CN107848956A - 用于样品制备尤其是用于质谱分析的方式和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及叔胺在优选用于质谱和/或UV/可见光谱分析的样品制备中作为缓冲剂的用途，其中所述样品包括蛋白质、多肽和/或肽，所述样品制备包括：(a)蛋白质、多肽和肽的变性；及(b)化学同位素标记和/或化学交联，其中所述样品制备不使用伯胺缓冲剂。
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技术领域
本发明涉及叔胺在优选用于质谱和/或UV/可见光谱分析的样品制备中作为缓冲剂的用途，其中所述样品包括蛋白质、多肽和/或肽，所述样品制备包括：(a)蛋白质、多肽和肽的变性；及(b)化学同位素标记和/或化学交联，其中所述样品制备不使用伯胺缓冲剂。
背景技术
在本说明书中引用了许多文献，包括专利申请及生产商的手册。这些文献公开的内容，虽然并不被认为与本发明的可专利性相关，在此将其全部内容引入本申请作为参考。更具体而言，所有参考文献作为参考引入本申请的范围和程度如同每篇单独的文献明确且单独地表示作为参考引入本申请。
自下而上的蛋白质组学分析平台在性能和通量方面迅速取得进步。质谱仪在采集速率和灵敏度方面有所改善，从而在更短的时间内达到蛋白质组学分析深度。样品制备是总工作流程的一个非常重要的组成部分，仍然是高通量的基于MS的蛋白质组学分析的限制因素。采用改变分析物质量的同位素标记技术通过样品复用，可以改善通量。于是分析物的生物化学行为几乎相同，但是其质量不同，这可以在质谱仪中观察到。因此，以不同方式同位素标记的样品可以在LC-MS分析之前混合，这导致更高的样品复杂性以及更高的总通量(Ong,S.E.and M.Mann,Mass spectrometry-based proteomics turns quantitative.NatChem Biol,2005.1(5):p.252-62)。
同位素标记技术包括在细胞培养中利用氨基酸的稳定同位素标记(SILAC)(Ong,S.E.,et al.,Stable isotope labelling by amino acids in cell culture,SILAC,asa sample and accurate approach to expression proteomics.Mol Cell Proteomics,2002.1(5):p.376-86)及化学衍生，例如同位素编码的亲和标签(ICAT)(Yi,E.C.,et al.,Increased quantitative proteome coverage with(13)C/(12)C-based,acid-cleavableisotope-coded affinity tag reagent and modified data acquisitionscheme.Proteomics,2005.5(2):p.380-7)及等量异位质量标签(TMT，iTRAQ)(Thompson,A.,et al.,Tandem mass tags:a novel quantification strategy for comparativeanalysis of complex protein mixtures by MS/MS.Anal Chem,2003.75(8):p.1895-904；Ross,P.L.,et al.,Multiplexed protein quantitation in Saccharomycescerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.Mol CellProteomics,2004.3(12):p.1154-69)。化学标记已知其复用能力和样品标记选项的多功能性。大多数化学标记试剂是基于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯反应性基团，其反应及以共价方式修饰伯胺基。然而，副产物和化学品背景，尤其是伯胺，会淬灭标记效率，并由此降低测量性能。这些标记试剂的生产商建议在标记之前典型地通过沉淀使蛋白质浓缩及去除任何化学品，从而允许有效地与NHS酯标记物反应。
在色谱及MS分析之前在样品制备中采用的典型的工作流程包括以下步骤。对细胞和组织材料实施裂解。在裂解之前，可以实施交联，如化学交联。交联可以是阐释体内相互作用的手段。典型的用于交联的试剂是NHS酯。在裂解之后，实施变性。二硫化物桥被还原，所得的巯基被烷基化。在许多场合利用胰蛋白酶对所得的材料实施蛋白酶解。然后，可以实施化学同位素标记。假如用于之前的步骤的试剂对化学标记过程造成负面干扰，则必须通过麻烦的纯化步骤实施标记步骤。这一纯化步骤包括沉淀、离心分离和再悬浮。这些步骤不仅是麻烦费力的，并且要求传递(hand-on)时间，而且此外它们典型地要求至少100μg蛋白质；否则存在发生样品损耗及甚至样品完全损耗的巨大风险。
发明内容
鉴于现有技术的缺陷，可以看出本发明所基于的技术问题是提供尤其是用于质谱或UV/可见光谱分析的样品制备的替代性或改进的方式和方法。
在第一方面，本发明提供包含或由N,N-二烷基卤代烷酰胺组成的烷基化剂，其中(i)每个烷基独立地选自C1至C5非分支或分支的烷基；(ii)烷烃是非分支或分支的C2至C5烷烃；及(iii)卤素选自氯、溴和碘，其中每个所述烷基和所述卤代烷酰胺可以独立地被取代，取代基包括OH。
术语“烷基化剂”是指能够将烷基部分引入靶分子的物质的组合。典型地，烷基化在靶分子的反应性基团上发生。根据本发明优选的反应性基团是巯基。根据本发明的优选种类的靶分子是蛋白质、多肽和肽。
将烷基化剂命名为卤代烷酰胺是遵循标准命名法。为了进一步解释，烷酰胺是其中位于1位的碳是酰胺的烷烃。例如，乙酰胺(ethanamide)在现有技术中也已知为乙酰胺(acetamide)。实际上，乙酰胺是根据本发明优选的烷酰胺。
以上所公开的烷基化剂是带有至少三个取代基的烷酰胺：键结至酰胺氮的两个烷基部分，以及在烷酰胺的烷烃部分中的卤素。
虽然并非优选，可以设想存在其他杂原子；例子包括可以连接至任一烷基部分和/或连接至烷烃的羟基。优选每个烷烃或烷基部分存在一个羟基。
术语“非分支”和“分支”具有其在现有技术中所规定的含义。非分支的烷基或烷烃部分还分别已知为正烷基和正烷烃。另一方面，异丙基是分支的烷基部分的一个例子。2-甲基丙酰胺是分支的C4烷酰胺的一个例子。
在第二方面，本发明提供在第一方面所定义的N,N-二烷基卤代烷酰胺用于烷基化的用途。
以下优选的实施方案同时涉及本发明的根据第一方面的烷基化剂及根据第二方面的用途。
在一个优选的实施方案中，两种出现的烷基是甲基或乙基。本实施方案涉及N,N-二甲基卤代烷酰胺以及N,N-二乙基卤代烷酰胺。
在另一个优选的实施方案中，所述烷烃是乙烷。换而言之，所述烷酰胺是乙酰胺。
在任何以上方面的其他优选的实施方案以及优选的实施方案中，(a)所述卤素是氯；和/或(b)所述卤素位于所述卤代烷酰胺的2位。
换而言之，即使优选为乙酰胺，本发明仍然扩展至例如在氮上具有如上所定义的烷基取代基的2-氯-丙酰胺。因此，本发明还提供包含或由N,N-二烷基卤代烷酰胺组成的烷基化剂，其中(i)每个烷基独立地选自C3至C5非分支或分支的烷基；(ii)烷烃是非分支或分支的C3至C5烷烃；及(iii)卤素选自氯、溴和碘，其中每个所述烷基和所述卤代烷酰胺均可以独立地被取代，取代基包括OH；及其中所述卤素位于所述卤代烷酰胺的2位。
如上所述，优选所述烷基部分均没有被取代，此外卤代烷酰胺不带有任何除卤素以外的其他取代基。
在一个特别优选的实施方案中，所述试剂是2-氯-N,N-二甲基乙酰胺或2-氯-N,N-二乙基乙酰胺。
在另一个优选的实施方案中，所述烷基化是蛋白质、多肽和/或肽的烷基化，优选为所述蛋白质、多肽和/或肽中的–SH基的烷基化。
在现有技术中，为了半胱氨酸的烷基化，通常使用2-碘代乙酰胺(IAA)或2-氯代乙酰胺(CAA)。然而，这些烷基化剂能够与化学标记试剂例如NHS酯反应。因此，在用于化学标记(同样适用于化学交联)的反应混合物中存在现有技术中所规定的烷基化剂是非期望的，这是因为存在IAA或CAA会淬灭所预期的烷基化反应(或交联反应)。本发明的发明人出人意料地发现，使用叔胺作为烷基化剂是回避这一问题的一种方式。根据本发明使用新型烷基化剂，有助于将上述麻烦的沉淀步骤省略掉。实际上，沉淀在现有技术中所规定的过程中是必不可少的步骤，实施沉淀特别是为了去除掉在化学标记步骤之前在烷基化步骤中使用的烷基化剂。
不同于在现有技术中所规定的烷基化剂，根据本发明的新型烷基化剂的其他优点在于，其不是固体，而是液体。因此，不需要对烷基化剂进行称重；而是可以移液。
术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”具有其在现有技术中所规定的含义。肽和多肽是单个分子，其中蛋白质可以具有二聚体、寡聚体或多聚体结构。蛋白质可以与非蛋白质分子相连接，其中此连接可以是共价或非共价的。二聚、寡聚或多聚蛋白质中的单体单元是多肽。任一肽和多肽均是氨基酸的缩聚物，其中肽由最多及包括30个氨基酸组成，而多肽由多于30个氨基酸组成。
肽、多肽和蛋白质的单体结构单元优选为20种标准α-氨基酸。话虽如此，故意地将其他天然产生或非天然产生的氨基酸想象成结构单元。其例子是硒代蛋氨酸、吡咯赖氨酸及羟脯胺酸。鸟氨酸和刀豆氨酸是其他非典型的氨基酸。
肽和多肽可以包含翻译后修饰，例如磷酸化作用、糖化作用、糖基化作用及甲基化作用。这些及其他翻译后修饰在现有技术中是公知的，作为肽、多肽和蛋白质中的典型的连接位点。
在第三方面，本发明提供优选用于质谱和/或UV/可见光谱分析的样品制备的方法，所述样品包括蛋白质、多肽和/或肽，所述方法包括或由以下步骤组成：利用如上所定义的试剂使所述蛋白质、多肽和/或肽发生烷基化。
本发明的新型烷基化剂可以方便地用于任何种类的样品制备。尤其是质谱和UV/可见光谱分析所需的样品制备种类明显地得益于通过所述烷基化剂实现的简化的工作流程。
以上所公开的方面涉及在尤其是用于质谱分析以及目的在于检测在样品中以化学方式标记的例如以化学方式同位素标记的和/或化学交联的分子种的任何其他光谱学应用的样品制备期间的特别的改进。所述改进是使用更好的烷基化剂。
为了一致地避免可能对化学同位素标记或化学交联造成负面干扰的试剂，本发明的发明人提供进一步的巨大改进。在现有技术中，样品制备或其至少某些步骤是在包含伯胺的缓冲液例如Tris缓冲液中进行的。这是伯胺的第二来源。然而，伯胺会淬灭化学标记试剂、尤其是NHS酯与其各自的靶分子的反应。为了完全省略掉上述沉淀和再悬浮步骤，本发明的发明人进一步实现了故意地避免伯胺缓冲剂的过程。
因此，在第四方面，本发明提供叔胺在优选用于质谱(MS)和/或UV/可见光谱分析的样品制备中作为缓冲剂的用途，其中所述样品包括蛋白质、多肽和/或肽，所述样品制备包括：(a)蛋白质、多肽和肽的变性；及(b)化学同位素标记和/或化学交联。
如上所解释，蛋白质和多肽的变性是样品制备中的第一强制性步骤。整个样品制备工作流程在上面进行了描述，此外是下面进一步详细阐述的本发明主题。
一般而言，本发明提供简化用于光谱学方法特别是质谱分析的样品制备的方式和方法。通过一致地避免包含伯胺基的试剂，能够实现所述简化。如上所述，伯胺淬灭样品成分的反应，特别是蛋白质和肽与化学标记试剂和交联剂的反应。仲胺在此方面不太关键。在一个特别优选的实施方案中，还避免包含仲胺基的试剂。
现有技术的方法典型地使用伯胺试剂，例如包含伯胺基的缓冲剂。为了避免所述淬灭，现有技术的方法典型地包括分离步骤，例如沉淀。下面给出在现有技术的样品制备与根据本发明的样品制备之间的示例性比较。
现有技术中用于MS的样品制备典型地包括：(1)在包含伯胺基的缓冲剂中使蛋白质溶解、还原及烷基化，(2)例如通过添加丙酮，使蛋白质沉淀以去除所述缓冲剂以及盐，(3)通过使用不含伯胺基的缓冲剂使蛋白质再悬浮，(4)使蛋白质发生蛋白水解消化以获得肽，及(5)通过使用利用NHS酯活化的试剂标记肽的伯胺基。根据本发明，可以省略掉步骤(2)和(3)，即可以在步骤(1)之后实施蛋白水解消化和标记，没有任何中间步骤，即在相同的缓冲剂中及优选在相同的容器中。
通过避免伯胺试剂及一致地使用叔胺试剂，其是叔胺缓冲剂和/或叔胺烷基化剂，能够实现更简单的工作流程。所述更简单的工作流程的特征在于不进行沉淀，特别是蛋白质沉淀。
在根据第四方面的用途的一个优选的实施方案中，所述叔胺选自：(a)三甲基铵盐，优选为三甲基碳酸氢铵(TEAB)、三甲基甲酸铵(TEAF)及三甲基乙酸铵(TEAA)；及(b)包含一个或多个氮的两性离子缓冲物质，所述一个或多个氮是叔胺氮，所述两性离子缓冲物质优选选自：HEPES、MOPS、HEPPS及MES。
这些缓冲物质的共同特征是叔胺。虽然用于现有技术的某些过程，但是本发明的发明人首次认识到，贯穿样品制备的整个过程使用这些缓冲剂的显著的优点。实际上，它们的使用为避免预先经由缓冲物质引入的伯胺作准备。因此，在自动化系统中及因此实际上针对高通量样品操作非常难以实现的蛋白质沉淀，完全可以被省略掉。避免蛋白质沉淀，允许使化学标记进一步自动化，并由此改善该过程的重现性和鲁棒性。虽然在现有技术中典型地需要费力地使至少100μg蛋白质沉淀及洗涤蛋白质颗粒，而通过本发明实现的在下文中更详细地描述的标记方法则允许明显更高的灵敏度，可以允许单个分子标记，并且高度适合于在LC-MS实验中分析的在由约2至约20μg蛋白质的范围内的普通的蛋白质的量。
在根据第一方面的用途的另一个优选的实施方案中，所述样品制备包括或由以下步骤组成：(a)任选实施的化学交联；(b)任选实施的细胞裂解；(c)蛋白质、多肽和肽的变性；(d)还原；(e)烷基化；(f)蛋白酶解；及(g)任选实施的化学同位素标记，条件是：实施根据(a)的化学交联及根据(g)的化学同位素标记的至少之一。
化学交联和化学同位素标记是两个典型地使用被伯胺淬灭的试剂的步骤。实施化学同位素标记及化学交联的优选的pH范围为7至9。在此区间以外，则可能发生副反应。
在第五方面，本发明提供优选用于质谱和/或UV/可见光谱分析的样品制备的方法，所述样品包括蛋白质和/或多肽和/或肽，所述方法包括或由以下步骤组成，其中在相同的缓冲剂中实施所述步骤，所述缓冲剂是叔胺，优选为三乙基铵盐或如上所定义的两性离子缓冲物质，所述方法包括或由以下步骤组成：(a)任选实施的化学交联；(b)任选实施的细胞裂解，其中步骤(a)和(b)可以任意顺序实施；(c)蛋白质、多肽和肽的变性；(d)还原；(e)烷基化；(f)蛋白酶解；及(g)任选实施的化学同位素标记，条件是：实施根据(a)的化学交联及根据(g)的化学同位素标记的至少之一。
可以在步骤(a)、(b)、(e)、(f)和/或(g)中的一个或多个之后实施一个或多个中间纯化步骤。优选仅在步骤(g)之后进行纯化，直至步骤(g)实际实施的程度。在第15 176142.6号欧洲专利申请中公开了一种优选的纯化方法。
在根据第四方面的用途及根据第五方面的方法的一个优选的实施方案中，利用根据第一方面所定义的试剂实施根据(d)的所述烷基化。
这些优选的用途和方法的特征在于：(i)分别针对整个用途或方法使用叔胺缓冲剂，(ii)不使用包含伯胺基的试剂，(iii)为了烷基化，使用叔胺作为所述试剂，及(iv)，与(ii)一致地，不使用包含伯胺基的烷基化剂。
在所述用途和所述方法的另一个优选的实施方案中，所述样品制备不包括沉淀。如上所解释，本发明的发明人的贡献在于建立完全省略掉沉淀的样品制备规程。虽然仍然可以实施沉淀，但是这显然并非有意，因此是不优选的。
在第六方面，本发明提供包含或由以下组分组成的试剂盒：(a)根据第一方面所定义的试剂；(b)缓冲剂，其是叔胺，所述叔胺优选为三乙基铵盐或如上所定义的两性离子缓冲物质。
在一个优选的实施方案中，所述试剂盒可以额外包含一种或多种以下组分：(c)还原剂，优选为TCEP或DTT；(d)蛋白水解酶，优选为胰蛋白酶；(e)一种或多种同位素标记试剂，优选为NHS酯；(f)一种或多种交联剂，优选为NHS酯；及(g)手册，其包含实施本发明的第五方面的方法的说明书。
三(2-羧乙基)膦(TCEP)和二硫苏糖醇(DTT)均是在现有技术中所规定的还原剂。它们根据本发明依照改进的样品制备工作流程也适合于进行还原。
在用于质谱分析的样品制备的过程中使用蛋白水解酶是在现有技术中所规定的。这使得片段方便于操作和分析。蛋白水解酶的选择没有特别的限制；可以使用任何在现有技术中所规定的酶，其中优选为胰蛋白酶。
如上所述，化学同位素标记与化学交联的共同特征在于，用于任一过程的优选的试剂是N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯。羧酸的NHS酯还已知为活化的羧酸，条件是羧酸与NHS之间的酯是半稳定的。NHS酯如此用于标记及在质谱领域中的用途是在现有技术中所规定的；例如参见Quantitative Methods in Proteomics,Methods in Molecular Biology,Volume 893,2012,pp 85-100和Rappsilber J.(2011),The beginning of a beautifulfriendship:Cross-linking/mass spectrometry and modeling of proteins andmulti-protein complexes,J.Struct.Biol.173(3):530-540。
优选的标记试剂是TMT(串联质量标签)、iTRAQ(相对和绝对定量的等量异位标签)、mTRAQ；优选的交联剂是DSSO(双琥珀酰亚胺基亚砜)和DSS(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)。
在第七方面，本发明提供第六方面的试剂盒用于使蛋白质、多肽或肽发生烷基化的用途。在所述用途的一个优选的实施方案中，所述用途此外用于化学同位素标记。
Claims (15)
1.叔胺在优选用于质谱和/或UV/可见光谱分析的样品制备中作为缓冲剂的用途，其中所述样品包括蛋白质、多肽和/或肽，所述样品制备包括：
(a)蛋白质、多肽和肽的变性；及
(b)化学同位素标记和/或化学交联，
其中所述用途不包括伯胺缓冲剂。
2.根据权利要求1的用途，其中所述叔胺选自：
(a)三甲基铵盐，优选为三甲基碳酸氢铵(TEAB)、三甲基甲酸铵(TEAF)及三甲基乙酸铵(TEAA)；及
(b)包含一个或多个氮的两性离子缓冲物质，所述一个或多个氮是叔胺氮，所述两性离子缓冲物质优选选自：HEPES、MOPS、HEPPS及MES。
3.根据权利要求1或2的用途，其中所述样品制备包括或由以下步骤组成：
(a)任选实施的化学交联；
(b)任选实施的细胞裂解；
(c)蛋白质、多肽和肽的变性；
(d)还原；
(e)烷基化；
(f)蛋白酶解；及
(g)任选实施的化学同位素标记，
条件是：实施根据(a)的化学交联及根据(g)的化学同位素标记的至少之一。
4.用于质谱和/或UV/可见光谱分析的样品制备的方法，所述样品包括蛋白质、多肽和/或肽，所述方法包括或由以下步骤组成：利用包含或由N,N-二烷基卤代烷酰胺组成的烷基化剂使所述蛋白质、多肽和/或肽发生烷基化，其中
(i)每个烷基独立地选自C1至C5非分支或分支的烷基；
(ii)烷烃是非分支或分支的C2至C5烷烃；及
(iii)卤素选自氯、溴和碘，
其中每个所述烷基和所述卤代烷酰胺均可以独立地被取代，取代基包括OH。
5.用于质谱和/或UV/可见光谱分析的样品制备的方法，所述样品包括蛋白质、多肽和/或肽，所述方法包括或由以下步骤组成，其中所述步骤在相同的缓冲剂中实施，所述缓冲剂是叔胺，优选为在权利要求2中所定义的叔胺：
(a)任选实施的化学交联；
(b)任选实施的细胞裂解，其中步骤(a)和(b)可以任意顺序实施；
(c)蛋白质、多肽和肽的变性；
(d)还原；
(e)烷基化；
(f)蛋白酶解；及
(g)任选实施的化学同位素标记，
条件是：实施根据(a)的化学交联及根据(g)的化学同位素标记的至少之一，其中所述方法不使用伯胺缓冲剂。
6.根据权利要求3的用途或根据权利要求5的方法，其中利用包含或由N,N-二烷基卤代烷酰胺组成的烷基化剂实施根据(e)的所述烷基化，其中
(i)每个烷基独立地选自C1至C5非分支或分支的烷基；
(ii)烷烃是非分支或分支的C2至C5烷烃；及
(iii)卤素选自氯、溴和碘，
其中每个所述烷基和所述卤代烷酰胺均可以独立地被取代，取代基包括OH。
7.根据权利要求1至3或6之一的用途或根据权利要求4至6之一的方法，其中所述样品制备不包括沉淀，优选为蛋白质沉淀。
8.包括或由以下组分组成的试剂盒：
(a)包含或由N,N-二烷基卤代烷酰胺组成的烷基化剂，其中
(i)每个烷基独立地选自C1至C5非分支或分支的烷基；
(ii)烷烃是非分支或分支的C2至C5烷烃；及
(iii)卤素选自氯、溴和碘，
其中每个所述烷基和所述卤代烷酰胺均可以独立地被取代，取代基包括OH；
(b)缓冲剂，其是叔胺，所述叔胺优选如在权利要求2中所定义。
9.根据权利要求8的试剂盒用于使蛋白质、多肽或肽发生烷基化及优选此外用于化学同位素标记的用途。
10.各自根据权利要求4、6或8之一的方法、用途或试剂盒，其中在所述试剂中两种出现的烷基是甲基或乙基。
11.根据权利要求4、6、8或10之一的方法、用途或试剂盒，其中在所述试剂中所述烷烃是乙烷。
12.根据权利要求4、6、8、10或11之一的方法、用途或试剂盒，其中在所述试剂中
(a)所述卤素是氯；和/或
(b)所述卤素位于所述卤代烷酰胺的2位。
13.根据权利要求4、6、8或10至12之一的方法、用途或试剂盒，其中所述烷基没有被取代，并且所述卤代烷酰胺没有被取代。
14.根据权利要求4、6、8或10至13之一的方法、用途或试剂盒，其中所述试剂是2-氯-N,N-二甲基乙酰胺或2-氯-N,N-二乙基乙酰胺。
15.包含或由N,N-二烷基卤代烷酰胺组成的烷基化剂，其中
(i)每个烷基独立地选自C3至C5非分支或分支的烷基；
(ii)烷烃是非分支或分支的C3至C5烷烃；及
(iii)卤素选自氯、溴和碘，
其中每个所述烷基和所述卤代烷酰胺均可以独立地被取代，取代基包括OH；及其中所述卤素位于所述卤代烷酰胺的2位。
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