CN111689882B - 一种双断裂交联剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种双断裂交联剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种双断裂交联剂及其制备方法与应用，属于蛋白质及其功能研究技术领域。本发明提供了一种化学可断裂且质谱可断裂的双断裂交联剂及其制备方法及其在质谱交联技术中的应用。

Description

一种双断裂交联剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种双断裂交联剂及其制备方法与应用，属于蛋白质及其功能研究技术领域。
背景技术
质谱交联技术是近些年发展起来的新技术，它是通过化学交联的方法，将蛋白质中距离接近、存在相互作用的位点进行共价连接，然后结合质谱技术进行交联肽段分析，以便全面了解生物体内目标功能体系的蛋白结构与相互作用信息。相较于传统的研究方法，如NMR、X-ray和CryoEM等，对样品的要求和分析流程的难度大大降低。但是在该技术中，交联剂至关重要。化学可断裂交联剂，如di(N-succinimidyl)3,3'-dithiodipropionate(DSP),3,3'-dithiobis(sulfosuccinimidylpropionate(DTSSP)含有硫-硫键，在还原剂的条件下可以断裂。还原后只有交联的肽段色谱数据会变化，从而可以在大量的背景肽段中区分交联后的肽段。但因为蛋白中同样含有硫-硫键，链接子中硫-硫键的存在，将会大大影响蛋白的酶切，同时也会导致硫-硫键的错连。质谱可断裂交联剂是目前质谱交联技术中常用的一类交联剂，这类交联剂的特点为在质谱条件下，交联肽段断裂为两部分，根据碎裂特征峰解析肽段，而大大提高数据处理的效率。同时具备化学可裂解及质谱可断裂的交联剂将会进一步极大的提高数据处理效率。
发明内容
本发明的目的是为解决交联剂可实现化学可裂解性的同时具有质谱可裂解性，同时可以克服以硫-硫键作为可裂解基团的缺点的技术问题。
为达到解决上述问题的目的，本发明所采取的技术方案是提供一种双断裂交联剂,Azo-BVSA，其化学结构如式I所示；
Figure BDA0002555254270000011
或者式I的溶剂合物或者包含式I结构的组合物或者包含式I结构的盐。
本发明还提供一种双断裂交联剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：以对二氨基偶氮苯为起始物，将对二氨基偶氮苯溶于溶剂中；
步骤2：在溶剂中加入碱；
步骤3：冷却后再加入2-氯乙烷磺酰氯进行化学反应；
步骤4：反应后溶液纯化获得式I所示交联剂。
优选地，所述步骤1中的溶剂设为二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和四氢呋喃中的一种或多种的混合物。
优选地，所述步骤2中的碱设为有机碱。
优选地，所述有机碱设为吡啶、三乙胺、二异丙基乙基胺、三乙烯二胺、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)、丁基锂、N-甲基吗啉、甲醇钠或叔丁醇钾中的一种或多种的混合物。
优选地，所述步骤3中的反应温度为-20℃-45℃。
优选地，所述步骤3中对二氨基偶氮苯:2-氯乙烷磺酰氯:碱的摩尔比为1:2-6:2-9。
优选地，所述步骤3中的反应时间设为10分钟-180分钟。
本发明所述的一种双断裂交联剂在蛋白质分析中的应用，优选在蛋白质交联中的应用。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明的目的在于提供一种化学可断裂且质谱可断裂的双断裂交联剂及其制备与在质谱交联技术中的应用。本发明提供的交联剂以偶氮基作为化学裂解基团，以逆-迈克尔加成作为质谱可裂解的关键部分。交联剂可用于蛋白质的交联并且可以极大的提高数据处理效率。
本发明提供的交联剂稳定性好；交联剂与蛋白交联后，没有任何副产物产生；交联剂具有化学可断裂特征；交联剂具有在collision-induced dissociation(CID)模式下保持稳定，但能够在high energy collision-induced dissociation(HCD)模式下具有质谱可断裂性的特征；
本发明提供的交联剂具有化学可断裂且质谱可断裂的特征；交联剂可用于蛋白质或蛋白质复合物的交联并且可以极大的提高数据处理效率。
附图说明
图1为本发明交联剂的1H NMR、13C NMR和质谱图。
图2为本发明交联剂对蛋白质BSA的交联。
图3显示了本发明交联剂与蛋白质交联后，交联肽段化学可断裂。
图4显示了本发明交联剂与蛋白质交联后，交联肽段质谱图：AZO-BVSA交联多肽(GACLLPKIETMR-CCTKPESER)。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下：
本发明提供一种双断裂交联剂，Azo-BVSA，其化学结构如式I所示；
Figure BDA0002555254270000031
或者式I的溶剂合物或者包含式I结构的组合物或者包含式I结构的盐。
本发明提供一种双断裂交联剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：以对二氨基偶氮苯为起始物，将对二氨基偶氮苯溶于溶剂中；
步骤2：在溶剂中加入碱；
步骤3：冷却后再加入2-氯乙烷磺酰氯进行化学反应；
步骤4：反应后溶液纯化获得式I所示交联剂。
步骤1中的溶剂设为二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和四氢呋喃中的一种或多种的混合物。
步骤2中的碱设为有机碱。有机碱设为吡啶、三乙胺、二异丙基乙基胺、三乙烯二胺、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)、丁基锂、N-甲基吗啉、甲醇钠或叔丁醇钾中的一种或多种的混合物。
步骤3中的反应温度为-20℃-45℃；步骤3中对二氨基偶氮苯:2-氯乙烷磺酰氯:碱的摩尔比为1:2-6:2-9；步骤3中的反应时间设为10分钟-180分钟。
本发明的一种双断裂交联剂在蛋白质分析中的应用，优选在蛋白质交联中的应用。
应用方式为：将交联剂加入至蛋白质样品中，在缓冲液中反应。本发明提供的研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的方法，包括如下步骤：将交联剂加入至蛋白质样品中，在缓冲液中反应；缓冲溶液不与交联剂发生反应。缓冲溶液为磷酸盐缓冲液(PBS)或其它不与交联剂反应的缓冲液。缓冲液的浓度为5mM-50mM；可选择缓冲液的浓度为6.7mM；反应温度为常温或37℃。反应时间为0.5-24小时。交联剂与蛋白质样品的摩尔比为1：(10-100)；也可设置交联剂与蛋白质样品的摩尔比为1：30。
蛋白质交联后进行处理，至少包括以下步骤：
1)向交联后的蛋白质样品中加入还原剂进行还原；
2)加入烷基化试剂，将自由的巯基反应的活性封闭；
3)对所述蛋白质样品进行酶解，得到被交联剂修饰的多肽。
在步骤1中，进行还原前先除去尚未反应的交联剂小分子。除去方法选自沉淀,膜过滤法或者分子筛过滤法。沉淀可采用丙酮进行沉淀。还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)。
在步骤2中，烷基化试剂选自吲哚乙酸(IAA)。
在步骤3中，采用胰蛋白酶进行酶解。酶解时间小于4小时。
实施例1交联剂Azo-BVSA的制备：
Figure BDA0002555254270000041
对二氨基偶氮苯(1mmol,212mg)和三乙胺(3mmol,303mg)的二氯甲烷溶液，0℃下缓慢加入2-氯乙烷磺酰氯(2.2mmol,163mg)。反应一小时后，加水淬灭反应，二氯甲烷萃取。有机相浓缩后，反相柱层析得到目标化合物Azo-BVSA为黄色固体。
表征信息如下：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.82(d,J＝8.4Hz,4H),7.33(d,J＝8.4Hz,4H),6.87(dd,J＝16.3,9.9Hz,2H),6.23(d,J＝16.4Hz,2H),6.11(d,J＝9.9Hz,2H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ148.33,141.07,136.54,128.83,124.22,119.51.ESI-HRMScalcd for C16H16N4O4S2[(M+H)+]:393.0691,found:393.0682.
实施例2Azo-BVSA交联剂对蛋白BSA的交联：
将蛋白质BSA溶于PBS(pH＝7.4)缓冲溶液配成10mg/mL的溶液。将化合物Azo-BVSA溶于DMSO配成20mM的溶液。在一个1.5mL离心管中加入100μL的BSA溶液，然后加入24μL的小分子化合物Azo-BVSA(30equiv)和876μL的PBS(pH＝7.4)缓冲溶液，在37℃振荡反应12小时。通过AmiconCentrifugal 4ml 10K NMWL除去过量的小分子化合物。
实施例3蛋白样品处理：
步骤1：交联后蛋白首先采用丙酮沉淀,膜过滤法或者分子筛过滤等方法除去尚未反应的交联剂小分子。
步骤2：将蛋白质样品重新溶解在200mM Tris-HCl内(样品浓度控制在大约1ug/ul)，并加入DTT还原剂来还原蛋白，断开二硫键。
步骤3：加入烷基化试剂比如IAA等，将自由的巯基反应的活性封闭。
步骤4：加入胰蛋白酶，酶解蛋白，反应时间小于4个小时。
步骤5：反应完成后，采用阳离子交换柱分为多个馏分。每一个馏分取出一部分，并加入Na2S2O4,采用化学裂解法将交联多肽断裂成两个肽段。
步骤6:每一个馏分的两个部分样品都采用C18固相萃取法，除去多肽中的小分子亲水性杂质，并采用真空干燥法干燥样品。最后将样品重新溶解在2％甲酸中，然后利用液相色谱质谱联用法分析。
实施例4质谱数据分析：
采用二级质谱策略来分析交联多肽。数据库搜索鉴定所有二级质谱测定离子的肽段序列。谱图分析显示，在高能下，交联剂是可以碎裂的，以逆-迈克尔的方式断裂成两条碎片离子，大部分碎裂离子都不含有交联剂本身。但是在低能状态下，交联剂不发生碎裂，可以看到一系列连着交联剂的碎片离子。二者可以相互验证，增加鉴定的可信度。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种双断裂交联剂，Azo-BVSA，及包含Azo-BVSA的组合物或者包含Azo-BVSA的盐，其特征在于，Azo-BVSA化学结构如式(I)所示；
Figure FDA0003626361940000011
2.根据权利要求1所述的一种双断裂交联剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：以对二氨基偶氮苯为起始物，将对二氨基偶氮苯溶于溶剂中；
步骤2：在溶剂中加入碱；
步骤3：冷却后再加入2-氯乙烷磺酰氯进行化学反应；
步骤4：反应后溶液纯化获得式(I)所示交联剂。
3.根据权利要求2所述的一种双断裂交联剂的制备方法，其特征在于：所述步骤1中的溶剂设为二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和四氢呋喃中的一种或多种的混合物。
4.根据权利要求2所述的一种双断裂交联剂的制备方法，其特征在于：所述步骤2中的碱设为有机碱。
5.根据权利要求4所述的一种双断裂交联剂的制备方法，其特征在于：所述有机碱设为吡啶、三乙胺、二异丙基乙基胺、三乙烯二胺、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)、丁基锂、N-甲基吗啉、甲醇钠或叔丁醇钾中的一种或多种的混合物。
6.根据权利要求2所述的一种双断裂交联剂的制备方法，其特征在于：所述步骤3中的反应温度为-20℃-45℃。
7.根据权利要求2所述的一种双断裂交联剂的制备方法，其特征在于：所述步骤3中对二氨基偶氮苯:2-氯乙烷磺酰氯:碱的摩尔比为1:(2-6):(2-9)。
8.根据权利要求2所述的一种双断裂交联剂的制备方法，其特征在于：所述步骤3中的反应时间设为10分钟-180分钟。
9.根据权利要求1中所述的一种双断裂交联剂在蛋白质分析中的应用。
10.根据权利要求1中所述的一种双断裂交联剂在蛋白质交联中的应用。
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