CN111505175B - 一种质谱用交联剂及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种质谱用交联剂及其制备与应用。
背景技术
质谱交联技术是近些年发展起来的新技术,它是通过化学交联的方法,将蛋白质中距离接近、存在相互作用的位点进行共价连接,然后结合质谱技术进行交联肽段分析,以便全面了解生物体内目标功能体系的蛋白结构与相互作用信息。相较于传统的研究方法,如NMR、X-ray和CryoEM等,对样品的要求和分析流程的难度大大降低,但交联剂的作用至关重要。
目前交联剂的发展非常有限,最常用的是双琥珀酰亚胺类化合物(disuccinimidyl compound),如DSS(disuccinimidyl suberate)、BS3(bis(sulfosuccinimidyl)suberate)、DSSO(Disuccinimidyl Sulfoxide)等。它们均为含有两个与氨基反应的N-羟基琥珀(NHS)酯类官能团,主要与蛋白的赖氨酸(K)残基侧链及每条多肽的N端发生NHS-酯交联,形成酰胺键,同时会释放出N-羟基琥珀类脱离集团。BS3相较于DSS是通过磺酸盐的引入增加水溶性;而DSSO则是通过亚砜基团的引入,实现质谱上的可裂解。该类交联剂虽然反应活性很高,但反应位点有限,主要跟伯胺共价结合,且稳定性较差。
本发明提供一种新型质谱用交联剂。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种质谱用交联剂及其制备与应用,用于解决现有技术中交联剂稳定性差等问题。同时,本发明首次将磷酸基团作为交联剂的富集标签。本发明也提供了一种新的质谱裂解途径。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明第一方面提供一种质谱用交联剂,所述交联剂为
(1)式(I)所述化合物,或者
(2)式(I)的盐或溶剂合物或包含该结构的组合物。
本发明第二方面提供前述质谱用交联剂的制备方法,至少包括以下步骤:
以双(乙烯砜基)丙醇(BVS)为起始物,在磷酸化试剂和碱的作用下,反应得到乙烯砜基磷酸酯交联剂(P-BVS),即所述质谱用交联剂。
本发明第三方面提供所述交联剂在蛋白质交联中的应用。
进一步的,所述应用方式为:将前述交联剂加入至蛋白质样品中,在缓冲液中反应。
本发明第四方面提供一种研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的方法,包括如下步骤:将前述交联剂加入至蛋白质样品中,在缓冲液中反应。
如上所述,本发明的质谱用交联剂及其制备与应用,具有以下有益效果:
本发明提供的交联剂稳定,具有水溶性;本发明提供的交联剂与蛋白交联后,没有任何副产物产生;本发明提供的交联剂具有质谱可断裂性;本发明提供的交联剂含有可富集的官能团;本发明提供的交联剂可以与蛋白质中半胱氨酸、赖氨酸、肽链N-端及组氨酸等交联。
附图说明
图1显示了本发明中涉及的交联剂的1H NMR、13C NMR和质谱图。
图2显示了本发明中涉及的交联剂对蛋白质BSA的交联。
图3显示了本发明中涉及的交联剂与蛋白质交联后,质谱中的断裂方式。
图4显示了本发明中涉及的交联剂与蛋白质交联后,交联肽段的质谱谱图。(α肽段:NECFLSHKDDSPDLPK;β肽段:LCVLHEKTPVSEK。图a/b:交联肽段的的二级质谱谱图;图c/e/g:图a中α肽段的三个离子的三级质谱谱图;图d/f/h:图b中β肽段的三个离子的三级质谱谱图。)
具体实施方式
本发明提供的质谱用交联剂为
(1)式(I)所述化合物,或者
(2)式(I)的盐或溶剂合物或包含该结构的组合物。
本发明提供的前述质谱用交联剂的制备方法,至少包括以下步骤:
以双(乙烯砜基)丙醇(BVS)为起始物,在磷酸化试剂和碱的作用下,反应得到乙烯砜基磷酸酯交联剂(P-BVS),即所述质谱用交联剂。
在一种实施方式中,所述交联剂P-BVS的制备方法的具体步骤包括:将BVS溶于溶剂中,加入碱,冷却后加入磷酸化试剂,进行反应,纯化后得到所述质谱用交联剂P-BVS。
在一种实施方式中,所述溶剂选自二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和四氢呋喃中的一种或多种。
在一种实施方式中,所述磷酸化试剂选自三氯氧磷、磷酸或其他磷酸酯中的一种或多种。
其他磷酸酯是指,除三氯氧磷、磷酸以外的磷酸化试剂。例如,可以为:双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺或二苯基N,N'-二异丙基亚磷酰胺。
所述碱选自有机碱和/或无机碱。
在一种实施方式中,所述有机碱选自吡啶,三乙胺,二异丙基乙基胺,三乙烯二胺,1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU),丁基锂,N-甲基吗啉,甲醇钠,叔丁醇钾中的一种或多种。
在一种实施方式中,所述无机碱选自氢氧化钠或氢氧化钾。
在一种实施方式中,纯化前将调节反应体系为弱酸性。进一步的,采用稀盐酸将反应体系调节为弱酸性。所述弱酸性是指,反应体系的pH值为3-6。
在一种实施方式中,反应温度为0℃-45℃。
在一种实施方式中,所述双(乙烯砜基)丙醇:磷酸化试剂:碱的摩尔比为1:(2-6):(1.5-4.5)。在一种实施方式中,所述双(乙烯砜基)丙醇:磷酸化试剂:碱的摩尔比为1:2:1.5。
在一种实施方式中,反应时间为0.5-3小时。
所述交联剂制备的反应式如下:
本发明提供所述交联剂在蛋白质交联中的应用。
进一步的,所述应用方式为:将前述交联剂加入至蛋白质样品中,在缓冲液中反应。本发明提供的研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的方法,包括如下步骤:将前述交联剂加入至蛋白质样品中,在缓冲液中反应。所述缓冲溶液不与所述交联剂发生反应。
在一种实施方式中,缓冲溶液为磷酸盐缓冲液(PBS)或其它不与交联剂反应的缓冲液。
所述缓冲液的浓度为5mM-50mM。
在一种实施方式中,所述缓冲液的浓度为6.7mM。
所述反应温度为常温或37℃。
在一种实施方式中,反应时间为0.5-24小时。
所述交联剂与蛋白质样品的摩尔比为1:(20-100)。
在一种实施方式中,所述交联剂与蛋白质样品的摩尔比为1:30。
在一种实施方式中,所述蛋白质交联后进行处理,至少包括以下步骤:
1)向交联后的蛋白质样品中加入还原剂进行还原;
2)加入烷基化试剂,将自由的巯基反应的活性封闭;
3)对所述蛋白质样品进行酶解,得到被交联剂修饰的多肽。
在一种实施方式中,步骤1)中,进行还原前先除去尚未反应的交联剂小分子。
除去方法选自沉淀,膜过滤法或者分子筛过滤法。
所述沉淀可采用丙酮进行沉淀。
所述还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)。
在一种实施方式中,步骤2)中,所述烷基化试剂选自吲哚乙酸(IAA)。
在一种实施方式中,步骤3)中,采用胰蛋白酶进行酶解。酶解时间小于4小时。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围;在本发明说明书和权利要求书中,除非文中另外明确指出,单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规技术。
实施例1 P-BVS交联剂的制备
双(乙烯砜基)丙醇(BVS,100mg,0.42mmol)溶于干燥的二氯甲烷中(5mL),置于冰浴下,加入三氯氧磷78μL,0.84mmol)和吡啶(51μL,0.63mmol)。逐渐恢复至室温,共反应2小时后,缓慢加水淬灭反应,稀盐酸调至弱酸性。水相用RP-HPLC纯化,即可得到为白色固体的目标产物。1H NMR(500MHz,D2O)δ6.85(dd,J=16.5,10.0Hz,2H),6.33(d,J=16.5Hz,2H),6.30(d,J=10.0Hz,2H),4.93-4.87(m,1H)),3.75(d,J=6.0Hz,4H)ppm.13C NMR(126MHz,MeOD)δ135.37,132.38,65.29,56.99ppm.ESI-HRMS calcd for C25H34N7O7S3[(M+H)+]:320.9868,found:320.9815.交联剂的1H NMR、13C NMR和质谱图如图1所示。
实施例2 P-BVS交联剂对蛋白BSA的交联
BSA溶于PBS缓冲液(4mg/mL,500μL,pH 8.5)中,分批加入实施例1中制备的P-BVS(10mM,90μL,30equiv)。所得混合物在37℃下反应15小时。交联示意图如图2所示。
实施例3蛋白样品处理
3.1:交联后蛋白首先采用丙酮沉淀,膜过滤法或者分子筛过滤等方法除去尚未反应的交联剂小分子。
3.2:将蛋白质样品重新溶解在200mM Tris-HCl内(样品浓度控制在大约1ug/ul),并加入DTT还原剂来还原蛋白,断开二硫键。
3.3:加入烷基化试剂比如IAA等,将自由的巯基反应的活性封闭。
3.4:加入胰蛋白酶,酶解蛋白,反应时间小于4个小时。
3.5:反应完成后,立刻酸化样品,并且采用二氧化钛微球(5um)富集被交联剂修饰的多肽,最后采用100mM Tris-HCl 0.5%NH4OH将多肽从二氧化钛微球上洗脱下来。
3.6:采用C18固相萃取法,除去多肽中的小分子亲水性杂质,并采用真空干燥法干燥样品。
实施例4蛋白样品质谱数据分析
4.1:将样品重新溶解在2%甲酸中,然后利用液相色谱质谱联用法分析。
4.2:采用三级质谱策略来分析交联多肽,即首先采用MS1质谱全扫描,然后三价电荷及以上的10个强度最高的离子采用低能CID碎裂并利用高分辨轨道离子阱检测。检测分子量相差319.9789和222.0015的配对离子,所有的配对离子都采用三级质谱法测定。
4.3:数据库搜索鉴定所有三级质谱测定离子的肽段序列。
4.4:鉴定出所有交联肽段的两条肽段序列。
所述交联剂与蛋白质交联后,质谱中的断裂方式如图3所示。得到的交联质谱肽段如图4所示。在二级低能质谱时,交联肽段碎裂为两组离子(见图4a,b),分别为α/αLinker-phos/αLinker和β/βLinker-phos/βLinke离子。αLinker/αLinker-phos/α的三级碎片离子质谱图见图4c,e,g;βLinker/βLinker-phos/β的三级碎片离子质谱图见图4d,f,h。随后的数据库搜索鉴定出α肽段为NECFLSHKDDSPDLPK;β肽段为LCVLHEKTPVSEK。因此该交联肽段为LCVLHEKTPVSEK-LCVLHEKTPVSEK。
以上结果显示,本发明提供的交联剂可与蛋白交联。本发明提供的交联剂具有质谱可断裂性。
表1.图4中α/β各个离子的归属
结果显示,本发明提供的交联剂可与蛋白交联。本发明提供的交联剂具有质谱可断裂性。
以上所述,仅为本发明的较佳实施例,并非对本发明任何形式上和实质上的限制,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还将可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化,均为本发明的等效实施例;同时,凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变,均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (10)
2.一种质谱用交联剂的制备方法,用于制备权利要求1所述的质谱用交联剂,其特征在于,所述方法至少包括以下步骤:
以双(乙烯砜基)丙醇为起始物,在磷酸化试剂和碱的作用下,反应得到所述质谱用交联剂。
3.如权利要求2所述的质谱用交联剂的制备方法,其特征在于,所述方法至少包括以下步骤:
将双(乙烯砜基)丙醇溶于溶剂中,加入碱,冷却后加入磷酸化试剂,进行反应,纯化后得到所述质谱用交联剂。
4.如权利要求2或3所述的质谱用交联剂的制备方法,其特征在于,还包括以下特征中的一项或多项:
1)所述磷酸化试剂选自三氯氧磷、磷酸或其他磷酸酯中的一种或多种;
2)所述碱选自有机碱和/或无机碱;
3)反应温度为0℃-45℃;
4)所述双(乙烯砜基)丙醇:磷酸化试剂:碱的摩尔比为1:(2-6):(1.5-4.5)。
5.如权利要求4所述的质谱用交联剂的制备方法,其特征在于,特征2)中,所述有机碱选自吡啶,三乙胺,二异丙基乙基胺,三乙烯二胺,1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯,丁基锂,N-甲基吗啉,甲醇钠和叔丁醇钾中的一种或多种,和/或,所述无机碱选自氢氧化钠或氢氧化钾。
6.如权利要求1所述的质谱用交联剂在蛋白质交联中的用途。
7.一种研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
将权利要求1所述的质谱用交联剂加入至蛋白质样品中,在缓冲液中反应。
8.如权利要求7所述的研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的方法,其特征在于,还包括以下特征中的一项或多项:
1)所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液或其它不与交联剂反应的缓冲液;
2)所述交联剂与蛋白质样品的摩尔比为1:(20-100)。
9.如权利要求7所述的研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的方法,其特征在于,蛋白质交联后进行处理,至少包括以下步骤:
1)向交联后的蛋白质样品中加入还原剂进行还原;
2)加入烷基化试剂,将自由的巯基反应的活性封闭;
3)对所述蛋白质样品进行酶解,得到被交联剂修饰的多肽。
10.如权利要求9所述的研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的方法,其特征在于,还包括以下特征中的一项或多项:
1)步骤1)中,进行还原前先除去尚未反应的交联剂小分子;
2)步骤1)中,所述还原剂选自二硫苏糖醇;
3)步骤2)中,所述烷基化试剂选自吲哚乙酸;
4)步骤3)中,采用胰蛋白酶进行酶解。
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