳(Khorana)实验室进一步扩展了该方法，从而涵盖蛋白质消化、肽片段的链霉亲和素/生物素纯化和质谱。采用的是一种可生成氮烯的可商购芳基叠氮化物N-((2-吡啶二硫代)乙基)-4-叠氮水杨酰胺(PEAS，图7b)(Cai，等Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001.98，4877-4882)。该方法有多种缺点。1)由于使用一种低等光交联剂，数据不明确，交联效率低。简单芳基叠氮化合物的光解释放出单线态氮烯，其在室温下可迅速(10-100皮秒)异构化为强的亲电子化合物(苯氮丙啶(benzazirine)和环庚四烯)，并经历双分子反应(Gritsan等J.Am.Chem.Soc.2001，123，1951-1962)。该反应导致不在接触位点附近的氨基酸发生交联。简单芳基氮烯也不能插入未活化的C-H键，并导致交联产物的得率非常低。2)当前方法不能为质谱分析提供一种高效捕获和洗脱交联产物的工具。光交联作用通常产生低浓度的杂合交联产物。目前，最常用的交联产物的纯化处理是借助于巯基官能团引入生物素。该生物素分子通过固定化的链霉亲和素实现交联产物的非共价捕获，且交联产物以大量过量的生物素洗脱出来。但是，在此类非共价捕获系统中，捕获的交联产物可能在洗涤步骤中被稀释或损失。大量过量生物素的存在降低了质谱检测的灵敏度。3)第三个缺点是由于与巯基化合物相关的问题。硫醇化学与肽化学不是正交的。在引入生物素单元以前，必须封锁蛋白质上的所有半胱氨酸残基。封锁处理增加了一个额外步骤并使数据分析复杂化。此外，当处理非常稀的溶液(例如飞摩尔范围)时，来自任何含半胱氨酸的污染物(例如来自头发的细胞角蛋白)的胰蛋白酶片段会与生物素反应并干扰质谱数据。最后，为了防止游离硫醇的氧化，在整个过程中必须维持还原/惰性环境。理想的情况下纯化处理应当与肽官能团是正交的。
在科兰纳(Khorana)实验室中Y.Huang采用一种新合成的DTDA类似物化合物N-(2-(4-硝基-3-羧苯基)二硫代乙基)-4-(3-(三氟甲基)-3H-二氮丙啶-3-基)-苯甲酰胺(NETDB，图7c)和荧光标记纯化策略(图8)，进一步改良了这种一般方法。HPLC用于纯化胰岛素所消化的交联的肽(Huang，Y.，Khorana，H.G.″Mapping of Contact Sites inInteraction between Transducin and Light-Activated Rhodopsin.″，第17届蛋白质学会年会，2003年7月26-30日，波士顿，马萨诸塞州)。光交联产率大幅增加，且荧光成像仪可轻松检出交联的亚单位(图9)。已经鉴定出一些胰蛋白酶肽。但是，尚未从分子水平上识别出任何接触位点。
如果要建立一种从分子水平的相互作用蛋白的结构确定的一般方法，有一些问题仍然需要解决：i)用于捕获相互作用蛋白的新型且高效的交联剂；ii)带有用于测定接触位点之间距离的可变间隔基的交联剂；iii)提高检测效果的分离、纯化及样品富集的方法，例如通过质谱分析；iv)多种检测方法；v)检测一个蛋白质无需纯化的系统中蛋白质-蛋白质相互作用的方法；以及vi)可断裂二硫键的取代。
发明简述
本发明部分基于用于鉴定和量化相互作用所涉及的蛋白伴侣和/或从分子水平表征蛋白质-蛋白质相互作用的接触位点的方法和交联剂的发现。本发明的系统和方法使相互作用蛋白伴侣的分析和表征可在一个蛋白质无需纯化的系统中进行，例如在膜或细胞系统中。此外，本发明的系统和方法使得从分子水平标测蛋白质-蛋白质相互作用的接触位点成为可能。与现有光交联方法相比，本发明的各实施方案带来的优点包括，例如：(i)便于分离、纯化和富集交联产物的新型可逆交联剂；(ii)实现高标记特异性、无副产物和更高光交联效率的基于三氟甲基苯基二氮丙啶或全氟化苯基叠氮化合物的光交联剂；(iii)交联剂中引入的模块化间隔基使接触位点的系统标测成为可能；(iv)基于肟、腙、氨基脲或氨基硫脲键的交联产物的分离、纯化和检测方法；以及(v)能够在体外、原位和体内研究相互作用位点。
本发明提供用于检测蛋白质-蛋白质相互作用和/或表征已知和新型蛋白质-蛋白质相互作用的方法、组合物和试剂盒。例如，本发明提供一种检测大量细胞中蛋白质-蛋白质相互作用的方法，其中在允许体内引入交联剂的特定位置，单个细胞表达结合氨基酸(例如半胱氨酸)或醛氨基酸类似物的目标蛋白。因此，本发明可用于识别那些与目标蛋白相互作用的蛋白，以及接触该蛋白的氨基酸。通过改变氨基酸的位置和/或使用系统化设计的交联剂，该方法使两种蛋白质间的接触位点的标测成为可能。
此外，本发明可用于表征各种化学、遗传、营养和环境条件下的已知和新型的蛋白质-蛋白质相互作用。例如，可检测从分子水平增强或破坏蛋白质-蛋白质相互作用的分子或化学物质的作用。此外，可检测具有不同遗传背景(例如存在或缺失致癌基因)的细胞系中的蛋白质-蛋白质相互作用。
此外，本发明可用于采用纯化的蛋白质或含目标蛋白的部分组织和细胞来表征体外的已知蛋白质-蛋白质相互作用。例如，可对蛋白质进行基因改性以包含一个用于结合交联剂的单官能团。
一方面，本发明一般涉及一种具有式(I)的交联剂
FG2—SP1—W  (I)
其中
FG2是一种化学官能团，选自氨氧基、醛基、酮基、酰肼基、氨基脲基和氨基硫脲基。
SP1是一种间隔基，选自化学键、取代或未取代的(C1-C24)烷基、取代或未取代的(C1-C24)杂烷基、聚乙二醇基、多元醇基、多元胺基、聚酯基、聚磷酸二酯基、肽和拟肽基；和
W是一种化学或光交联基团，选自芳酮基、叠氮基、重氮基、二氮丙啶基、烯酮基、烯基、二羰基、环氧基、有机硅烷基、异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、酰叠氮基、酯基、磺酰氯基、碳酸酯基、酰亚胺酯基、酐基、卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基、乙烯砜基、硫酯基、二硫化物基团和巯基。
在一些实施方案中，酯基选自N-羟基琥珀酰亚胺酯和氟苯基酯基团。W可为取代或未取代的三氟甲基苯基二氮丙啶基团。在某些实施方案中，W为全氟苯基叠氮基团。在某些其它实施方案中，W为卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基或N-羟基琥珀酰亚胺酯基团。
另一方面，本发明一般涉及一种具有式(II)的交联剂
Figure BPA00001609391600051
其中
R1和R2独立地为H、CH3、取代的C1-C5烷基、或芳基；
SP1是一种间隔基，选自化学键、取代或未取代的(C1-C24)烷基、取代或未取代的(C1-C24)杂烷基、聚乙二醇基、多元醇基、多元胺基、聚酯基、聚磷酸二酯基、肽和拟肽基；以及
W是一种化学或光交联基团，选自芳酮基、叠氮基、重氮基、二氮丙啶基、烯酮基、烯基、二羰基、环氧基、有机硅烷基、异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、酰叠氮基、N-羟基琥珀酰亚胺酯基、氟苯基酯基、磺酰氯基、碳酸酯基、酰亚胺酯基、酐基、卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基、乙烯砜基、硫酯基、二硫化物基团和巯基。
在又一方面，本发明一般涉及一种具有式(III)的交联剂
V—SP2—L—SP1—W(III)
其中
V是一种化学交联剂，选自异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、酰叠氮基、酯基、磺酰氯基、碳酸酯基、酰亚胺酯基、酐基、卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基、乙烯砜基和硫酯基；
W是一种化学或光交联基团，选自芳酮基、叠氮基、重氮基、二氮丙啶基、烯酮基、烯基、二羰基、环氧基、有机硅烷基、异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、酰叠氮基、酯基、磺酰氯基、碳酸酯基、酰亚胺酯基、酐基、卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基、乙烯砜基、硫酯基、二硫化物基团和巯基。
每一个SP1和SP2独立地为一种间隔基，选自化学键、取代或未取代的(C1-C24)烷基、取代或未取代的(C1-C24)杂烷基、聚乙二醇基、多元醇基、多元胺基、聚酯基、聚磷酸二酯基、肽和拟肽基；而且
L是肟键。
在又一方面，本发明一般涉及一种用于标记蛋白质或肽的具有式(V)的试剂：
S——Y——T1——T2------Tn——Z  (V)
其中
S是一种固体载体；
Y是一种可裂解键；
T1，T2，...Tn是一种标记分子；
n是一个选自1、2、3、4、5和6的整数；和
Z是一种能够与醛、酮或氨氧基反应的交联基团。
在又一方面，本发明一般涉及一种表征两种蛋白质间的相互作用的方法。该方法包括：
提供待检测的第一蛋白，其中第一蛋白位于细胞环境、蛋白质混合物、膜中或经过纯化，并包含选自巯基、醛、酮、氨氧基、酰肼或胺的官能团；
提供具有式(I)、(II)或(III)的可逆交联剂；
在允许交联基团结合入第一蛋白的条件下，使第一蛋白和可逆交联剂结合；
提供相互作用蛋白伴侣，并在第一蛋白与第二蛋白相互作用的条件下使相互作用蛋白伴侣与第一蛋白结合，从而在施加光解或化学条件时使其进入交联基团和第二蛋白的反应范围，以形成共价稳定的蛋白复合物；和
在使可逆键断裂并释放第一蛋白和交联的含官能团的相互作用蛋白伴侣的裂解条件下，温育交联的蛋白复合物。
在一些实施方案中，第一蛋白是一种膜蛋白或G-蛋白耦合受体。在某些实施方案中，第一蛋白通过非共价相互作用或共价交联附着在固体载体上。在一些实施方案中，载体基质包括葡聚糖、琼脂糖、二氧化硅、合成聚合物，或与抗体、配体或表位标记共价耦合的葡聚糖、琼脂糖、二氧化硅或合成聚合物。相互作用蛋白伴侣可例如为膜相关蛋白或G蛋白。
在又一方面，本发明一般涉及一种用于分离交联产物的方法。该方法包括：
提供带有能够与第二官能团反应形成可逆键的第一官能团的固体载体；
提供非交联蛋白和交联的带第二官能团的蛋白的混合物；
在允许第一官能团和第二官能团反应形成可逆键的条件下，使非交联蛋白和交联蛋白的混合物与固体载体结合；
将交联的固载第二蛋白与非交联蛋白分离；
在允许带第一官能团的固体载体释放的条件下温育固载第二蛋白，从而使交联的带第二官能团的第二蛋白再生；
将交联的带第二官能团的蛋白与固体载体分离；
消化交联的第二蛋白以获得肽混合物，其中消化为化学法、酶法或两者的组合；
提供另一种带第一官能团的固体载体，并在允许第一官能团和第二官能团反应形成可逆键的条件下，使其与经消化的肽混合；
将交联的带第二官能团的固载肽与非交联肽分离；
在最少量裂解缓冲液中温育交联的固载肽，以使交联的带第二官能团的肽再生；和
将交联的肽与固体载体分离，并直接进行肽的检测。
在又一方面，本发明一般涉及一种用于纯化交联产物的方法。该方法包括：
提供(i)带第二官能团的标记分子，其中第二官能团能够与第一官能团反应形成可逆键，以及(ii)非交联蛋白与交联的带第一官能团的第二蛋白的混合物；
在允许第一官能团和第二官能团反应形成可逆键的条件下，使非交联蛋白和交联蛋白的混合物与带标记分子结合；
从非交联蛋白中纯化被标记的交联的第二蛋白；
消化交联的第二蛋白以获得肽混合物；
从非交联肽中纯化被标记的交联的肽；和
收集并浓缩交联的肽进行检测。
在又一方面，本发明一般涉及一种检测交联蛋白质或肽的方法。该方法包括：
(a)提供带有第一官能团的标记分子和含第二官能团的蛋白质或肽，其中第二官能团能够与第一官能团反应形成可逆键；
(b)在形成可逆接头的条件下，使蛋白质或肽与第一标记分子混合；
(c)使经标记的蛋白质或肽进行基于第一标记分子的检测和/或纯化方法；
(d)使可逆接头裂解，释放含第二官能团的蛋白质和肽；
(e)在形成可逆接头的条件下，使蛋白质与第二标记分子混合；
(f)使经标记的蛋白质或肽进行基于第二标记分子的检测和/或纯化方法；并且
(g)重复步骤(c)、(d)和(e)以便结合其它检测方法。
在一些实施方案中，标记分子具有式(VI)：
T——FG1(VI)
其中FG1是一种化学官能团，选自氨氧基、醛、酮、酰肼、氨基脲和氨基硫脲；T是一种标记单元。
蛋白质或肽的检测可采用一种选自免疫测定、微阵列、显微镜检查、荧光显微镜检查、电子显微镜检查、电泳、分光光谱显色反应、放射检测、酶活性、摄影术、磁场测量、传感器、电磁能检测和化学检测的技术。
分光光谱技术可以是SELDI、MALDI、电喷雾质谱、荧光光谱、NMR、UV-Vis或X射线结晶。
在又一方面，本发明一般涉及一种具有式(VII)的共价交联的蛋白质或肽：
FG2—SP2—W′-P    (VII)
其中，P是一种蛋白质或肽；
SP2是一种间隔基，选自化学键、取代或未取代的(C1-C24)烷基、取代或未取代的(C1-C24)杂烷基、聚乙二醇基、多元醇基、多元胺基、聚酯基、聚磷酸二酯基、肽和拟肽基；
FG2是一种化学官能团，选自氨氧基、醛、酮、酰肼、氨基脲和氨基硫脲；和
W’是W与蛋白质或肽中的官能团反应形成的一种连接单元，其中W是一种化学或光交联基团，选自芳酮、叠氮化物、重氮化合物、二氮丙啶、烯酮、烯烃、二羰基、环氧化物、有机硅烷、异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、活性酯，例如，碳酸酯、酰亚胺酯、酐、卤代乙酰和烷基卤化物衍生物、马来酰亚胺、乙烯砜衍生物、硫酯、二硫化物和巯基。
在又一方面，本发明一般涉及一种含有蛋白质或肽和可逆交联剂的蛋白质或肽结合物。该结合物具有以下式(VIII)：
S′——L—SP2—W′-P    (VIII)
其中
S’是一种固体载体或检测分子；
P是一种肽或蛋白质；
SP2是一种间隔基，选自化学键、取代或未取代的(C1-C24)烷基、取代或未取代的(C1-C24)杂烷基、聚乙二醇基、多元醇基、多元胺基、聚酯基、聚磷酸二酯基、肽和拟肽基；
L是一种可逆键，含有肟、腙、氨基脲或氨基硫脲键键；
W’是W与蛋白质或肽中的官能团反应形成的一种连接单元，其中W是一种化学或光交联基团，选自芳酮、叠氮化物、重氮化合物、二氮丙啶、烯酮、烯烃、二羰基、环氧化物、有机硅烷、异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、活性酯，例如但不限于，N-羟基琥珀酰亚胺酯和氟苯基酯、磺酰氯、碳酸酯、酰亚胺酯、酐、卤代乙酰和烷基卤化物衍生物、马来酰亚胺、乙烯砜衍生物、硫酯、二硫化物和巯基。
在一些实施方案中，S’是一种固体载体，选自取代或未取代的葡聚糖、琼脂糖、硅胶或聚乙二醇连接的固体载体。在其它一些实施方案中，S’是一种选自荧光、放射性、紫外活化、同位素、哌嗪、叔胺、发色团的单元。参看以下附图、详细说明和权利要求可更全面地理解本发明的前述特点和实施方案。
定义
如本文中所使用的术语“肽”是指通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物。通常，肽的长度为至少两个氨基酸。生物化学中通常理解的肽键是一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基之间的酰胺键。肽的优选大小范围为2至40个氨基酸。术语肽还可指氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基为相应天然氨基酸的人工化学类似物。本文中术语“肽”的用途还涵盖了其中有一个或多个氨基酸残基为不对应于任何天然氨基酸的“非天然”氨基酸的氨基酸聚合物。
如本文中所使用的术语“蛋白质”是指通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物。该术语旨在涵盖任何大小、结构或功能的蛋白质和多肽。但是，通常蛋白质的长度为至少10个氨基酸。蛋白质可以是天然的、重组的、或合成的、或其任意组合。蛋白质还可以是一种天然蛋白质的片段。蛋白质可以是单一分子或多分子复合物。术语蛋白质还适用于其中有一个或多个氨基酸残基为相应天然氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物。本文中术语“蛋白质”的用途还涵盖了其中有一个或多个氨基酸残基为不对应于任何天然氨基酸的“非天然”氨基酸的氨基酸聚合物。
如本文中所使用的术语“蛋白质片段”是指作为另一种蛋白质的一部分的肽。例如，蛋白质片段可以是通过消化全长蛋白获得的肽。蛋白质片段通常包含至少两个氨基酸。
术语“光交联”和“光活性”是指一种含有在活性光存在下反应导致交联的光官能团的化合物。光活性基团可包括但不限于叠氮化物、二氮丙啶或核苷类似物。活性光可具有可见光或不可见光的波长。在一些实施方案中，活性光是紫外(UV)光。
术语“氨基酸侧基”是指一种包括氨基酸单元的取代基，其中氨基酸单元可来自天然氨基酸或合成(非天然)氨基酸。天然氨基酸包括所有天然存在的氨基酸，包括所有标准和非标准的氨基酸。氨基酸的非限制性实例包括以下非限制性实例：胍丁胺、β-胍丁胺、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、β-苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。合成氨基酸是其中一个或多个原子或键被替代或取代的天然氨基酸。
术语“交联(crosslink)”、“交联(crosslinking)”、“交联的(crosslinked)”及其语法派生词是指分子或固体载体之间的共价键合或键。
如本文中所使用的术语“烷基”是指具有例如1至20个碳原子，通常为1至约12个，1至约6个或1至约4个碳原子的支链、无支链或环状烃。实例包括但不限于甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-甲基-1-丙基、2-丁基、2-甲基-2-丙基(叔丁基)、1-戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2，3-二甲基-2-丁基、3，3-二甲基-2-丁基、己基、辛基、癸基、十二烷基等。烷基可以是未取代或取代的。
如本文中所使用的术语“烃基”是指相关基团主要由氢和碳原子组成并通过碳原子连接至分子的其它部分的基团，但是该基团不排除存在其比例不足以改变基团的基本烃性质的其它原子或基团。烃基优选为仅由氢和碳原子组成。烃基优选为脂族基，更优选为烷基或亚烷基，尤其是烷基，其可为直链或支链。
除非另有说明，术语“芳基”是指单环或稠合在一起或共价连接的多环(包括但不限于1至3环)的多不饱和芳族烃取代基。术语“杂芳基”是指含有一至四个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子任选地被氧化，氮原子任选地被季铵化。杂芳基可通过杂原子连接至分子的其它部分。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。
如本文中所使用的术语“质量标记”是指(i)具有固定质量，(ii)可连接至肽或蛋白质，且(iii)其质量可用质谱测定的任何化学单元。质量标记包括，例如有机小分子等化学单元，且具有例如100Da至2500Da的质量。
在本说明书中，当组合物被描述为具有、包括或包含特定成分时，或当工艺被描述为具有、包括或包含特定工艺步骤时，其旨在表示本发明的组合物也主要由或由上述成分组成，且本发明的工艺也主要由或由上述工艺步骤组成。此外，应当了解的是，只要本发明保持可操作性，步骤的顺序或执行某些操作的顺序是不重要的。此外，两个或更多步骤或操作可同时进行。
附图简要说明
图1显示具有式(I)、(II)、(III)和(IV)的可逆交联剂的结构。
图2显示共价捕获两种蛋白质间的相互作用的一般方法。
图3显示一种分离交联产物的一般方法。
图4显示一种纯化交联产物的一般方法。
图5显示一种基于可逆连接化学的多维检测方法。
图6显示单个多功能标记的结构及其多维检测用途。
图7显示科兰纳(Khorana)实验室中采用的蛋白质-蛋白质相互作用研究用光交联剂(DTDA、PEAS和NETDB)的一般化学结构。
图8是以视紫质作为模型系统研究蛋白质-蛋白质相互作用的光交联策略的示例实例。以巯基特异性的交联剂NETD将视紫质的单半胱氨酸取代突变体衍生化，该交联剂光解时产生反应性碳烯中间体，导致转导素的交联。视紫质K248C和转导素(T)之间交联产率的实例为约1％。T中的交联位点由涉及以下步骤的策略确定：(1)以N-乙基马来酰亚胺使交联的蛋白质中的所有游离半胱氨酸衍生化；(2)将连接两个蛋白的二硫键还原，并分离产生的带有含游离SH基的交联单元的所有T衍生物；(3)通过形成硫醚对巯基交联产物进行德克萨斯红荧光标记；(4)采用固定化胰岛素降解产生的T衍生物，并以C18反相HPLC分离荧光标记的T肽；以及(5)以基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱鉴定被分离的肽。
图9是显示视紫质突变体(A241C和K67)和转导素之间的相互作用涉及的转导素结合亚单位的鉴定的凝胶电泳的典型照片。未结合视紫质的1D4-琼脂糖用作对照，在A241C和K67情况下衍生化和交联条件相同。分离含有交联样品的凝胶并通过荧光成像显像。在标记物中(第1泳道)，只有带红色染料的预染蛋白是可见的(63.8KDa)。德克萨斯红马来酰亚胺或溶剂改性的德克萨斯红迁移至凝胶的最前沿。在40KDa左右仅观察到一个A241C(第2泳道)和K67C(第3泳道)的主条带，对应于转导素α亚单位。
图10显示具有肽间隔基和可逆肟键的异双功能光交联剂的典型合成途径。
图11显示具有乙二醇和亚甲基间隔基的光交联剂的典型合成途径。
图12显示具有乙二醇和亚甲基间隔基的可裂解肟连接的光交联剂的典型合成途径。
图13显示具有乙二醇或亚甲基间隔基的可裂解二硫化物连接的光交联剂的典型合成途径。
图14显示含乙二醇或亚甲基间隔基的可裂解肟连接的光交联剂的另一种典型合成途径。
图15是N-邻苯二甲酰亚胺基氧基醋酸和4-(3-三氟甲基-3H-二氮丙啶-3-基)苯甲酸的NHS酯形成的典型HPLC数据。
图16是化合物J1、J2和J3的NHS酯耦合反应的典型HPLC数据。
图17是纯化的化合物k1和l1的典型HPLC数据。
图18显示在可裂解固体载体上酰胺键连接的多功能蛋白质标记试剂的典型合成途径。
图19是分离和/或纯化交联的含氨氧基的肽片段的示例实例。发明的详细说明
在最简单的意义上，本发明旨在通过共价交联方法检测和表征蛋白质-蛋白质相互作用，例如，通过采用凝胶电泳检测共价蛋白复合物或采用质谱识别交联位点。本发明提供适用于研究蛋白质-蛋白质相互作用并从分子水平标测相互作用位点的系统设计的可逆交联剂的新型化学组合物。本发明还提供基于新型可逆接头的分离、纯化和/或富集交联的肽片段的方法。此外，本发明提供用于多维检测的新型蛋白标记试剂。这些采用可逆交联剂的方法的组合产生了以简便、准确和灵敏的方式标测蛋白质-蛋白质相互作用的接触位点的改进的一般方法。
本发明的方法具有某些优点，包括(1)能够例如在细胞中研究未纯化蛋白质的蛋白质-蛋白质相互作用；(2)以亚皮摩尔范围检测蛋白质-蛋白质相互作用；和(3)相互作用的接触位点的标测最终可获得复合物的结构。
科兰纳实验室和其他人以前开发的用于识别交联位点的技术在很大程度上依赖于低效的产氮烯光交联剂和非共价亲和素/生物素相互作用来捕获交联的肽片段(Cai等Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001，98，4877-4882)。在这种方法中，细胞质面上视紫质的单半胱氨酸突变体成为交联剂连接的初始位置。采用了一种带可裂解巯基的双功能交联剂来连接视紫和产氮烯可光活化试剂，用以共价交联转导素。光交联产物可用胰岛素消化并用质谱分析。更具体而言，转导素(T)中交联位点的识别包括以下步骤：(i)以N-乙基马来酰亚胺将交联的蛋白质中的所有游离半胱氨酸衍生化；(ii)还原连接两种蛋白质的二硫键，并分离带有含游离巯基交联单元的T(Tα)化合物的所有α亚单位；(iii)以生物素类似物将SH衍生化；(iv)以胰岛素降解产生的Tα衍生物，并以亲和素-琼脂糖色谱分离Tα肽；以及(v)以MALDI-TOF MS鉴别分离的肽。氮烯光交联剂以低效的光解作用和非特异性标记而著称。通过氮烯交联获得的数据可能是不可靠的。以生物素/亲和素捕获肽片段时，肽片段的洗脱(皮摩尔范围)中采用了大量过量的生物素(微克级)。百万倍的疏水性生物素的存在造成质谱分析过程中的高背景信号。结果是采用这种方法只能获得很少的结构数据或无法获得结构数据。
在科兰纳实验室，Y.Huang对本方法的进一步改进主要集中在基于溶液的肽片段的纯化策略以及用于测定接触位点的先进MS/MS裂解技术(Huang，Y.，Khorana，H.G.(2003))″Mapping ofContact Sites in Interaction between Transducin and Light-ActivatedRhodopsin.″第17届蛋白质学会年会，2003年7月26-30日，波士顿，马萨诸塞州)。因此，在交联后采用德克萨斯红马来酰亚胺进行巯基的衍生化。荧光标记使交联的亚单位的直接显像和HPLC纯化后衍生化肽片段的检测成为可能。但是，由于样品量有限，迄今为止产生的数据要么令人疑惑不解要么难以解读。
其它缺点限制了光交联方法的威力。例如，待研究的第一蛋白必须含有单个巯基，这一点通常通过半胱氨酸致突变作用实现。半胱氨酸是一种天然氨基酸，存在于几乎所有蛋白质中。半胱氨酸多重突变可能形成错误折叠的蛋白质，或可能影响折叠蛋白的活性。此外，为了便于光交联和洗涤，待分析的第一蛋白必须进行纯化并通过抗体以非共价方式附着在固体载体上。并非所有蛋白均可大量表达并通过亲和柱纯化。例如，大多数G蛋白耦合受体的亲和纯化体系都尚未建立。此外，由于待交联的第二蛋白中存在天然半胱氨酸，需要采用一个额外步骤来封锁这些半胱氨酸的氨基酸，这导致样品的进一步损失并使最终数据的分析复杂化。
以上方法的另一个缺点是，在含光交联蛋白的巯基衍生化后产生了稳定的键。蛋白质或肽只能用于一种检测方法而且样品不能重复使用。这是样品量低的一个潜在问题。例如，在一次典型的视紫质-转导素交联实验中，几纳摩尔的起始原料视紫质只能获得几皮摩尔的交联产物。
这种方法的另一个缺点是基于苯基二氮丙啶的试剂的种类有限。因此，基于单一的苯基二氮丙啶基试剂不可能揭示完整的结构。
本发明提供比上述方法更通用的用于研究蛋白间相互作用的方法和组合物。本发明提供用于系统标测相互作用的接触位点的一系列新型可逆光交联剂。此外，本发明提供一种通过可逆键分离和/或纯化交联产物的新方法。另外，本发明提供一种可实现超灵敏检测的样品富集方法。总而言之，这些试剂和改进方法使检验蛋白质-蛋白质相互作用和/或表征已知和新型蛋白质-蛋白质相互作用的新平台的建立成为可能。例如，本发明提供一种检验大量细胞中蛋白质-蛋白质相互作用的方法，其中在允许体内引入交联剂的特定位置，各个细胞表达结合天然或人工氨基酸的目标蛋白。该氨基酸可以是半胱氨酸，或是含有一个与天然氨基酸正交的官能团(例如醛基)的氨基酸类似物。因此，本发明可用于识别与目标蛋白相互作用的那些蛋白和接触该蛋白的氨基酸。通过改变氨基酸的位置和/或使用系统化设计的交联剂，该方法使两种蛋白质间的接触位点的全面标测成为可能。
此外，本发明可用于表征各种化学、遗传、营养和环境条件下的已知和新型蛋白质-蛋白质相互作用。例如，可检测增强或阻断蛋白质-蛋白质相互作用的分子或化学物质的作用。还可检测具有不同遗传背景(例如存在或缺失致癌基因)的细胞系中的蛋白质-蛋白质相互作用。
此外，本发明可用于采用纯化的蛋白质或含目标蛋白的部分组织和细胞表征体外的已知蛋白质-蛋白质相互作用。例如，可对蛋白质进行基因改性以包含一个用于结合光或化学反应性基团的单官能团。
一方面，本发明一般涉及具有式(I)的交联剂
FG2—SP1—W(I)
其中
FG2是一种化学官能团，选自氨氧基、醛基、酮基、酰肼基、氨基脲基和氨基硫脲基。
SP1是一种间隔基，选自化学键、取代或未取代的(C1-C24)烷基、取代或未取代的(C1-C24)杂烷基、聚乙二醇基、多元醇基、多元胺基、聚酯基、聚磷酸二酯基、肽和拟肽基；和
W是一种化学或光交联基团，选自芳酮基、叠氮基、重氮基、二氮丙啶基、烯酮基、烯基、二羰基、环氧基、有机硅烷基、异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、酰叠氮基、酯基、磺酰氯基、碳酸酯基、酰亚胺酯基、酐基、卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基、乙烯砜基、硫酯基、二硫化物基团和巯基。
在一些实施方案中，酯基选自N-羟基琥珀酰亚胺酯和氟苯基酯基团。W可为取代或未取代的三氟甲基苯基二氮丙啶基团。在某些实施方案中，W为全氟苯基叠氮基。在某些其它实施方案中，W为卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基或N-羟基琥珀酰亚胺酯基团。
本发明的交联剂的实例包括具有结构式(A)的试剂：
Figure BPA00001609391600181
其中R6选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；其中每一个n是独立选自1至16(包括端点)的整数。R8是H或烷基。
本发明的交联剂的实例包括具有结构式(B)的试剂：
Figure BPA00001609391600182
其中R5和R6独立选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；其中每一个n是独立选自1至16(包括端点)的整数。R8是H或烷基。
本发明的交联剂的实例包括具有结构式(C)的试剂：
Figure BPA00001609391600191
其中每一个R5和R6独立选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；其中每一个n是独立选自1至16(包括端点)的整数。
本发明的交联剂的实例包括具有结构式(D)的试剂：
Figure BPA00001609391600192
其中R5选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；其中每一个n是独立选自1至16(包括端点)的整数；R8是H或烷基。
本发明的交联剂的实例包括具有结构式(E)的试剂：
Figure BPA00001609391600193
其中每一个R独立地为氨基酸侧基。
在另一方面，本发明一般涉及具有式(II)的交联剂
Figure BPA00001609391600194
其中
R1和R2独立地为H、烷基、或芳基；
SP1是一种间隔基，选自化学键、取代或未取代的(C1-C24)烷基、取代或未取代的(C1-C24)杂烷基、聚乙二醇基、多元醇基、多元胺基、聚酯基、聚磷酸二酯基、肽和拟肽基；和
W是一种化学或光交联基团，选自芳酮基、叠氮基、重氮基、二氮丙啶基、烯酮基、烯基、二羰基、环氧基、有机硅烷基、异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、酰叠氮基、N-羟基琥珀酰亚胺酯基、氟苯基酯基、磺酰氯基、碳酸酯基、酰亚胺酯基、酐基、卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基、乙烯砜基、硫酯基、二硫化物基团和巯基。
在某些实施方案中，W是取代的或未取代的三氟甲基苯基二氮丙啶基团。在一些实施方案中，W为全氟苯基叠氮基。在一些实施方案中，W可为卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基或N-羟基琥珀酰亚胺酯基团。
本发明的交联剂的实例包括具有结构式(F)的试剂：
Figure BPA00001609391600201
其中R6选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；且其中每一个n是独立选自1至16(包括端点)的整数；R8是H或烷基。
本发明的交联剂的实例包括具有结构式(G)的试剂：
Figure BPA00001609391600202
其中每一个R5和R6独立选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；其中每一个n是独立选自1至16(包括端点)的整数。
本发明的交联剂的实例包括具有结构式(H)的试剂：
Figure BPA00001609391600203
其中R5选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；且其中每一个n是独立选自1至16(包括端点)的整数；R8是H或烷基。
本发明的交联剂的实例包括具有结构式((I’)的试剂：
Figure BPA00001609391600204
其中每一个R独立选自氨基酸侧基。
在又一方面，本发明一般涉及具有式(III)的交联剂
V—SP2—L—SP1—W(III)
其中
V是一种化学交联剂，选自异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、酰叠氮基、酯基、磺酰氯基、碳酸酯基、酰亚胺酯基、酐基、卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基、乙烯砜基和硫酯基；
W是一种化学或光交联基团，选自芳酮基、叠氮基、重氮基、二氮丙啶基、烯酮基、烯基、二羰基、环氧基、有机硅烷基、异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、酰叠氮基、酯基、磺酰氯基、碳酸酯基、酰亚胺酯基、酐基、卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基、乙烯砜基、硫酯基、二硫化物基团和巯基。
每一个SP1和SP2独立地为一种间隔基，选自化学键、取代或未取代的(C1-C24)烷基、取代或未取代的(C1-C24)杂烷基、聚乙二醇基、多元醇基、多元胺基、聚酯基、聚磷酸二酯基、肽和拟肽基；和
L是肟键。
在某些实施方案中，W是取代的或未取代的三氟甲基苯基二氮丙啶基团。在一些实施方案中，W为全氟苯基叠氮基。在一些实施方案中，W可为卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基或N-羟基琥珀酰亚胺酯基团。
本发明的交联剂的实例包括具有结构式(J)的试剂：
Figure BPA00001609391600211
其中V是卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基或N-羟基琥珀酰亚胺酯基团；每一个R6和R7独立选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；且其中每一个n是独立选自1至16(包括端点)的整数；R8是H或烷基。
本发明的交联剂的实例包括具有结构式(J’)的试剂：
Figure BPA00001609391600221
其中每一个R6和R7独立选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；且其中每一个n是独立选自1至16(包括端点)的整数；R8是H或烷基。
本发明的交联剂的实例包括具有结构式(K)的试剂：
Figure BPA00001609391600222
其中V是卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基或N-羟基琥珀酰亚胺酯基团；每一个R5、R6和R7独立选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；且其中每一个n是独立选自1至16(包括端点)的整数。
本发明的交联剂的实例包括具有结构式(K’)的试剂：
Figure BPA00001609391600223
其中每一个R5、R6和R7独立选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；且其中每一个n是独立选自1至16(包括端点)的整数。
本发明的交联剂的实例包括具有结构式(L)的试剂：
其中V是卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基或N-羟基琥珀酰亚胺酯基团；每一个R5和R7独立选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；且其中每一个n是独立选自1至16(包括端点)的整数；R8是H或烷基。
本发明的交联剂的实例包括具有结构式(L’)的试剂：
Figure BPA00001609391600231
其中每一个R5和R7独立选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；且其中每一个n是独立选自1至16(包括端点)的整数；R8是H或烷基。
本发明的交联剂的实例包括具有结构式(M)的试剂：
Figure BPA00001609391600232
其中V是卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基或N-羟基琥珀酰亚胺酯基团；每一个R独立地为氨基酸侧基。
本发明的交联剂的实例包括具有结构式(M’)的试剂：
Figure BPA00001609391600233
其中每一个R独立地选自氨基酸侧基。
在又一方面，本发明一般涉及一种用于标记蛋白质或肽的具有式(V)的试剂：
S——Y——T1——T2------Tn——Z(V)
其中
S是一种固体载体；
Y是一种可裂解键；
T1，T2，...Tn是一种标记分子；
n是一个选自1、2、3、4、5和6的整数；和
Z是一种能够与醛、酮或氨氧基反应的交联基团。
T可以是一种质量标记、荧光标记、疏水单元、表位标记、放射性单元、发色团单元、紫外活性单元或化学发光标记。
在某些实施方案中，Y和T1，T2，...Z通过酰胺键、C-C键、C-O键或C-N键共价连接。
在某些实施方案中，Z是一个氨氧基团。
该试剂的实例包括具有结构式(N)的化合物：
Figure BPA00001609391600241
其中S是一种固体载体。
A.可逆交联剂
为了探测蛋白质-蛋白质复合物并从分子水平上表征相互作用位点，设计了不同种类的可逆交联剂。图1显示了式(I)、(II)、(III)和(IV)的可逆异双功能交联剂的结构。
可逆交联剂(III)包含：(i)一个可以与目标蛋白反应形成稳定键的化学交联基团(V)；(ii)一个用于分离、纯化和富集交联产物的可逆接头(L)，其中L可在特定化学处理下形成、不形成或断裂，且L键断裂时生成FG2官能团和FG1官能团；(iii)一个可以使相互作用蛋白伴侣交联的化学或光交联基团(W)；(iv)用于连接L和W的第一间隔基(SP1)；和(v)连接L和V(SP2)的第二间隔基。可逆交联剂III可用于衍生化天然蛋白或半胱氨酸突变蛋白，同时借助非二硫键进行交联样品的后处理。
在某些实施方案中，L是肟、腙、氨基脲或氨基硫脲键。在肟键的情况下，键可在弱碱性条件下(例如pH值8-10)裂解，产生FG1和FG2。在一个优选实施方案中，FG2是醛基或酮基，FG1可以是氨氧基团。或者，FG2可以是氨氧基团，FG1可以是醛基或酮基。FG1和FG2可在微酸性条件下(例如pH值4-6.8)反应，使肟键轻松再生。在腙键的情况下，键可在弱碱性条件下(例如pH值8-10)裂解产生FG1和FG2。在一个优选实施方案中，FG2是醛基或酮基，FG1可以是肼或酰肼。或者，FG1可以是肼或酰肼，FG2可以是醛基或酮基。FG1和FG2可在微酸性条件下(例如pH值4-6.8)反应，使肟键轻松再生。
在一些实施方案中，SP1和SP2是独立的间隔基团，具有不同链长以便系统研究接触位点之间的距离。例如，单个氨基酸可采用不同长度的交联剂衍生化，并经历相同的交联条件、样品处理和表征。通过分析来自不同交联剂的数据可以得到了解接触位点的结构的思路。SP1/SP2可以具有不同的物理性质，以便为特定实验选择最合适的光交联剂。例如，疏水性亚甲基接头适用于探测脂质层中膜蛋白。在另一个实施例中，亲水性乙二醇接头使得光交联剂更具有亲水性并适用于探测水层的蛋白质-蛋白质相互作用。在另一个实施例中，还可以包括一个短链肽骨架。为满足酶消化的要求，可使用D-氨基酸或非天然氨基酸而不是L-氨基酸。通过改变氨基酸可以构建出不同的骨架特性。由于氨基酸本质上与蛋白质本身更有关联性，它们应当不会对两种蛋白质之间的相互作用有太多干扰。在另一个实施方案中，SP 1和SP2可以只是化学键，或是取代的或未取代的(C1-C24)杂烷基、多元醇基、多元胺基、聚酯基或聚磷酸二酯基。
在一些实施方案中，W是一种化学或光交联基团，选自芳酮、叠氮化物、重氮化合物、二氮丙啶、烯酮、烯烃、二羰基、环氧化物、有机硅烷、异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、活性酯，例如但不限于，N-羟基琥珀酰亚胺酯、氟苯基酯、磺酰氯、碳酸酯、酰亚胺酯、酐、卤代乙酰和烷基卤化物衍生物、马来酰亚胺、乙烯砜衍生物、硫酯、二硫化物和巯基。
在一个优选实施方案中，光活性基团是基于苯基二氮丙啶的化合物。基于苯基二氮丙啶的化合物通常在360nm左右发生光解，生成的碳烯可以在数皮秒的时间内高效地插入C-H键。由于三氟甲基的吸电子效应，形成的重氮异构体非常稳定，在正常标记条件下不生成副产物，从而产生非常高效的特异性共价交联作用。在另一个优选实施方案中，光活化基团是氟化芳基叠氮化物。全氟芳基叠氮化物经历涉及单线态氮烯的分子间光反应。和简单的芳基叠氮化物不同，全氟芳基叠氮化物是非常高效的光交联剂，而且没有副反应。
在一些实施方案中，V是一种可以与目标蛋白中的官能团反应形成稳定键的化学交联基团。例如，V可以是硫羟反应性官能团，例如马来酰亚胺、卤代乙酰基或烷基卤化物衍生物。在这种情况下，仍然可使用半胱氨酸致突变作用将交联剂引入特定位点，不过交联产物的后纯化则采用其它化学手段。V还可以是如异硫氰酸酯、异氰酸酯、活性酯之类的胺反应性基团，例如但不限于N-羟基琥珀酰亚胺酯和氟苯基酯；磺酰氯；碳酸酯；酰亚胺酯；和酐。
可逆键还可以是连接目标蛋白和如式(I)和(II)所示的交联剂的键(图1)。在这种情况下，首先必须在目标蛋白中引入一个非天然氨基酸或相当的官能团，例如醛或酮。
交联剂(I)包含(i)一个能够形成可逆键的官能团(FG2)，(ii)一个可以使相互作用蛋白交联的化学或光交联基团(W)，以及(iii)一个连接L和W的间隔基(SP1)。在一个优选实施方案中，FG2是氨氧基、醛、酮、酰肼、氨基脲或氨基硫脲。
在一个特定实施方案中，交联剂可具有式(II)，其中可逆键是肟、腙、氨基脲或氨基硫脲，并直接连接至烃或取代芳环。烃基可与另一个分子方便地交换以便结合可逆键；例如，连接至可逆肟键的甲基。裂解或交换时生成丙酮分子。
在另一个实施方案中，可光活化化合物可具有式(IV)，其中光交联单元通过间隔基(SP’)和二硫键连接，以取代苯或是从该化合物中释放后能够产生发色团的杂环。例如，可释放的基团可以是硝基苯甲酸基团或其类似物。二硫键硝基苯甲酸基团在325nm处有最大吸收。但是，释放的二价阴离子发色团在409.5nm处有最大吸收，且412nm处的消光常数可用于量化蛋白质的标记程度((Jocelyn，P.C.Methods in Enzymology.1987，143，44-67)。在另一个实施例中，可释放基团可以是2-硫羟-吡啶基或其类似物。释放时，2-硫羟吡啶可用于量化蛋白质的标记程度。
B.两种蛋白间的相互作用的共价捕获方法
图2显示了以交联剂III为例捕获两种蛋白间的相互作用的一般方法的实施方案。该方法包括(a)提供(i)待检测的含官能团的第一蛋白(蛋白1)，其中官能团是巯基或醛、或酮、或氨氧基、或酰肼、或胺。官能团可为天然官能团，或通过致突变作用引入，或为改性的tRNA类似物，或经过化学改性；蛋白1处于细胞环境、蛋白质混合物、膜中，或经过纯化；(ii)可逆交联剂(I)，(II)、(III)或(IV)；(b)在允许交联基团结合入蛋白1的条件下，使蛋白1与可逆交联剂结合；(c)提供相互作用蛋白伴侣(蛋白2)，并在蛋白1与蛋白2相互作用的条件下使蛋白2和蛋白1结合；当施加光解或化学条件时使其进入交联基团和蛋白2的反应范围，以形成共价稳定的蛋白复合物；以及(d)在使可逆接头断裂并释放蛋白1和交联的含FG2的蛋白2的裂解条件下，温育交联蛋白复合物。对交联的蛋白2的进一步表征可揭示相互作用的位点。
在某些实施方案中，第一蛋白可以是可溶性蛋白或膜结合蛋白，例如跨膜受体，尤其是GPCR。第二蛋白可以是可溶性蛋白、膜结合蛋白或膜相关蛋白，尤其是G蛋白。
在某些其它实施方案中，第一蛋白可通过非共价相互作用或共价交联与固体载体连接。载体基质包括葡聚糖、琼脂糖、硅胶、合成聚合物或是与抗体、配体或表位标记共价耦合的前述分子之一。
C.分离交联产物的方法
在某些优选实施方案中，可将可逆接头L裂解以便结合固体载体用于纯化目的。该纯化处理可放在交联后立即进行以便使交联蛋白与其它非共价交联蛋白分离。当蛋白质-蛋白质相互作用是在蛋白质混合物、膜或活细胞中发生时该步骤特别有用。交联蛋白的早期分离形成干净的用于酶法或化学法消化的样品。
图3显示了一种通过固体载体分离交联蛋白的方法的实施方案。该方法包括(a)提供(i)带官能团(FG1)的固体载体，其中FG1能够与FG2反应形成可逆键；和(ii)非交联蛋白和交联的含FG2的蛋白2的混合物；(b)在允许FG1和FG2反应形成可逆键的条件下，使非交联蛋白和交联蛋白的混合物与固体载体结合；(c)通过过滤等的物理法将固载交联蛋白2与非交联蛋白分离；(d)在使带FG2的交联蛋白2释放和再生的裂解条件下温育固载蛋白2；(e)通过过滤等的物理法将带FG2的交联蛋白与固体载体分离；(f)以化学法、酶法或两者的组合消化交联蛋白2以获得肽混合物；(g)提供另一种带FG1的固体载体，并在允许FG1和FG2反应形成可逆键的条件下使其与经消化的肽混合；(h)以过滤等的物理法将带FG2的固载交联肽与非交联肽分离；(i)在最少量裂解缓冲液中温育固载交联肽，使带FG2的交联肽再生；以及(j)以过滤等的物理法将交联肽与固体载体分离。
在另一种方法中，可首先以酶法或化学法消化交联蛋白以生成蛋白片段，然后可以在交联后进行纯化处理以便使交联蛋白与其它非共价交联蛋白分离(图3，略过步骤a-f)。当采用纯化蛋白进行蛋白质-蛋白质相互作用时该简化方法非常有用。该方法包括(a)以化学法、酶法或两者的结合消化交联的蛋白2以获得肽混合物；
(b)提供带FG1的固体载体，并在允许FG1和FG2反应形成可逆键的条件下使其与经消化的肽混合；(c)以过滤等的物理法将带FG2的固载交联肽与非交联肽分离；(d)在最少量裂解缓冲液中温育固载交联肽，使带FG2的交联肽再生；以及(e)以过滤等的物理法将交联肽和固体载体分离。
在一些情况下，所选固体载体对消化过程没有干扰。交联的固载蛋白可直接进行消化，且仅可进行单次分离。该方法包括(a)提供(i)带官能团(FG1)的固体载体，其中FG1能够与FG2反应形成可逆键；和(ii)非交联蛋白和交联的带FG2的蛋白2的混合物；(b)在允许FG1和FG2反应形成可逆键的条件下，使非交联蛋白和交联蛋白的混合物与固体载体结合；(c)通过过滤等的物理法使交联的固载蛋白2与非交联蛋白分离；(d)以化学法、酶法或两者的组合消化交联蛋白2以获得肽混合物；(e)提供另一种带FG 1的固体载体，并在允许FG1和FG2反应形成可逆键的条件下使其与经消化的肽混合；(f)以过滤等的物理法将带FG2的交联的固载肽与非交联肽分离；(g)在最少量裂解缓冲液中温育交联的固载肽，使交联的带FG2的肽再生；以及(h)以过滤等的物理法将交联肽与固体载体分离。
混合的交联肽可直接进行检测方法或进行进一步的样品处理。例如，混合的交联肽可直接用于液相色谱(LC)-质谱联用技术。MS/MS裂解研究将揭示蛋白2中可与蛋白1交联的氨基酸的确切位置。在另一个实施例中，单个交联的肽的量可能不够进行直接的LC-MS-MS/MS分析，用以从分子水平检测接触位点。如检测方法部分所详述，可将交联的肽裂解，以便用不同的标记分子进一步衍生化，用于多维检测。
D.纯化交联产物的方法
在另一个实施方案中，可将可逆接头L裂解以便结合可溶性标记分子，用于纯化目的。标记分子的实例是疏水荧光或紫外活性分子。标记分子可在交联后立即引入，以便使交联蛋白和其它非共价交联蛋白分离(图4)。该方法包括(a)提供(i)带官能团(FG1)的标记分子，其中FG1能够与FG2反应形成可逆键，以及(ii)非交联蛋白和交联的带FG2的蛋白2的混合物；(b)在允许FG1和FG2反应形成可逆键的条件下，使非交联蛋白和交联蛋白的混合物与标记分子结合；(c)通过凝胶电泳或色谱等纯化非交联蛋白中经标记的交联蛋白2；(d)以化学法、酶法或两者的组合消化交联蛋白2以获得肽混合物；以及(e)通过凝胶过滤或色谱等纯化非交联肽中经标记的交联肽。
在另一种方法中，可首先以酶法或化学法消化交联蛋白，生成蛋白片段，然后可在交联后使标记分子结合，以便使交联肽与其它非共价交联肽分离(图4)。当蛋白质-蛋白质相互作用涉及纯化蛋白时这种简化方法非常有用。该方法包括(a)以化学法、酶法或两者的组合消化交联蛋白2以获得肽混合物；(b)在允许FG1和FG2反应形成可逆键L的条件下，使含FG1的标记分子与交联的含FG2的肽结合；以及(c)通过凝胶过滤或色谱等纯化非交联肽中经标记的交联肽。
经标记的交联肽可直接用于检测方法或进行进一步的样品处理。例如，混合的交联肽可直接用于LC-质谱分析联用技术。MS/MS裂解研究将揭示蛋白2中可与蛋白1交联的氨基酸的确切位置。在另一个实施例中，单个交联肽的量可能不够进行直接的LC-MS-MS/MS分析，用以从分子水平检测接触位点。如检测方法部分所详述，可将交联的肽裂解，以便用不同的标记分子进一步衍生化，用于多维检测。
E.检测方法
在某些优选实施方案中，可逆键可与含有与交联产物形成可逆键的官能团的各种标记试剂发生反应。该产物可进一步裂解，以逐个引入不同的标记试剂。该标记使分析样品的利用率最大化，并且是一种改进检测灵敏度的好方法。图5显示了这种方案。在该方法中，在允许FG1和FG2之间形成可逆键L的条件下，将交联的含FG2的蛋白质或肽与接触FG1的第一标记分子一起温育。然后，经标记的光交联蛋白质或肽进行基于第一标记分子的第一次检测。交联的蛋白质或肽可通过L的裂解再生FG2进行重复使用，并允许结合第二标记分子。经标记的光交联蛋白质或肽进行基于第二标记分子的第二次检测。交联的蛋白质或肽可通过L的裂解再生FG2进行重复使用，并允许进行多次的检测。
这些标记试剂的实例为荧光标记、质量标记和放射性化合物。此外，标记试剂可以是酶、表位或通过其它扩增机制(例如ELISA)使信号扩增的抗体。
多维检测也可通过采用已经嵌入一个标记分子中的多个检测分子的单次反应实现。交联剂和标记分子间的键可以是可逆或稳定的键。图6显示了含有(i)用于分离和/或纯化的固体载体(S)；(ii)可裂解键Y；(iii)多个标记单元T1，T2，...Tn，其中n是整数并小于6；以及(iv)可与选自醛、酮、氨氧基、肼和酰肼的基团反应的交联基团的固载蛋白质或肽标记分子(V)的一种实施方案。
在一些实施方案中，T1，T2，...Z可通过酰胺键连接。标记试剂可采用带标记单元的氨基酸类似物容易地合成。
在一些实施方案中，固体载体可以是葡聚糖、琼脂糖、硅胶或合成聚合物，例如聚苯乙烯。
在一些实施方案中，标记分子可以是可通过C18柱以HPLC方法简单纯化的疏水单元、荧光单元，或是疏水和荧光分子的组合，例如芘。为改善MS/MS检测的灵敏度，标记单元还可以是电离增强单元。一些研究小组已经报道了提高胰蛋白肽检测的灵敏度的化学方法(Tatsuya，等Anal Sci.2002，18，1301-1307；Hale，等Anal.Biochem.2000，287，110-117；Beardsley，等Anal.Chem.2002，74，1884-1890)。一项研究报道了氨基的三甲基化处理使肽的电离效率增加100倍(Stewart，等Rapid Commun in Mass Spectrom.2002，16，1448-1453)。哌嗪、仲胺、叔胺或季胺等分子可作为标记单元引入。
多维检测通过图6所示的方法实现。该方法包括(a)在允许FG2和Z反应形成L’键的条件下，使固载多功能标记分子与交联的蛋白质或肽结合；(b)以过滤等的物理法将交联的固载蛋白质或肽与非交联蛋白质或肽分离；(c)在裂解Y的条件下温育交联的固载蛋白质或肽；(d)以简单过滤等的物理法将交联蛋白质或肽与固体载体分离；以及(e)检测交联的蛋白质或肽。
以下实施例包含重要的额外信息、例证和指南，其在实施本发明的各种实施方案及其等同物时可进行调整。以下实施例有助于更全面地了解本发明的实施，其列于此处仅为说明目的，不应视为以任何方式进行限制。
具体实施方式
实施例1：含肽间隔基和可逆肟键的可裂解杂双功能光交联剂的合成(图10)
本实施例描述各种长度的含有肽间隔基和可裂解肟接头的光交联剂的合成途径。在固相肽合成过程中，简单采用氨氧基树脂即可实现氨氧基的功能。以95％TFA使交联剂最终裂解，在去除氨氧基保护基的同时还提供了含氨氧基的肽基光交联剂(d)。将马来酰亚胺基引入交联剂(e)中使交联剂与含巯基蛋白反应。氨氧基团还可用丙酮封端，且丙酮可与其它含醛蛋白(f)轻松交换。光交联基团与肟接头的直接结合获得了最短的间隔基。每个氨基酸的加入使其间最多增加3个键(大约4.4
Figure BPA00001609391600321
)。
实施例2：含乙二醇和亚甲基间隔基的光交联剂的合成
图11描述了含有各种长度的乙二醇或亚甲基接头的三氟甲基苯基二氮丙啶的合成途径。以可商购烷基或乙二醇取代的溴化苯为原料，按照Nassal公开的操作步骤可以合成三氟甲基苯基二氮丙啶类似物(Nassal，M.Liebigs Ann Chem.1983，1510-1523)。
实施例3：可裂解肟连接的含乙二醇和亚甲基间隔基的光交联剂的合成
图12显示了将这些三氟甲基苯基二氮丙啶化合物引入肟连接的试剂的合成途径。
实施例4：可裂解二硫化物连接的含乙二醇和亚甲基间隔基的光交联剂的合成
图13显示了二硫化物连接的含乙二醇或亚甲基间隔基的光交联剂的合成途径。
实施例5：另一种可裂解肟连接的含乙二醇和亚甲基间隔基的光交联剂的合成
图14显示了另一种可裂解肟连接的含乙二醇或亚甲基间隔基的光交联剂的合成示意图。N-邻苯二甲酰亚胺基氧基醋酸(i)可根据文献的操作步骤合成(Clave，G.等Org.Biomol.Chem.，2008，6，3065-3078)。其N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯与单Fmoc或Boc基保护的二胺反应，产生化合物j。按照同样的NHS酯活化方法，可将光交联基团轻松引入系统中，得到化合物k。按照文献的操作步骤，以NH2NH2去除邻苯二酰基团得到化合物l(Salo，H.；Virta，P.等Bioconjugate Chem.1999，10，815-823)。化合物l可用丙酮(n)封端，或与任何带醛或酮的杂双功能交联剂反应得到试剂m。以下部分详述了获得一些典型化合物的实验过程。
邻苯二甲酰亚胺基氧基醋酸叔丁酯(g)的合成：向配备磁力搅拌棒和氮气入口的500mL圆底烧瓶中加入15.26g(93.5毫摩尔)N-羟基邻苯二甲酰亚胺、215mL N-甲基吡咯烷酮(NMP)和18.84g(136毫摩尔)无水K2CO3。溶液在油浴中加热至40℃保持10分钟后，通过加料漏斗(additional funnel)缓慢加入溴乙酸叔丁酯(13.81ml，93.5毫摩尔)和NMP(10mL)的混合溶液。反应液在50℃下搅拌3小时后，冷却至室温并在氮气气氛下搅拌24小时。以高效液相色谱(HPLC)检查反应进度。将所得的反应液转移至含2L冷的去离子水的5L烧杯中。固体沉淀并以布氏漏斗过滤收集。固体以冷的去离子水洗涤两次，然后转移至2L烧杯中，再加入1L冷的去离子水。混合物搅拌5分钟。再次过滤收集固体，以冷的去离子水洗涤。重复数次该操作(混合和清洗)直至获得白色固体。将固体冻干得27.46g产物(产率：106％，HPLC纯度：99％)。
N-邻苯二甲酰亚胺基氧基醋酸(h)的合成：向配备磁力搅拌子的250mL圆底烧瓶中加入14.14g(51毫摩尔)邻苯二甲酰亚胺基氧基醋酸叔丁酯和123mL干二氯甲烷。混合物冷却至0℃后，通过加料漏斗逐滴加入37.85mL(510毫摩尔)TFA。搅拌1小时后，HPLC检测显示溶液中仍有1.5％的起始原料。加入3mL(40.4毫摩尔)TFA，再次搅拌混合物20分钟。减压浓缩混合物，残渣以CHCl3共蒸发两次。加入20mL水，将水溶液冻干得8.61g产物(产率76.4％，HPLC纯度：99％)。
N-邻苯二甲酰亚胺基氧基醋酸NHS酯的合成(i)：向50mL离心管中加入1.03g  (4.67毫摩尔)N-邻苯二甲酰亚胺基氧基醋酸、1.06g(5.14毫摩尔)N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、0.591g  (5.14毫摩尔)N-羟基琥珀酰亚胺和23mL NMP。将混合物在涡旋混合器中处理30秒，然后在45℃下摇晃反应(natate)。HPLC检测显示反应在30分钟后完成(图15，左侧，N-邻苯二甲酰亚胺基氧基醋酸：tR＝2.0分钟；NHS酯：tR＝2.3分钟)。粗混合物不经纯化直接用于下一步骤。
4-(1-叠氮-2，2，2-三氟甲基)苯甲酸NHS酯(o)的合成：向1.5mL超离心管中加入20mg(0.0869毫摩尔)4-(1-叠氮-2，2，2-三甲基)苯甲酸、21.6mg  (0.1052毫摩尔)DCC、11mg(0.0956毫摩尔)N-羟基琥珀酰亚胺和435μL二甲基甲酰胺(DMF)。将混合物在涡旋混合器中处理30秒，然后在室温下摇晃反应。HPLC检测显示反应在一小时内完成(图15，右侧；4-(1-叠氮-2，2，2-三甲基)苯甲酸：tR＝3.73分；NHS酯：tR＝3.99分钟)。粗反应混合物不经纯化直接用于下一步骤。
j1的合成：向15mL离心管中加入0.329g(0.986毫摩尔)N-Fmoc-2-(甲氨基)-乙胺盐酸盐、0.488ml(2.8毫摩尔)N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)和4.6mL 0.2M NHS酯(化合物i)的NMP溶液。将混合物在涡旋混合器中处理30秒，然后在室温下摇晃反应。HPLC检测显示反应在一小时内完成(图16j1；tR＝9.78分钟；计算精确质量：499.17Da；测定质量：479.3，500.4)。产物可用反相HPLC柱纯化或添加冷水从NMP中沉淀出。将约1mL的粗混合物进行C 18柱脱盐纯化。将洗脱出的产物冻干至干，不经纯化即用于下一步骤。
j2的合成：向15mL离心管中加入0.216g(1.027毫摩尔)N-叔丁氧基羰基-2-(甲氨基)-乙胺盐酸盐、0.488ml(2.8毫摩尔)DIPEA和4.6mL 0.2M NHS酯(化合物i)的NMP溶液。将混合物在涡旋混合器中处理30秒，然后在室温下摇晃反应。HPLC检测显示反应在一小时内完成(图16j2；tR＝7.29分钟；计算精确质量：377.16Da；测定质量：378.3，400.5)。产物可用反相HPLC柱纯化或添加冷水从NMP中沉淀出。
j3的合成：向15mL离心管中加入0.394g(4.47毫摩尔)1，4-二氨基丁烷、0.325ml(1.868毫摩尔)DIPEA和4.6mL 0.2M NHS酯(化合物i)的NMP溶液。将混合物在涡旋混合器中处理30秒，然后在室温下摇晃反应。HPLC检测显示反应在一小时内完成(图16j3；tR＝4.14分钟；计算精确质量：291.12Da；测定质量：292.4)。产物可用反相HPLC柱容易地纯化。
k1的合成：向1.5mL离心管中加入13.1mg(26.2微摩尔)j1和200μL 2％(v/v)1，8-二氮双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)的DMF溶液。将混合物在涡旋混合器中处理30秒，然后在室温下静置5分钟。向混合物中加入153μL 0.17M NHS酯(化合物o)的DMF溶液。混合物在室温下摇晃反应过夜。HPLC纯化后得产物k1(图17；tR＝9.12分钟；计算精确质量：489.13Da；测定质量：489.8)。
l1的合成：为测试N-邻苯二酰基团的去除条件，将少量纯化后的k1溶解在20μL NH2NH2/吡啶/AcOH溶液(体积比为0.124/4/1)中。以HPLC分析裂解率(5分钟：不到5％的产物形成；2小时：30％的产物形成)。HPLC纯化后得产物l1(图17；tR＝6.96分钟；计算精确质量：359.12Da；测定质量：359.9)。
实施例6：可裂解固体载体上酰胺键连接的多功能蛋白标记试剂的合成
图18显示了可裂解固体载体上的多功能蛋白标记试剂的一个实例。该试剂具有醛官能团，该官能团在存在还原剂的条件下能够与氨氧基/肼/酰肼反应，形成稳定的键。第一标记分子(T1)具有季胺单元。为提高改性肽的电离效率，该标记试剂中引入了叔胺官能团。第二标记分子(T2)是芘单元。芘的疏水性非常强，必要时可作为从树脂中裂解后的纯化处理手段。芘还在384nm下发射荧光并实现了皮摩尔级的肽检测。
实施例7：交联的含氨氧基团的肽片段的分离和/或纯化
氨氧基和醛基之间形成肟键的反应是一个非常高效的选择性反应。该反应已经成功应用于将各种物质连接至蛋白((Kurth等J.Med.Chem.1993，36，1255-1261；Webb等Bioconjug.Chem.1990，1，96-99；Ryser等J.Nucl.Med.1992，33，1766-1773；Mikola等Bioconjug.Chem.1992，3，182-186)，制备生物结合物，例如核酸-脂质(Hecker等ChemMedChem2008，3，1356-1361)、肽-药物(Ingallinella等Bioorg Med.Chem.Lett.2001，11，1343-1346)、肽-寡核苷酸(Villien等Nucleosides，Nucleotides&Nucleic Acids2004，23，1657-1666)和多聚体环状RGD肽-配体(Thumshirn等Chem.Eur.J.2003，9，2717-2725)。肟键与所有标准氨基酸残基相容，而且在体外和体内均是稳定的。尽管没有将肟键用作可逆键的文献先例，有报道表明肟键的稳定性随pH而显著变化(Rose K.等Bioconjugate Chem.1996，7，552-556)。
图19显示了一种分离交联产物的基于固相方法的实例。在弱酸性条件下氨氧化合物与醛和酮反应，形成相对稳定的肟键。增加pH可使肟键水解。加入的过量丙酮可与酮发生交换反应，产生丙酮连接的肽。丙酮连接的肽可用任何含荧光或质量标记的醛进一步衍生化。肟键形成和丙酮交换反应的条件非常温和而且与生理条件相当。为测试可行性，可采用标准的Fmoc-肽合成方案和Fmoc-氨氧基醋酸合成一些带氨氧官能团的肽。以带有各种接头的含醛或含酮化合物改性的葡聚糖树脂或琼脂糖凝胶可用作固体载体/介质。载体/介质的负载容量以具有紫外活性的氨氧基化合物测定。含简单醛基的琼脂糖微球(AminoLink树脂)也可购自Pierce公司。氨氧肽在固体载体或介质上的偶联和裂解效率可用HPLC分析。
以引用方式合并
本文提及的各出版物和专利文件的全部公开内容以引用的方式全部并入，其引用程度如同各篇出版物或专利文件单独提到的引用程度。
等效物
只要不离开本发明的精神或其本质特征，本发明可以用其他具体形式表达。因此上述实施方式从各方面都应视为只是描述性而不是限制发明。本发明的范围因此由附加的权利要求而不是由上述的说明表明，所有在权利要求意义之内及等效范围内的变化都应包含其中。

Claims (34)

1.具有式(I)的交联试剂
FG2—SP1—W(I)
其中
FG2是氨氧基；
SP1是间隔基，选自化学键、取代或未取代的(C1-C24)烷基、取代或未取代的(C1-C24)杂烷基、聚乙二醇基、多元醇基、多元胺基、聚酯基、聚磷酸二酯基、肽和拟肽基；和
W是化学或光交联基团，选自芳酮基、叠氮基、重氮基、二氮丙啶基、烯酮基、烯基、二羰基、环氧基、有机硅烷基、异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、酰叠氮基、活性酯基、磺酰氯基、碳酸酯基、酰亚胺酯基、酐基、卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基、乙烯砜基、硫酯基、二硫化物基团和巯基。
2.如权利要求1所述的交联试剂，其中W是3-芳基-3-(三氟甲基)二氮丙啶基团。
3.如权利要求1所述的交联试剂，其中W是全氟苯基叠氮基团。
4.如权利要求1所述的交联试剂，其中W是卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基或N-羟基琥珀酰亚胺酯基团。
5.如权利要求1所述的交联剂，具有结构式(A)：
Figure FPA00001609391500011
其中R6选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；其中每一个n是独立选自1至16(包括端点)的整数；R8是H或烷基。
6.如权利要求1所述的交联剂，具有结构式(B)：
Figure FPA00001609391500012
其中每一个R5和R6独立选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；其中每一个n是独立选自1至16(包括端点)的整数；R8是H或烷基。
7.如权利要求1所述的交联剂，具有结构式(C)：
Figure FPA00001609391500021
其中每一个R5和R6独立选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；其中每一个n是独立选自1至16(包括端点)的整数。
8.如权利要求1所述的交联剂，具有结构式(D)：
Figure FPA00001609391500022
其中R5选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；其中每一个n是独立选自1至16(包括端点)的整数；R8是H或烷基。
9.如权利要求1所述的交联剂，具有结构式(E)：
Figure FPA00001609391500023
其中每一个R独立地为氨基酸侧基。
10.具有式(II)的交联剂
其中
R1和R2独立地为H、烷基或芳基；
SP1是间隔基，选自化学键、取代或未取代的(C1-C24)烷基、取代或未取代的(C1-C24)杂烷基、聚乙二醇基、多元醇基、多元胺基、聚酯基、聚磷酸二酯基、肽和拟肽基；和
W是化学或光交联基团，选自芳酮基、叠氮基、重氮基、二氮丙啶基、烯酮基、烯基、二羰基、环氧基、有机硅烷基、异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、酰叠氮基、N-羟基琥珀酰亚胺酯基、氟苯基酯基、磺酰氯基、碳酸酯基、酰亚胺酯基、酐基、卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基、乙烯砜基、硫酯基、二硫化物基团和巯基。
11.如权利要求10所述的交联剂，其中W是3-芳基-3-(三氟甲基)二氮丙啶基团。
12.如权利要求10所述的交联剂，其中W是全氟苯基叠氮基团。
13.如权利要求10所述的交联剂，其中W是卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基或N-羟基琥珀酰亚胺酯基团。
14.如权利要求10所述的交联剂，具有结构式(F)：
Figure FPA00001609391500031
其中R6选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；其中每一个n是独立选自1至16(包括端点)的整数；R8是H或烷基。
15.如权利要求10所述的交联剂，具有结构式(G)：
Figure FPA00001609391500032
其中每一个R5和R6独立选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；其中每一个n分别是选自1至16(包括端点)的整数。
16.如权利要求10所述的交联剂，具有结构式(H)：
Figure FPA00001609391500033
其中R5选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；且其中每一个n是独立选自1至16(包括端点)的整数；R8是H或烷基。
17.如权利要求10所述的交联剂，具有结构式(I’)：
Figure FPA00001609391500034
其中每一个R独立地选自氨基酸侧基。
18.具有式(III)的交联剂
V—SP2—L—SP1—W(III)
其中
V是化学交联基团，选自异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、酰叠氮基、酯基、磺酰氯基、碳酸酯基、酰亚胺酯基、酐基、卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基、乙烯砜基、硫酯基；
W是化学或光交联基团，选自芳酮基、叠氮基、重氮基、二氮丙啶基、烯酮基、烯基、二羰基、环氧基、有机硅烷基、异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、酰叠氮基、酯基、磺酰氯基、碳酸酯基、酰亚胺酯基、酐基、卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基、乙烯砜基、硫酯基、二硫化物基团和巯基。
每一个SP1和SP2独立地为间隔基，选自化学键、取代或未取代的(C1-C24)烷基、取代或未取代的(C1-C24)杂烷基、聚乙二醇基、多元醇基、多元胺基、聚酯基、聚磷酸二酯基、肽和拟肽基；和
L是肟键。
19.如权利要求18所述的交联剂，其中W是3-芳基-3-(三氟甲基)二氮丙啶基团。
20.如权利要求18所述的交联剂，其中W是全氟苯基叠氮基团。
21.如权利要求18所述的交联剂，其中V是卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基或N-羟基琥珀酰亚胺酯基团。
22.如权利要求18所述的交联剂，具有结构式(J)：
Figure FPA00001609391500041
其中V是卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基或N-羟基琥珀酰亚胺酯基团；每一个R6和R7独立地选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；且其中每一个n是独立选自1至16(包括端点)的整数；R8是H或烷基。
23.如权利要求22所述的交联剂，具有结构式(J’)：
Figure FPA00001609391500051
其中每一个R6和R7独立选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；且其中每一个n分别是选自1至16(包括端点)的整数；R8是H或烷基。
24.如权利要求18所述的交联剂，具有结构式(K)：
Figure FPA00001609391500052
其中V是卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基或N-羟基琥珀酰亚胺酯基团；每一个R5、R6和R7独立选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；且其中每一个n是独立选自1至16(包括端点)的整数。
25.如权利要求24所述的交联剂，具有结构式(K’)：
Figure FPA00001609391500053
其中每一个R5、R6和R7独立选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；且其中每一个n是独立选自1至16(包括端点)的整数。
26.如权利要求18所述的交联剂，具有结构式(L)：
Figure FPA00001609391500054
其中V是卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基或N-羟基琥珀酰亚胺酯基团；每一个R5和R7独立选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；且其中每一个n是独立选自1至16(包括端点)的整数；R8是H或烷基。
27.如权利要求26所述的交联剂，具有结构式(L’)：
Figure FPA00001609391500061
其中每一个R5和R7独立选自-(CH2)n-和-O(CH2CH2)n-；且其中每一个n是独立选自1至16(包括端点)的整数；R8是H或烷基。
28.如权利要求18所述的交联剂，具有结构式(M)：
其中V是卤代乙酰基、卤代烷基、马来酰亚胺基或N-羟基琥珀酰亚胺酯基团；每一个R独立地为氨基酸侧基。
29.如权利要求28所述的交联剂，具有结构式(M’)：
Figure FPA00001609391500063
其中每一个R独立选自氨基酸侧基。
30.具有式(V)的用于标记蛋白质或肽的试剂：
S——Y——T1——T2------Tn——Z(V)
其中
S是固体载体；
Y是可裂解键；
T1，T2，...Tn是标记分子；
n是选自1、2、3、4、5和6的整数；和
Z是一种能够与醛、酮或氨氧基反应的交联基团。
31.如权利要求30所述的试剂，其中T是质量标记、荧光标记、疏水单元、表位标记、放射性单元、发色团单元、紫外活性单元或化学发光标记。
32.如权利要求30所述的试剂，其中Y和T1，T2，...Z通过酰胺键、C-C键、C-O键或C-N键共价连接。
33.如权利要求30所述的试剂，其中Z是氨氧基团。
34.如权利要求30所述的试剂，具有结构式(N)：
Figure FPA00001609391500071
其中S是固体载体。
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