JP4965963B2 - 蛍光性化合物及びタンパク質のトポロジー解析方法 - Google Patents

Description

本発明は、二官能性の蛍光性化合物及び該化合物を用いるタンパク質のトポロジー解析方法に関する。

生命現象の解明や有効な医薬品の開発等において、生体内におけるタンパク質の機能の解明は重要な課題である。タンパク質は生体内において種々の役割を担っており、タンパク質分子同士が相互作用することで種々の生理活性を発現することは良く知られているが、例えば、複数のタンパク質分子間の相互作用に関する情報、あるいは複数のタンパク質分子により構成されたタンパク質複合体の構造、物性、ふるまい等に関する情報を入手することが、非常に重要な課題となっている。特に、タンパク質複合体同士はどのように相互作用するのか、あるいは構成ユニットであるタンパク質がどのようにしてタンパク質複合体を形成するのかなど、タンパク質複合体を物理的・化学的に解析することで重要な情報が得られる。

このような解析の一つとして、タンパク質複合体のトポロジー解析が挙げられる。これは、タンパク質分子間又はタンパク質複合体内で、架橋剤を用いて架橋反応を行い、得られた架橋産物を解析するものである（例えば、非特許文献１参照）。解析にあたっては架橋産物を分離して検出することが必要となる。検出するに際して、通常、カラムクロマトグラフや電気泳動等による架橋産物の分離が必要となるが、従来は、カラムクロマトグラフによる分離であれば、例えば、タンパク質の一般的な吸収波長である２８０nm付近における吸光度測定による検出、電気泳動による分離であれば、例えば、銀染色や蛍光染色による高感度染色法が知られている。
Ｐｌａｎｔ ＆ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，３３（３），２９１−２９７（１９９２）

しかし、前記吸光度測定による検出は、検出感度が高くないため、比較的多量の試料を必要とするという問題点があった。また、前記高感度染色法による染色は、微量の試料でも検出できるが、染色操作が煩雑なために検出に数時間かかるという問題点があった。
本発明は上記事情に鑑みて為されたものであり、微量のタンパク質架橋産物でも簡便且つ高精度に検出できる架橋剤として好適な蛍光性化合物、および該化合物を用いるタンパク質のトポロジー解析方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、鋭意検討の結果、タンパク質中のアミノ酸側鎖と反応可能な官能基を両端部に有するポリメチレン鎖の途中に、側鎖を介して蛍光性化合物を結合させた二官能性化合物を用いることで、タンパク質を架橋することができ、該化合物の蛍光シグナルにより架橋産物が微量でも検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、係る課題を解決するため、請求項１に係る発明は、下記式（ＩＩ）で表されることを特徴とする蛍光性化合物である。

（式中、ｌ＝２且つｍ＝０、又はｌ＝０且つｍ＝２、の何れかである。）

請求項２に係る発明は、タンパク質分子間又はタンパク質複合体内における架橋剤用であることを特徴とする請求項１に記載の蛍光性化合物である。

請求項３に係る発明は、請求項２に記載の蛍光性化合物を用いて、タンパク質分子間又はタンパク質複合体内で架橋反応を行い、得られた架橋産物の蛍光シグナルを検出することを特徴とするタンパク質のトポロジー解析方法である。

本発明によれば、微量のタンパク質架橋産物でも簡便且つ高精度に検出でき、タンパク質のトポロジー解析を簡便且つ高精度に行うことができる。

以下、本発明について詳しく説明する。
本発明の蛍光性化合物（以下、単に「化合物」と略記することがある）は、下記一般式（Ｉ）で表されることを特徴とする。

（式中、Ｙは活性エステル化されたカルボキシル基であり、２個のＹは互いに同一でも異なっていても良い。Ｚはアミド結合である。Ｗは、ニトロ基、スルホン酸基及びアミノスルホニル基のいずれかである。ｌ、ｍ、ｎ及びｏは０以上の整数である。）

本発明の化合物は、前記Ｙがタンパク質と架橋反応し、２個のＹを繋ぐ主鎖骨格の途中に側鎖を介して、蛍光性部位であるベンゾフラザン環が連結された、二官能性の蛍光性物質である。すなわち、本発明の化合物を介して、タンパク質分子間が連結された架橋産物又はタンパク質複合体を構成するタンパク質分子が該複合体内において連結された架橋産物は、蛍光性部位を有するので、その蛍光シグナルを検出することで、検出できる。そして、蛍光シグナルの検出を行うので、微量の架橋産物も高精度に検出することが可能である。

なお、本発明において、タンパク質分子間の架橋反応とは、タンパク質の１分子同士の架橋反応、タンパク質複合体同士の架橋反応、タンパク質の１分子とタンパク質複合体の架橋反応等を指すものとする

前記ｌ、ｍ、ｎ及びｏは０以上の整数である。これらのうち、ｌ及びｍは、例えば、本発明の化合物を架橋剤として用いる場合には、架橋対象のタンパク質の種類に応じて適宜選択して用いることができ、特に限定されない。すなわち、２個のＹの間の距離が、架橋されるタンパク質の架橋部位間の距離に相当するように、ｌ及びｍを選択すると良いが、本発明においては、ｌ＋ｍが９以下であることが好ましい。これは、ｌ及びｍで規定されるメチレン基の数が多いほど、前記一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物の水溶性が低下するのに対し、例えば、本発明の化合物を架橋剤として用いる場合は、本発明の化合物および架橋産物を水溶液中で取り扱うことが多いからである。

また、ｎも特に限定されるものではないが、ｎで規定されるメチレン基の数が多いほど、前記一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物の水溶性が低下する。このような観点から、ｎは、通常０〜３であることが好ましい。

このように、ｌ、ｍ及びｎは、本発明の化合物の水溶性に関与するので、ｌ＋ｍ＋ｎは、３〜１２であることが好ましく、４〜９であることがより好ましい。

そして、ｏも特に限定されるものではないが、本発明の化合物中の蛍光性部位であるベンゾフラザン環の量子収率は、ｏが大きいほど高くなる。その一方で、上記と同様に、ｏで規定されるメチレン基の数が多いほど、本発明の化合物の水溶性が低下する。このような観点から、ｏは、通常１〜３であることが好ましい。

前記Ｙは、活性エステル化されたカルボキシル基であり、２個のＹは互いに同一でも異なっていても良い。本発明の化合物を架橋剤として用いた場合、Ｙは、この中に含まれるカルボニル基が、架橋対象のタンパク質中の反応部位、具体的には求核性部位と反応して、架橋産物を生じる。ここで活性エステル化されたカルボキシル基とは、従来公知のいずれのものでも良く、具体的には、シアネート化合物、イソチオシアネート化合物、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシマレイミド及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾールのいずれかと、カルボキシル基とを反応させて得られるものが例示できる。

前記Ｚは、アミド結合である。アミド結合の向きはいずれでも良く、従って、本発明の化合物は、下記一般式（Ｉ−ａ）又は（Ｉ−ｂ）で表すことができる。

（式中、Ｙは活性エステル化されたカルボキシル基であり、２個のＹは互いに同一でも異なっていても良い。Ｗは、ニトロ基、スルホン酸基及びアミノスルホニル基のいずれかである。ｌ、ｍ、ｎ及びｏは０以上の整数である。）

前記Ｗは、ニトロ基、スルホン酸基及びアミノスルホニル基のいずれかである。Ｗは、本発明の化合物に水溶性を付与する部位であり、本発明の化合物は水溶液中で取り扱うことが多いので、Ｗによりタンパク質との架橋反応が円滑に進行する。

ここまで述べたような特徴を有する本発明の化合物の中でも、特に好ましいものとして下記式（ＩＩ）で表される化合物が例示できる。

本発明の化合物の製造方法は特に限定されない。例えば、前記一般式（Ｉ）において、前記Ｚが連結部位となるように、蛍光性部位を含むパーツと、前記Ｙを両端に有する主鎖骨格のパーツとを、アミド結合の形成によって連結する方法が例示できる。アミド結合の 形成は、従来公知の方法を適用すれば良く、特に限定されない。
例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイロプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）等のカルボジイミド系の脱水縮合剤を用いる方法が挙げられる。
また、これ以外にも、カルボキシル基を活性化して、アミノ基と反応させる方法でも良い。このような方法として、例えば、活性エステル法、酸無水物法、酸ハライド法等が挙げられる。

活性エステル法では、カルボキシル基を、例えば、シアネート化合物、イソチオシアネート化合物、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシマレイミド及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール等のいずれかと反応させて、活性エステルとする方法が挙げられる。
酸無水物法では、カルボキシル基を、例えば、酢酸、メタンスルホン酸及びｐ−トルエンスルホン酸等のいずれかと反応させて、酸無水物とする方法が挙げられる。
酸ハライド法では、カルボキシル基を、例えば、カルボニルクロライドとして、活性化する方法が挙げられる。
これらカルボキシル基の活性化には、従来公知の方法を適用すれば良い。

ここに例示したアミド結合形成反応の中でも、中性条件下において簡便に高収率で目的物が得られることから、脱水縮合剤を用いる方法が好ましい。

本発明の化合物は二官能性なので、該化合物を用いてタンパク質同士を架橋させて架橋産物を得ることができる。具体的には、タンパク質の１分子同士、タンパク質複合体同士、タンパク質の１分子とタンパク質複合体を架橋することができる。また、タンパク質１分子内、タンパク質複合体内の構成タンパク質間で架橋反応を行うこともできる。
したがって、本発明の化合物を用いて、タンパク質分子間又はタンパク質複合体内で架橋反応を行い、得られた架橋産物の蛍光シグナルを検出することで、タンパク質のトポロジー解析方法を行うことができる。

架橋産物の検出は、蛍光シグナルの検出により行うことができる。本発明の化合物は、ベンゾフラザン部位が蛍光性であり、架橋産物はたとえ微量でも高感度に検出することが可能である。
架橋産物の検出方法は、蛍光シグナルを検出する方法であれば、如何なる方法でも良い。そして蛍光シグナルの検出方法も、従来公知の方法を適用すれば良く、特に限定されない。
また、タンパク質複合体を架橋する場合には、架橋産物は、該タンパク質複合体を各構成タンパク質に分離する操作を行ってから、検出に供することが好ましい。

例えば、本発明の化合物を用いて、タンパク質複合体を構成する特定のタンパク質間で架橋反応を行った後、構成タンパク質を検出することにより、該タンパク質複合体の構造に関する情報が得られる。例えば、如何なる構成タンパク質が如何なる他の構成タンパク質と相互作用して、タンパク質複合体を形成しているのか等、タンパク質複合体内における構成タンパク質の位置関係に関する情報が得られる。

この場合、架橋産物の検出は、例えば、電気泳動を行って、タンパク質複合体を各構成タンパク質に分離する操作を行ってから行うことが好適である。電気泳動は、架橋産物と、比較対象として、架橋反応に供したものと同じ種類でかつ架橋反応を行っていないタンパク質複合体を用いて同時に行うと良い。これにより、架橋された構成タンパク質を特定することができる。そして、本発明の化合物における２個のＹの間の距離から、架橋された構成タンパク質の架橋部位間の距離を推定することができ、これら構成タンパク質の、タンパク質複合体内における位置関係を推定することが可能である。

電気泳動は、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、キャピラリー電気泳動等、いずれでも良い。
なお、ここでは、タンパク質複合体を各構成タンパク質に分離する方法として電気泳動を挙げたが、電気泳動以外の方法で分離しても良い。

以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。

（合成例）
以下に示す手順により、本発明の化合物を合成した。
７−クロロ−４−ニトロベンゾキサ−１，３−ジアゾール（２０ｇ、０．１ｍｏｌ）をエチルアルコール１００ｍｌに溶解し、グリシン（７．５ｇ、０．１ｍｏｌ）を含むリン酸−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）に滴下して、６０℃で１時間反応させ、塩酸を加えて反応液を酸性に調整し、得られた酸性溶液を減圧濃縮した。次いで、エチルアルコール１００mlを加え、よく撹拌し、不純物を除去した後、水を加えて結晶化し、Ｎ−ＮＢＤ−グリシンを２０．２ｇ得た（収率８５％）。

ジメチル−Ｄ，Ｌ−グルタメート塩酸（１０．６ｇ，０．０５ｍｏｌ）をジオキサン２００ｍｌに溶解し、トリエチルアミン（５．１ｇ，０．０５ｍｏｌ）を加えた後、上記Ｎ−ＮＢＤ−グリシン（１１．９ｇ，０．０５ｍｏｌ）のジオキサン溶液１００ｍｌと、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１０．３ｇ，０．０５ｍｏｌ）を加えた反応混合物を４℃で２４時間放置した。
放置後、沈殿物をろ過して除去しジオキサンで洗浄した。そして、ろ液と洗液を一緒にした後、減圧濃縮して油状残渣を得、エチルアルコールを用いて再結晶を行い、ジメチル−Ｄ，Ｌ−グルタメートのＮＢＤ誘導体結晶を１３．８ｇ得た（収率７０％）。

上記で得られたジメチル−Ｄ，Ｌ−グルタメートのＮＢＤ誘導体結晶（3.95ｇ，０．０１ｍｏｌ）のメチルアルコール溶液３０ｍｌに、水酸化ナトリウム０．０２２ｍｏｌを含む水溶液３０ｍｌを加えて室温で２時間撹拌後、メチルコールを減圧除去して、塩酸を加えて溶液を酸性に調整し、クロロホルムを用いて抽出を行った。得られた抽出物を減圧濃縮し、エチルアルコールを用いて再結晶を行い、Ｄ，Ｌ−グルタメートのＮＢＤ誘導体結晶を３ｇ（収率９０％）得た。

上記で得られたＤ，Ｌ−グルタメートのＮＢＤ誘導体（１．７ｇ，０．００５ｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１．０ｇ，０．０１ｍｏｌ）をジオキサン５０ｍｌに溶解し、１０℃まで冷却した後、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２．１ｇ，０．０１ｍｏｌ）を加えた反応混合物を４℃で２４時間放置した。
放置後、沈殿物をろ過して除去しジオキサンで洗浄した。そして、ろ液と洗液を一緒にした後、減圧濃縮して油状残渣を得た。この油状残渣はすぐ結晶化したので、エーテルを加えてろ別し、ジクロロメタン／石油エーテル混合溶媒を用いて再結晶を行い、本発明の架橋剤である、前記式（ＩＩ）で表されるＤ，Ｌ−グルタメートＮＢＤ誘導体のジスクシンイミジルエステル結晶を２．１ｇ得た（収率８０％）。

得られた化合物のＩＲスペクトル分析を行い、カルボキシル基の１７００ｃｍ^-1付近の吸収ピークの消失と、１７７０ｃｍ^-1付近の新たな吸収ピークの出現により、スクシンイミドエステルが得られていることを確認した。また、蛍光スペクトル分析を行い、極大蛍光波長５４０ｎｍ（励起波長４８８ｎｍ）のスペクトルから、ＮＨ−ＮＢＤ誘導体であることを確認した。このようにして、上記で得られた化合物が目的物であることを確認した。

（実施例）
ｐＨ８のリン酸−ホウ酸緩衝液に、濃度が５×１０^-4Ｍとなるようにニワトリ卵白リゾチーム（分子量１４．３ｋＤ）を溶解させた溶液を調製し、この溶液１ｍｌに対し、５×１０^-4Ｍの合成例で得られた本発明の架橋剤のエチルアルコール溶液０．２ｍｌを混合し、３０℃で８時間放置し、架橋反応液を得た。
得られた反応液をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分析し、市販の蛍光イメージアナライザーを用いて、励起波長４８８ nmでシグナルを検出したところ、用いた上記リゾチームの分子量のほぼ２倍の分子量である新たなタンパク質バンドを検出した。これは上記架橋剤で二つの上記リゾチーム分子が架橋された架橋産物であった。
一方、本実施例で用いた架橋剤は比較的疎水性が高く、該架橋剤がリゾチーム分子の架橋部位近傍に接近できたことから、リゾチーム分子の架橋部位近傍の表面は、ある程度の疎水性を有することが推測された。さらに、架橋された二つのリゾチーム分子においては、このような疎水性表面同士の間で、疎水性相互作用が生じている可能性が示唆された。

本発明は、タンパク質のトポロジー解析に利用可能である。

Claims (3)

1. 下記式（ＩＩ）で表されることを特徴とする蛍光性化合物。
   

   

   （式中、ｌ＝２且つｍ＝０、又はｌ＝０且つｍ＝２、の何れかである。）
2. タンパク質分子間又はタンパク質複合体内における架橋剤用であることを特徴とする請求項１に記載の蛍光性化合物。
3. 請求項２に記載の蛍光性化合物を用いて、タンパク質分子間又はタンパク質複合体内で架橋反応を行い、得られた架橋産物の蛍光シグナルを検出することを特徴とするタンパク質のトポロジー解析方法。