CN111208299B - 一种交联肽段定性定量分析方法 - Google Patents

一种交联肽段定性定量分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种交联肽段的定性定量分析方法。其方法利用标记后碎片离子的成对出现特性，实现包括蛋白质的交联、酶解及标记、液质联用分析、谱图预处理、数据检索、质量控制及定量分析。本发明鉴定准确度高，降低数据检索及质量控制计算量，定量准确度高、精密度好，动态范围宽。对单一蛋白、单一蛋白质复合体及大规模蛋白质复合体的动态组成及结构研究具有显著优势。

Description

一种交联肽段定性定量分析方法
技术领域
本发明涉及一种交联肽段的定性定量分析方法，包括交联肽段标记、质谱分析、谱图预处理、肽段鉴定、质量控制及定量分析。该发明具有鉴定准确度高，降低数据检索及质量控制计算量，定量准确度高、精密度好，动态范围宽等优点。对单一蛋白、单一蛋白质复合体及大规模蛋白质复合体的动态组成及结构研究具有显著优势。
背景技术
蛋白质及其复合体结构的详细解析是理解其性质和功能的重要组成部分，在生物过程中具有重要意义。目前获得蛋白质结构信息的主要方法包括X射线晶体衍射、核磁共振技术(NMR)、冷冻电镜、交联质谱等。交联质谱作为近些年发展起来的新技术，可以有效的获得蛋白相互作用的界面信息，并可以实现原位交联，通过交联剂的共价作用固定相互作用力较弱的蛋白质，因此，近些年获得了广泛的关注。
然而，由于交联后肽段的结构较传统蛋白质组所得肽段复杂很多，因此对其定性定量方法提出了更高的要求。对于交联肽段的鉴定，目前的方法大多沿用了传统蛋白质组学的目标-诱饵策略，即将靶蛋白数据库反转或改组以产生的诱饵序列，与靶蛋白数据库合并作为数据检索的总数据库。利用总数据库对产生的质谱谱图进行数据检索及可靠性评价，再根据结果中匹配到的诱饵库谱图数和目标库谱图数计算假发现率(False DiscoveryRate,FDR)，进而通过FDR的阈值得到可信度较高的鉴定结果。但对于交联肽，每张谱图对应着两条肽段的综合匹配，每条肽段都有匹配到诱饵肽的可能，因此需要考虑目标-目标，诱饵-诱饵，目标-诱饵这三种可能(Nat.Methods.2012,9,901.)，给计算增加了难度；并且大量的诱饵库的加入增加了误匹配的可能和计算的数据量。
对于交联肽的定量，目前的方法主要涉及基于一级谱的利用重和轻标记的同位素标记交联剂或相互作用的蛋白(如传统的基于SILAC的方法)方法、基于一级谱的无标记定量方法和基于二级谱报告离子的定量方法。目前的交联蛋白质定量软件仅包括XiQ(JProteomics.2013,88,120.)和xTract(Nat Methods.2015,12,1185)。但该方法定量准确度易受到共洗脱的非交联肽段干扰，准确度仍有待提高。
发明内容
本发明针对交联肽段的特有性质及现有方法的不足，发展了一种交联肽段定性定量分析方法，包括交联肽段的标记思路的改变、质谱采集方法的配合、新型谱图预处理、肽段鉴定、质量控制方法及相应定量分析方法。以此提高交联肽段鉴定的可信度和定量的准确度。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种交联肽段定性定量分析方法，利用同位素标记策略将交联肽段分别轻重标记后同时进入质谱分析，使轻重标记交联肽段共碎裂进入同一张二级谱，且在二级谱中，轻重标记肽段碎片离子质量不同且成对出现，利用成对的碎片离子过滤二级谱图并进行数据检索，得到交联肽段鉴定结果；利用交联肽段匹配到的成对碎片离子的数目及种类与交联肽段的长度信息，获取高可信度的交联肽段质量控制信息；提取二级谱中成对的特征碎片离子强度进行相对比较，实现交联肽段的定量分析。
质谱分析模式选择利用轻重标记交联肽段母离子质量差触发肽段碎裂和二级谱扫描，利用基于动态排除的数据依赖采集模式，利用基于肽段强度及电荷过滤的数据采集模式，利用非数据依赖采集模式，利用基于靶向肽段的平行反应监控采集模式或利用基于无动态排除的数据依赖采集模式中的至少一种。
过滤二级谱图并进行数据检索步骤为，将采集到的二级谱图按照轻重标记碎片离子质量差进行过滤，当带有相应质量差的碎片离子成对出现时，则保留，将不成对的信号去除，实现二级谱图过滤；将过滤后的谱图只保留轻标或者重标中的一种，进行交联肽段蛋白质组数据检索，得到交联肽段鉴定结果。
涉及到的同位素标记策略使得轻重标记后的交联肽段能够共碎裂进入同一张二级谱，即交联肽段一级谱质荷比差别为0-25m/z，且在二级谱中，轻重标记肽段碎片离子质量不同，并能够成对出现；
标记策略包括：二甲基化标记、18O标记、SILAC标记、胍基化标记、ICAT标记中的两种或三种以上标记方法的组合。
获取高可信度的交联肽段质量控制信息的步骤为，将鉴定到的交联肽段根据匹配到的a,b,y,z,c,x成对碎片离子的数目及包含交联剂的碎片离子的数目进行打分，并除以交联肽段的长度信息，构成交联肽段的质量控制方法；对所有谱图进行计算后获得高可信度的交联肽段信息。
定量方法中比较的特征碎片离子强度包括全部碎片离子的强度加和、a1+离子强度、y1+离子强度、b1+离子强度、跨交联剂碎片离子强度中的一种及两种以上。
分析的交联肽段适合于经过质谱不可断裂型交联剂，包括双琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)、双琥珀酰亚胺戊二酸酯(DSG)、二(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯(BS3)和二(磺基琥珀酸亚酰胺)戊二酸酯(BS2G)或质谱可断裂型交联剂，包括赖氨酸特异性可富集型交联剂(Leiker)、蛋白相互作用受体(PIR)、叠氮型交联剂(Azide-DSG、BAMJ)、光断裂交联剂(IRCX、BiPS、SBC)、二甲基乙炔苯(DEB)、二琥珀酰亚胺亚砜(DSSO)，交联后的肽段。
交联肽段的共碎裂使用的质谱碎裂方式包括碰撞诱导解离(简写为：CID)、高能碰撞诱导解离(简写为：HCD)、电子转移离解(简写为：ETD)、紫外诱导解离(简写为：UVPD)、EThcD、ETciD中的一种及二种以上。
随着标记同位素的引入，定量方法适用于包括两重、三重、四重、五重、六重、七重或八重待测交联肽段样品的同时相对定量分析，或适用于加入标准肽段的多样品绝对定量分析。
所述的质谱分析系统中的质谱仪包括静电场轨道阱(简写为：Orbitrap)、飞行时间管(简写为：TOF)、三重四级杆(简写为：QQQ)或傅立叶变换离子回旋共振质量分析器(简写为：FT-ICR)。
1、将待比较的交联肽段样本按照二甲基化标记、18O标记、SILAC标记、胍基化标记、ICAT标记中的两种或以上标记方法的组合标记策略进行两重、三重或八重以下标记并混合，使得标记后的交联肽段能够共碎裂进入同一张二级谱，即交联肽段一级谱质荷比为0-25m/z，且在二级谱中，轻重标记肽段碎片离子质量不同，并能够成对出现。
2、将混合后的样本进入液质联用系统中进行分析。质谱分析模式选择利用轻重标记交联肽段母离子质量差触发肽段碎裂和二级谱扫描，利用基于动态排除的数据依赖采集模式，利用基于肽段强度及电荷过滤的数据采集模式，利用非数据依赖采集模式，利用基于靶向肽段的平行反应监控采集模式或利用基于无动态排除的数据依赖采集模式中的至少一种，质谱碎裂方式选择碰撞诱导解离(CID)、高能碰撞诱导解离(HCD)、电子转移离解(ETD)、紫外诱导解离(UVPD)、EThcD、ETciD中的一种及以上，获得交联肽段的质谱数据。
3、对获得的交联肽段质谱数据进行过滤，利用采集到的二级谱图轻重标记碎片离子质量差固定的性质，当带有相应质量差的碎片离子成对出现时，则保留，将不成对的信号去除，实现二级谱图过滤；将过滤后的谱图只保留轻标或者重标中的一种，形成新的过滤后的二级谱图，放入交联肽段检索软件中进行交联蛋白质组数据检索，得到每张谱图的交联肽段鉴定结果。
4、对得到的鉴定结果进行质量控制，将每张鉴定到交联肽段的谱图按照匹配到的a,b,y,z,c,x成对碎片离子的数目及是否跨交联剂的种类进行打分，并除以交联肽段的长度信息，构成交联肽段的质量控制方法；过滤掉得分较低的鉴定结果，获得高可信度的交联肽段信息。
5、对得到的高可信度的交联肽段进行定量分析，提取其二级谱中成对的碎片离子强度进行比较，比较的特征碎片离子强度包括全部碎片离子的强度加和、a1+离子强度、y1+离子强度、b1+离子强度、跨交联剂碎片离子强度中的一种或以上。将轻、重标记的强度相除作为该张谱图的定量结果，计算交联肽段多种碎片离子的变异系数CV，进一步过滤掉变异系数大的定量信息，相同的交联肽段对应谱图取比值的中值作为该交联肽段的定量比值，实现交联肽段的定量分析。
本发明具有如下优点：
1、本方法是一种利用二级谱碎片离子实现交联肽段定性定量分析的方法，相比于基于一级谱母离子强度和二级谱报告离子强度的方法，该方法具有更强的离子特异性和抗干扰能力，定量动态范围宽，因此可以提高交联肽段的定量准确度，特别适合交联肽段的定量体系。
2、本方法标记后所有碎片离子均具有成对性质，不成对的均为噪音离子，因此可以有效的实现交联肽段谱图的去噪过滤步骤，大大降低了鉴定的假阳性。
3、成对性质应用在质量控制过程中，对于单一蛋白或者单一蛋白质复合体的分析，降低了结果的误匹配概率，提高了鉴定结果的可信度。
4、本方案不需不依赖与目标-靶向策略，大大减小的数据检索库的大小，降低的所需耗费的计算资源和时间。
5、该策略可以实现多至八重的定量分析，既可以实现相对定量，也可以实现绝对定量，分析通量高，适用范围宽。
附图说明
图1本发明交联肽段定性定量的分析方法原理示意图。
具体实施方式
实施例1
实验流程如图1所示，具体步骤为：
1.对交联肽段样品的标记
将待分析的两份BSA蛋白样品分别利用双琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)进行交联，再加入终浓度8M尿素，终浓度10mM DTT、终浓度20mM IAA进行蛋白的变性、还原、烷基化，分别在水及18O水中按酶与蛋白质量比1：50加入胰蛋白酶，37℃进行过夜酶解。再在100μg酶解产物中分别加入20μL 4％CH2O或CD2O，20μL 0.6M NaCNBD3试剂进行二甲基化标记。标记后按照质量比1：1混合两份样品，用C18捕集柱除盐蒸干，用A相(含体积浓度2％ACN和体积浓度0.1％FA的水溶液)复溶，将所有样品于-20℃保存待用。
2.液质联用分析
液相色谱条件：流动相，缓冲液A相(含体积浓度2％ACN和体积浓度0.1％FA的水溶液)，缓冲液B相(含体积浓度98％ACN和体积浓度0.1％FA的水溶液),分离梯度为(时间/B相浓度)0min/0％-0.5min/8％-65min/24％-90min/35％-99min/35％-100min/55％-110min/90％，流速为600nL/min。
质谱条件：使用Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪进行数据采集，采用数据依赖型(DDA)采集模式，Full MS分辨率为500,000(m/z＝200)，质量范围350-1500m/z,AGC4.0e6,最大离子注入时间200ms；选择价态在3+以上，且目标质量差在32mDa，强度在最强母离子50％-100％，质量差异±10ppm的肽段进行二级谱碎裂，MS/MS选择5s的循环时间，动态排除时间20.0s，碎裂模式为HCD,归一化碰撞能量为28％，分离窗口3.0Da，MS2起始分子量为50.0Da。MS/MS分辨率为15000(m/z＝200)，AGC 4e5，最大离子注入时间80ms。样品平行进样三次重复采集。
3.谱图过滤
对获得的交联肽段质谱数据进行过滤，保留质量差为4.008Da或4.024Da，且碎片离子相对强度在最强碎片50％-100％范围内的成对碎片离子对，当谱图中碎片不成对或成对碎片强度相差较大时，删去其强度。将过滤后所得的碎片离子，按照轻重标记质量差识别出其离子种类，即当质量差为4.008Da时，其为a,b,c离子；当质量差为4.024Da时，其为x,y,z离子。再保留所有轻标对应的碎片离子，形成新的过滤后的二级谱图。
4.数据检索
将所有新的二级谱图汇成.mgf文件，放入交联肽段检索软件pLink中进行交联蛋白质组数据检索。计算形式选择普通交联，交联剂为DSS，数据库为uniprot下载的BSA蛋白序列，trypsin酶切最大3个漏切位点，母离子质量容差20ppm，子离子质量容差20ppm，固定修饰：C为Carbamidomethyl,肽段N端34Da二甲基化标记，可变修饰：Oxidation(M)。不进行结果的FDR筛选，得到每张谱图的交联肽段鉴定结果。
5.结果质量控制
对得到的鉴定结果进行质量控制，将每张鉴定到交联肽段的谱图按照匹配到的a,b,y,z,c,x成对碎片离子的数目及是否跨交联剂的种类进行打分，将匹配到的跨交联剂碎片离子数乘以1.5与非跨交联剂碎片离子数加和，并除以交联肽段的长度信息，得到每条交联肽段的得分，构成交联肽段的质量控制方法；过滤掉得分低于1的鉴定结果，获得高可信度的交联肽段信息。
6.交联肽段定量分析
对得到的高可信度的交联肽段进行定量分析，提取其二级谱中所有成对的碎片离子强度，每种碎片离子相除得到其比值，计算多种碎片离子的变异系数CV，当CV大于50％时，过滤其比值变化较大的离子，再将所有碎片离子比值取中值，作为该谱图的交联肽段定量结果。相同的交联肽段对应谱图取比值的中值作为该交联肽段的定量比值，实现交联肽段的定量分析。
实施例2
本实施例步骤1-5同实施例1，定量分析方法选择交联肽段的a1离子作为定量离子，当交联肽段的两个a1离子定量比值变异系数CV大于50％时，该肽段定量结果不可信，不报告其定量结果；当变异系数CV小于50％时，两定量比值取平均值作为该交联肽段的比值。
实施例3
本实施例步骤1，3，4，5，6同实施例1，步骤2中质谱采集条件选择非数据依赖型(DIA)采集模式，Full MS分辨率为500,000(m/z＝200)，质量范围400-1500m/z,AGC 4.0e6,最大离子注入时间200ms；以5m/z为隔离窗口，重叠1m/z，在质量范围内依次碎裂，碎裂模式为HCD,归一化碰撞能量为28％，MS2起始分子量为50.0Da。MS/MS分辨率为15000(m/z＝200)，AGC 4e5，最大离子注入时间80ms。
实施例4
本实施例步骤1，3，4，5，6同实施例1，步骤2中采用数据依赖型(DDA)采集模式，Full MS分辨率为500,000(m/z＝200)，质量范围350-1500m/z,AGC4.0e6,最大离子注入时间200ms；选择价态在3+以上，且目标质量差在32mDa，强度在最强母离子50％-100％，质量差异±10ppm的肽段进行二级谱碎裂，MS/MS选择5s的循环时间，动态排除时间20.0s，碎裂模式为EThcD，归一化碰撞能量为28％，分离窗口3.0Da，MS2起始分子量为50.0Da。MS/MS分辨率为15000(m/z＝200)，AGC 4e5，最大离子注入时间80ms。
实施例5
本实施例步骤2，3，4，5，6同实施例1，步骤1中将待分析的两份BSA蛋白样品利用DSS进行交联，再加入8M尿素，终浓度10mM DTT、终浓度20mM IAA进行蛋白的变性、还原、烷基化，分别在水及18O水中1：50加入胰蛋白酶，37℃进行过夜酶解。再进行ICAT标记，得到标记后的交联肽段。

Claims (10)

1.一种交联肽段定性定量分析方法，其特征在于：
利用同位素标记策略将交联肽段分别轻重标记后同时进入质谱分析，使轻重标记交联肽段共碎裂进入同一张二级谱，且在二级谱中，轻重标记肽段碎片离子质量不同且成对出现，利用成对的碎片离子过滤二级谱图并进行数据检索，得到交联肽段鉴定结果；利用交联肽段匹配到的成对碎片离子的数目及种类与交联肽段的长度信息，获取高可信度的交联肽段质量控制信息；提取二级谱中成对的特征碎片离子强度进行相对比较，实现交联肽段的定量分析。
2.按照权利要求1所述的交联肽段定性定量方法，其特征在于：质谱分析模式选择利用轻重标记交联肽段母离子质量差触发肽段碎裂和二级谱扫描，利用基于动态排除的数据依赖采集模式，利用基于肽段强度及电荷过滤的数据采集模式，利用非数据依赖采集模式，利用基于靶向肽段的平行反应监控采集模式或利用基于无动态排除的数据依赖采集模式中的至少一种。
3.按照权利要求1所述的交联肽段定性定量方法，其特征在于：过滤二级谱图并进行数据检索步骤为，将采集到的二级谱图按照轻重标记碎片离子质量差进行过滤，当带有相应质量差的碎片离子成对出现时，则保留，将不成对的信号去除，实现二级谱图过滤；将过滤后的谱图只保留轻标或者重标中的一种，进行交联肽段蛋白质组数据检索，得到交联肽段鉴定结果。
4.按照权利要求1所述的交联肽段定性定量方法，其特征在于：涉及到的同位素标记策略使得轻重标记后的交联肽段能够共碎裂进入同一张二级谱，即交联肽段一级谱质荷比差别为0-25m/z，且在二级谱中，轻重标记肽段碎片离子质量不同，并能够成对出现；
标记策略包括：二甲基化标记、18O标记、SILAC标记、胍基化标记、ICAT标记中的两种或三种以上标记方法的组合。
5.按照权利要求1所述的交联肽段定性定量方法，其特征在于：获取高可信度的交联肽段质量控制信息的步骤为，将鉴定到的交联肽段根据匹配到的a, b, y, z, c, x成对碎片离子的数目及包含交联剂的碎片离子的种类进行打分，并除以交联肽段的长度信息，构成交联肽段的质量控制方法；对所有谱图进行计算后获得高可信度的交联肽段信息。
6.按照权利要求1所述的交联肽段定性定量方法，其特征在于：定量方法中比较的特征碎片离子强度包括全部碎片离子的强度加和、a1+离子强度、y1+离子强度、b1+离子强度、跨交联剂碎片离子强度中的一种及两种以上。
7.按照权利要求1所述的交联肽段定性定量方法，其特征在于：分析的交联肽段适合于经过质谱不可断裂型交联剂，包括双琥珀酰亚胺辛二酸酯、双琥珀酰亚胺戊二酸酯、二(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯和二(磺基琥珀 酸亚酰胺)戊二酸酯或质谱可断裂型交联剂，包括赖氨酸特异性可富集型交联剂、蛋白相互作用受体、叠氮型交联剂、光断裂交联剂、二甲基乙炔苯、二琥珀酰亚胺亚砜。
8.按照权利要求1所述的交联肽段定性定量方法，其特征在于：交联肽段的共碎裂使用的质谱碎裂方式包括碰撞诱导解离、高能碰撞诱导解离、电子转移离解、紫外诱导解离、EThcD、ETciD中的一种及二种以上。
9.按照权利要求1、4或6所述的交联肽段定性定量方法，其特征在于：随着标记同位素的引入，定量方法适用于包括两重、三重、四重、五重、六重、七重或八重待测交联肽段样品的同时相对定量分析，或适用于加入标准肽段的多样品绝对定量分析。
10.按照权利要求1所述的交联肽段定性定量方法，其特征在于：所述的质谱分析系统中的质谱仪包括静电场轨道阱、飞行时间管、三重四级杆或傅立叶变换离子回旋共振质量分析器。
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