CN106596760A - 一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法，属于生物信息技术领域。所述鉴定方法对多肽两端进行同位素标记后的蛋白质酶解产物，在使用液相色谱‑质谱联用进行分离和检测后，在使用数据库搜索的方法进行鉴定时，通过构建包含两种标记形成的肽段的所有碎片离子的肽段理论谱图，并与实验质谱图进行匹配，实现对多肽的鉴定，进而鉴定得到蛋白质，提高了多肽和蛋白质鉴定的效率，可用于已知数据库蛋白质样品的高效鉴定。

Description

一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种基于等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法，具体地说，涉及一种通过对多肽的氮(N)端和碳(C)端分别进行稳定同位素标记，并根据标记形成的轻标和重标b(N端)离子以及轻标和重标y(C端)离子计算候选肽段得分值，基于数据库搜索的方法进行多肽和蛋白质鉴定的方法，属于生物信息技术领域。
背景技术
蛋白质是重要的生物大分子，在生命活动中发挥着重要作用。对蛋白质进行测序对于蛋白质一级结构的分析至关重要。目前最常用的蛋白质鉴定方法是将蛋白质酶解形成肽段后，进行液相色谱分离和质谱鉴定，然后将肽段的实验质谱图与蛋白质数据库理论酶解后形成的肽段的理论质谱图进行比较，根据不同候选肽段的理论质谱图和实验质谱图的匹配程度，计算不同候选肽段的得分值，进而获得多肽和蛋白质鉴定结果。
为了对生物过程进行深入研究，不仅需要对蛋白质组进行定性，而且需要对生物不同状态下的蛋白质组进行准确定量。多肽两端稳定同位素标记方法是蛋白质组学中一种常用的定量方法，通过在多肽N端和C端分别进行稳定同位素标记，实现两个或者多个样品中的肽段质量相同或者相近，并且在色谱分离过程中具有相同或者相近的保留时间，从而在随后的质谱分析中同时碎裂，所形成的碎片离子具有一定的质量差；通过比较不同样品中碎片离子的质谱信号强度，实现不同样品中多肽和蛋白质的定量(Koehler CJ，ArntzenMO，Treumann A，Thiede B，Anal.Bioanal.Chem.，2012，404(4)，1103-1114)，所述标记方法利用稳定同位素标记形成的具有较高特异性的成对碎片离子进行定量，具有较好的定量准确度；然而，所述标记方法造成了多肽质谱图复杂度的成倍增加，不利于多肽的鉴定。目前的蛋白质鉴定算法，只以肽段的一种稳定同位素标记形式形成的碎片离子来计算候选肽段的得分值，而将另一种稳定同位素标记形式形成的碎片离子作为干扰离子，这样会降低候选肽段的得分值，严重影响多肽和蛋白质的鉴定效率。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法，所述鉴定方法对多肽两端进行同位素标记后的蛋白质酶解产物，在使用液相色谱-质谱联用进行分离和检测后，在使用数据库搜索的方法进行鉴定时，通过构建包含两种标记形成的肽段的所有碎片离子的肽段理论谱图，并与实验质谱图进行匹配，实现对多肽的鉴定，进而鉴定得到蛋白质，提高了多肽和蛋白质鉴定的效率，可用于已知数据库蛋白质样品的高效鉴定。
为实现本发明的目的，采用如下技术方案。
一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法，所述方法步骤如下：
(1)对蛋白质进行如下处理：变性后，对其中含有的二硫键进行还原，然后用烷基化试剂封闭自由巯基；对处理后的蛋白质采用胞内蛋白酶赖氨酸-C进行酶切，形成多肽；
其中，优选蛋白质的变性方式为热变性或尿素变性；
优选使用二硫苏糖醇(DTT)对二硫键进行还原；
优选封闭自由巯基的烷基化试剂为碘代乙酰胺、碘乙酸、甲基甲烷巯基磺酸和N-乙基马来酰亚胺中的一种以上。
优选胞内蛋白酶赖氨酸-C的用量为蛋白质质量的1％～10％。
优选使用10mM DTT对蛋白质变性，变性时间为1h～2h；然后加入烷基化试剂，在黑暗中放置1h对蛋白质进行烷基化，得到处理后的蛋白质；
优选在使用尿素变性时，用pH值为7.5的50mM磷酸钠将处理后的蛋白质中的尿素浓度稀释到0.8M；
优选加入胞内蛋白酶赖氨酸-C后在37℃下孵育过夜进行酶切。
(2)使用化学/代谢标记的方法对多肽N端的α-氨基和C端赖氨酸侧链氨基分别进行标记；为了实现多肽碎片离子的分辨以及多肽母离子的同时碎裂，在进行标记时，将多肽分成等量的两份，分别使用含有不同轻重同位素的标记试剂进行标记，一份多肽中的N端采用含有轻同位素的标记试剂进行标记、C端采用含有重同位素的标记试剂进行标记，另一份多肽中的N端采用含有重同位素的标记试剂进行标记、C端采用含有轻同位素的标记试剂进行标记，标记完成的两份多肽间轻重同位素标记的相同肽段的分子量相差0Da～-0.1Da；
其中，化学标记使用的标记试剂为与氨基发生反应的化学试剂，如碳链长度为1～10的醛、碳链长度为1～10的酸、碳链长度为1～10的酸酐、碳链长度为1～10的酰氯和碳链长度为1～10的酯中的一种以上；
优选进行化学标记时，将多肽溶解于缓冲溶液中得到多肽溶液，浓度为0.01mg/mL～10mg/mL，缓冲溶液pH值为5.0～9.0；将标记试剂溶解于缓冲溶液或者有机溶剂中，再与多肽溶液混合，标记试剂与多肽的摩尔比为5:1～200:1，化学标记反应时间为10min～2h，化学标记反应温度为4℃～90℃；
进行代谢标记时，通过在细胞培养液中加入含有不同轻重同位素的赖氨酸和/或精氨酸，并且使含有待鉴定蛋白质的细胞在所述培养液中传代6次～8次，以实现完全的同位素标记。
所述不同轻重同位素为：12C、13C、14N、15N、H或氘。
(3)将标记后的两份多肽混合，使用一维或者二维液相色谱-质谱联用进行分离和鉴定，获得肽段质荷比信息；在进行PD,Pfind以及Mascot数据库搜索和肽段匹配时，根据同位素标记引起的N端轻标和重标b离子以及C端轻标和重标y离子与实验质谱图匹配程度计算候选肽段的得分值，进行多肽和蛋白质鉴定。
具体地说，将两份等重标记的多肽混合后，进行一维或者二维液相色谱-质谱联用得到质谱数据后，首先对所述数据库中的蛋白质进行理论酶解，将酶解产生的肽段按照分子量大小排列，构成理论酶解肽段数据库；对多肽二级质谱图，首先根据其母离子的质荷比和电荷数计算分子质量，然后从理论酶解肽段数据库中选择分子量与其接近的肽段作为候选肽段库；对候选肽段库中的每一条肽段，根据其氨基酸序列构建理论N端和C端碎片离子质谱图；在构建所述理论质谱图时，根据标记方法引起的多肽质量变化，计算两种标记形式所形成的肽段的所有碎片离子，即轻标和重标N端离子以及轻标和重标C端离子的质荷比；将每一条候选肽段的理论质谱图与实验质谱图进行比较，根据理质谱图与实验质谱图的匹配度计算候选肽段的得分值，并根据得分值高低选择匹配程度最大的候选肽段作为鉴定结果；
对质谱采集到的每一条肽段的质谱图进行同样的操作，从而实现对所有多肽和蛋白质的鉴定。
有益效果
本发明提供了一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法，所述鉴定方法可以应用于等重标记的已知数据库中存在的蛋白质样品的高效鉴定，通过对等重的两份多肽样品两端氨基进行同位素标记，在质谱中碎裂后形成成对的b离子和y离子；在基于数据库搜索的方法进行蛋白质鉴定时，构建包含两种标记形成的肽段的所有碎片离子(轻标和重标N端离子以及轻标和重标C端离子)的肽段理论谱图，可以充分利用实验质谱图中的碎片离子信息，与只以肽段的一种标记形式形成的碎片离子来计算肽段得分值的蛋白质鉴定算法相比，可以将多肽和蛋白质的鉴定效率提高20％～50％。
附图说明
图1为本发明中多肽两端标记实验的反应原理示意图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明提供的方法进行详述，但不以任何形式限制本发明。
实施例1
(1)对蛋白质进行如下处理：将100μg牛血清白蛋白溶于1mL浓度为8M的尿素中；然后加入100μL浓度为10mM的二硫苏糖醇，在56℃水浴中放置2h；再加入100μL浓度为20mM的碘代乙酰胺，在黑暗中放置1h，得到处理后的蛋白质；用pH值为7.5的50mM磷酸钠将处理后的蛋白质中的尿素浓度稀释到0.8M，然后加入胞内蛋白酶赖氨酸-C，牛血清白蛋白与胞内蛋白酶赖氨酸-C的质量比为25:1，在37℃下孵育过夜酶切，得到多肽。
(2)将步骤(1)获得的多肽分成两等份，第一份多肽用C18预柱除盐后，N端采用含有H的甲醛溶液进行标记，具体为：将5μL浓度为0.6M的氰基硼氢化钠和55μL体积分数为4％的甲醛溶液混合溶解在1mL体积分数为1％，pH值为2.8的醋酸溶液中，然后与多肽混合进行标记；使用1mL过量体积浓度为0.1％的甲酸除去标记试剂，使用5mL浓度为50mM，pH值为7.5的磷酸钠溶液对预柱进行平衡后，对多肽的C端赖氨酸侧链ε氨基使用含有体积分数为4％氘代甲醛和60mM氰基硼氢化钠的50mM磷酸钠缓冲溶液(pH 7.5)进行标记和还原。
对于第二份多肽，使用与第一份多肽同样的标记方法进行二甲基化标记。不同之处是对多肽N端使用含有体积分数为4％氘代甲醛和60mM氰基硼氢化钠的1mL体积分数为1％的醋酸溶液进行标记，对C端赖氨酸侧链ε氨基使用含有体积分数为4％的甲醛和60mM氰基硼氢化钠的1mL浓度为50mM的磷酸钠溶液进行标记。
所述标记过程中，对多肽N端的标记时间为10min，对多肽C端的标记时间为20min。
将标记后的多肽使用体积分数为80％的乙腈溶液洗脱后，真空蒸干。
步骤(1)和(2)的原理如图1所示。
(3)将蒸干的两份多肽混合得到混合样品，使用Triple-TOF 5600plus质谱(ABSCIEX,USA)和nano UPLC系统(Eskigent,USA)联用进行分离和分析；
其中，反相高效液相色谱nano UPLC系统中：
流动相A由体积分数为97.9％水、体积分数为2％的乙腈和体积分数为0.1％的甲酸溶液混合形成；流动相B由体积分数为97.9％的乙腈、体积分数为2％的水和体积分数为0.1％的甲酸溶液混合形成；在流速为500nL/min的100％的A流动相下，将混合样品上样到预柱(75μm i.d.×5cm)上，然后被洗脱到分析柱(75μm i.d.×20cm)上；流速设为300nL/min，流动相梯度为：在0min～45min为体积分数为5％～22％的流动相B，在45min～60min为体积分数22％～体积分数35％的流动相B，在60min～65min为体积分数35％～80％的流动相B；使用体积分数为80％的流动相B冲洗柱子5min后，使用体积分数为98％的流动相A平衡15min。
质谱Triple-TOF 5600plus中：
喷雾电压为2.6kV；一级质谱的扫描范围为350Da～1250Da，电荷数从+2～+5，cps>80，累积时间0.25s；后面跟随60个二级质谱，扫描范围从100Da～1500Da，累积时间为0.04s。
表1为多肽中一个肽段HLNDDVVK二甲基化等重标记后形成的轻标和重标b和y离子质荷比检测结果，其中表头表示各肽段对应的b1、b2至b7至y7、y6至y1离子，*表示无。因b1离子即为带电荷的整条肽段，此时不存在y离子，y1与此道理相同。
表1
# H(1/*) L(2/7) N(3/6) D(4/5) D(5/4) V(6/3) V(7/2) K(*/1)
b+(轻) 166.1 279.2 393.2 508.3 623.3 722.4 821.4 *
y+(重) * 834.5 721.4 607.3 492.3 377.3 278.2 179.2
b+(重) 170.1 283.2 397.2 512.3 627.3 726.4 825.4 *
y+(轻) * 830.5 717.4 603.3 488.3 373.3 274.2 175.2
在基于数据库搜索的方法进行质谱鉴定时，将蛋白质数据库中的蛋白质进行理论酶解，产生理论肽段库。对每条候选肽段，构建包含两种标记形式的肽段在质谱中碎裂所形成的N端和C断碎片离子的理论质谱图(见表1)，并与实验质谱图进行比较，选择匹配程度最好的候选肽，实现对多肽和蛋白质的鉴定，鉴定到了36条肽段，序列覆盖率92％。
实施例2
(1)对蛋白质进行如下处理：
1)蛋白质C端代谢标记
分别使用含有不同轻重同位素的赖氨酸的细胞培养液对HeLa细胞进行培养。一种细胞培养液含有带有13C标记的赖氨酸，另一种细胞液含有12C标记的赖氨酸；将HeLa细胞传代8次，以保证12C和13C标记完全。
2)对1)获得的轻、重同位素标记的HeLa细胞分别提取蛋白质；将轻、重同位素标记的HeLa细胞蛋白质各取100μg，分别进行如下操作：溶于1mL浓度为8M的尿素中，加入100μL浓度为10mM二硫苏糖醇，在56℃水浴中放置1h，然后加入100μL浓度为20mM的碘代乙酰胺，在黑暗中放置0.5小时，得到处理后的蛋白质，用pH值为7.5的50mM磷酸钠将处理后的蛋白质中的尿素浓度稀释到0.8M，然后加入胞内蛋白酶赖氨酸-C，HeLa细胞蛋白与胞内蛋白酶赖氨酸-C的质量比为25:1，在37℃下孵育过夜酶切，得到C端带有不同轻重同位素标记的两份多肽。
(2)对其中一份13C标记的多肽的N端，采用含有H的甲醛溶液进行标记，具体为：将5μL浓度为0.6M的氰基硼氢化钠和55μL体积分数为4％的甲醛溶液混合溶解在1mL体积分数为1％，pH值为2.8的醋酸溶液中，然后与多肽混合进行标记；
对于另一份12C标记的多肽的N端，使用与13C标记的多肽同样的标记方法进行二甲基化标记。不同之处是对多肽N端使用含有体积分数为4％氘代甲醛和浓度为60mM氘代氰基硼氢化钠的2mL体积分数为1％的醋酸溶液进行标记。
所述化学标记过程中，对N端的标记时间为10min。
标记后的多肽使用体积分数为80％的乙腈溶液洗脱后，真空蒸干。
(3)将蒸干的两份多肽混合得到混合样品，使用Triple-TOF 5600plus质谱(ABSCIEX,USA)和nano UPLC系统(Eskigent,USA)联用进行分离和分析；
其中，反相高效液相色谱nano UPLC系统中：
流动相A由体积分数为97.9％水、体积分数为2％的乙腈和体积分数为0.1％的甲酸溶液混合形成；流动相B由体积分数为97.9％的乙腈、体积分数为2％的水和体积分数为0.1％的甲酸溶液混合形成；在流速为500nL/min的100％的A流动相下，将混合样品上样到预柱(75μm i.d.×5cm)上，然后被洗脱到分析柱(75μm i.d.×20cm)上；流速设为300nL/min，流动相梯度为：在0min～45min为体积分数为5％～22％的流动相B，在45min～60min为体积分数22％～体积分数35％的流动相B，在60min～65min为体积分数35％～80％的流动相B；使用体积分数为80％的流动相B冲洗柱子5min后，使用体积分数为98％的流动相A平衡15min。
质谱Triple-TOF 5600plus中：
喷雾电压为2.6kV；一级质谱的扫描范围为350Da～1250Da，电荷数从+2～+5，cps>80，累积时间0.25s；后面跟随60个二级质谱，扫描范围从100Da～1500Da，累积时间为0.04s。
在基于数据库搜索的方法进行质谱鉴定时，将蛋白质数据库中的蛋白质进行理论酶解，产生理论肽段库。对每条候选肽段，构建包含两种标记形式的肽段在质谱中碎裂所形成的N端和C断碎片离子的理论质谱图，并与实验质谱图进行比较，选择匹配程度最好的候选肽，实现对多肽和蛋白质的鉴定。
实施例3
(1)对蛋白质进行如下处理：将100μg酵母提取蛋白溶于1mL浓度为8M的尿素中；然后加入100μL浓度为10mM的二硫苏糖醇，在56℃水浴中放置2h；再加入100μL浓度为20mM的N-乙基马来酰亚胺，在黑暗中放置10min，得到处理后的蛋白质；用pH值为7.5的50mM磷酸钠将处理后的蛋白质中的尿素浓度稀释到0.8M，然后加入胞内蛋白酶赖氨酸-C，酵母提取蛋白与胞内蛋白酶赖氨酸-C的质量比为25:1，在37℃下孵育过夜酶切，得到多肽。
(2)将步骤(1)获得的多肽分成两等份，第一份多肽用C18预柱除盐后，N端采用含有H的丁二酸酐进行标记，具体为：将100μL浓度为0.1M的丁二酸酐溶液溶解在1mL浓度为50mM，pH值为7.0的磷酸溶液中，然后与多肽混合进行标记；使用5mL浓度为50mM，pH值为7.5的磷酸钠溶液对预柱进行平衡后，对多肽的C端赖氨酸侧链ε氨基使用含有体积分数为4％氘代甲醛和60mM氰基硼氢化钠的50mM磷酸钠缓冲溶液(pH 7.5)进行标记和还原。
对于第二份多肽，使用与第一份多肽同样的标记方法进行二甲基化标记。不同之处是对多肽N端使用含有体积分数为4％氘代甲醛和60mM氰基硼氢化钠的50mM磷酸钠缓冲溶液(pH 7.5)进行标记，对C端赖氨酸侧链ε氨基使用含有体积分数为4％的甲醛和60mM氰基硼氢化钠的1mL浓度为50mM的磷酸钠溶液进行标记。
所述标记过程中，对多肽N端的标记时间为30min，对多肽C端的标记时间为20min。
将标记后的多肽使用体积分数为80％的乙腈溶液洗脱后，真空蒸干。
(3)将蒸干的两份多肽混合得到混合样品，使用Triple-TOF 5600plus质谱(ABSCIEX,USA)和nano UPLC系统(Eskigent,USA)联用进行分离和分析；
其中，反相高效液相色谱nano UPLC系统中：
流动相A由体积分数为97.9％水、体积分数为2％的乙腈和体积分数为0.1％的甲酸溶液混合形成；流动相B由体积分数为97.9％的乙腈、体积分数为2％的水和体积分数为0.1％的甲酸溶液混合形成；在流速为500nL/min的100％的A流动相下，将混合样品上样到预柱(75μm i.d.×5cm)上，然后被洗脱到分析柱(75μm i.d.×20cm)上；流速设为300nL/min，流动相梯度为：在0min～45min为体积分数为5％～22％的流动相B，在45min～60min为体积分数22％～体积分数35％的流动相B，在60min～65min为体积分数35％～80％的流动相B；使用体积分数为80％的流动相B冲洗柱子5min后，使用体积分数为98％的流动相A平衡15min。
质谱Triple-TOF 5600plus中：
喷雾电压为2.6kV；一级质谱的扫描范围为350Da～1250Da，电荷数从+2～+5，cps>80，累积时间0.25s；后面跟随60个二级质谱，扫描范围从100Da～1500Da，累积时间为0.04s。
在基于数据库搜索的方法进行质谱鉴定时，将蛋白质数据库中的蛋白质进行理论酶解，产生理论肽段库。对每条候选肽段，构建包含两种标记形式的肽段在质谱中碎裂所形成的N端和C断碎片离子的理论质谱图，并与实验质谱图进行比较，选择匹配程度最好的候选肽，实现对多肽和蛋白质的高效率鉴定，共鉴定到了18000条肽段和2600个蛋白。

Claims (10)

1.一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法，其特征在于：所述方法步骤如下：
(1)对蛋白质进行如下处理：变性后，对其中含有的二硫键进行还原，然后用烷基化试剂封闭自由巯基；对处理后的蛋白质采用胞内蛋白酶赖氨酸-C进行酶切，形成多肽；
(2)使用化学/代谢标记对多肽N端的α-氨基和C端赖氨酸侧链氨基分别进行标记；在进行标记时，将多肽分成等量的两份，一份多肽中的N端采用含有轻同位素的标记试剂进行标记、C端采用含有重同位素的标记试剂进行标记，另一份多肽中的N端采用含有重同位素的标记试剂进行标记、C端采用含有轻同位素的标记试剂进行标记，标记完成的两份多肽间轻重同位素标记的相同肽段的分子量相差0Da～-0.1Da；
化学标记使用的标记试剂为与氨基发生反应的化学试剂；
进行代谢标记时，通过在细胞培养液中加入含有不同轻重同位素的赖氨酸和/或精氨酸，并且使含有待鉴定蛋白质的细胞在所述培养液中传代6次～8次；
所述不同轻重同位素为：12C、13C、14N、15N、H或氘；
(3)将标记后的两份多肽混合，使用一维或者二维液相色谱-质谱联用进行分离和鉴定，获得肽段质荷比信息；在进行PD,Pfind以及Mascot数据库搜索和肽段匹配时，根据同位素标记引起的N端轻标和重标b离子以及C端轻标和重标y离子与实验质谱图匹配程度计算候选肽段的得分值，进行多肽和蛋白质鉴定；对质谱采集到的每一条肽段的质谱图进行同样的操作，从而实现对蛋白质的鉴定。
2.根据权利要求1所述的一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中蛋白质的变性方式为热变性或尿素变性；使用二硫苏糖醇对二硫键进行还原；封闭自由巯基的烷基化试剂为碘代乙酰胺、碘乙酸、甲基甲烷巯基磺酸和N-乙基马来酰亚胺中的一种以上。
3.根据权利要求1所述的一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中胞内蛋白酶赖氨酸-C的用量为蛋白质质量的1％～10％。
4.根据权利要求1所述的一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中使用10mM的二硫苏糖醇使蛋白质变性，变性时间为1h～2h；然后加入烷基化试剂，在黑暗中放置1h对蛋白质进行烷基化，得到处理后的蛋白质。
5.根据权利要求2所述的一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中胞内蛋白酶赖氨酸-C的用量为蛋白质质量的1％～10％；使用10mM的二硫苏糖醇使蛋白质变性，变性时间为1h～2h；然后加入烷基化试剂，在黑暗中放置1h对蛋白质进行烷基化，得到处理后的蛋白质；加入胞内蛋白酶赖氨酸-C后在37℃下孵育过夜进行酶切。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法，其特征在于：使用尿素变性时，用pH值为7.5的50mM磷酸钠将处理后的蛋白质中的尿素浓度稀释到0.8M。
7.根据权利要求1所述的一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法，其特征在于：步骤(2)中化学标记使用的标记试剂为碳链长度为1～10的醛、碳链长度为1～10的酸、碳链长度为1～10的酸酐、碳链长度为1～10的酰氯和碳链长度为1～10的酯中的一种以上。
8.根据权利要求1所述的一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法，其特征在于：步骤(2)中进行化学标记时，将多肽溶解于缓冲溶液中得到多肽溶液，浓度为0.01mg/mL～10mg/mL，缓冲溶液pH值为5.0～9.0；将标记试剂溶解于缓冲溶液或者有机溶剂中，再与多肽溶液混合，标记试剂与多肽的摩尔比为5:1～200:1，化学标记反应时间为10min～2h，化学标记反应温度为4℃～90℃。
9.根据权利要求7所述的一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法，其特征在于：步骤(2)中进行化学标记时，将多肽溶解于缓冲溶液中得到多肽溶液，浓度为0.01mg/mL～10mg/mL，缓冲溶液pH值为5.0～9.0；将标记试剂溶解于缓冲溶液或者有机溶剂中，再与多肽溶液混合，标记试剂与多肽的摩尔比为5:1～200:1，化学标记反应时间为10min～2h，化学标记反应温度为4℃～90℃。
10.根据权利要求1所述的一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法，其特征在于：步骤(3)中将两份等重标记的多肽混合后，进行一维或者二维液相色谱-质谱联用得到质谱数据后，首先对所述数据库中的蛋白质进行理论酶解，将酶解产生的肽段按照分子量大小排列，构成理论酶解肽段数据库；对多肽二级质谱图，首先根据其母离子的质荷比和电荷数计算分子质量，然后从理论酶解肽段数据库中选择分子量与其接近的肽段作为候选肽段库；对候选肽段库中的每一条肽段，根据其氨基酸序列构建理论N端和C端碎片离子质谱图；在构建所述理论质谱图时，根据标记方法引起的多肽质量变化，计算两种标记形式所形成的肽段的所有碎片离子，即轻标和重标N端离子以及轻标和重标C端离子的质荷比；将每一条候选肽段的理论质谱图与实验质谱图进行比较，根据理质谱图与实验质谱图的匹配度计算候选肽段的得分值，并根据得分值高低选择匹配程度最大的候选肽段作为鉴定结果。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107563148A (zh) * 2017-08-16 2018-01-09 中国科学院计算技术研究所 一种基于离子索引的整体蛋白质鉴定方法与系统
CN110286153A (zh) * 2019-05-25 2019-09-27 江苏食品药品职业技术学院 一种基于同位素示踪法检测多肽药物的方法
CN110349621A (zh) * 2019-06-04 2019-10-18 中国科学院计算技术研究所 肽段-谱图匹配可信度检验方法、系统、存储介质及装置
CN110596261A (zh) * 2019-08-14 2019-12-20 中国农业科学院蜜蜂研究所 利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中中蜂mrjp1蛋白含量的方法
CN111208299A (zh) * 2018-11-21 2020-05-29 中国科学院大连化学物理研究所 一种交联肽段定性定量分析方法
CN112986570A (zh) * 2019-12-02 2021-06-18 中国科学院大连化学物理研究所 基于肽段两末端准等重双标记用于氨基酸序列测定方法
CN114639445A (zh) * 2022-02-18 2022-06-17 五邑大学 一种基于贝叶斯评价和序列搜库的多肽组学鉴定方法及其应用
CN114705796A (zh) * 2022-04-01 2022-07-05 杭州纽安津生物科技有限公司 免疫肽的鉴定方法、终端设备和可读存储介质

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104076098A (zh) * 2013-03-29 2014-10-01 中国科学院大连化学物理研究所 等重二甲基化标记蛋白质定量方法
CN105301119A (zh) * 2014-07-15 2016-02-03 中国科学院大连化学物理研究所 基于两端非等重标记的蛋白质氨基酸序列从头测序方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104076098A (zh) * 2013-03-29 2014-10-01 中国科学院大连化学物理研究所 等重二甲基化标记蛋白质定量方法
CN105301119A (zh) * 2014-07-15 2016-02-03 中国科学院大连化学物理研究所 基于两端非等重标记的蛋白质氨基酸序列从头测序方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HONGQIANG QIN ET AL.: "Isobaric cross-sequence labeling of peptides by using site-selective N-terminus dimethylation", 《CHEMCOMM》 *
SHEN ZHANG ET AL.: "A paired ions scoring algorithm based on Morpheus for simultaneous identification and quantification of proteome samples prepared by isobaric peptide termini labeling strategies", 《PROTEOMICS》 *
单一初 等: "基于成对碎片离子打分和等重多肽末端标记的蛋白质组同时定性和定量新算法", 《中国化学会首届全国质谱分析学术研讨会会议论文集》 *
朱金蕾 等: "基于质谱技术蛋白质定量方法的研究进展", 《分析化学》 *
王丽蒙 等: "终端等重同位素标记串级质谱定量技术：高通量、高准确度的肿瘤标志物筛查新方法", 《科学通报》 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107563148A (zh) * 2017-08-16 2018-01-09 中国科学院计算技术研究所 一种基于离子索引的整体蛋白质鉴定方法与系统
CN107563148B (zh) * 2017-08-16 2020-06-05 中国科学院计算技术研究所 一种基于离子索引的整体蛋白质鉴定方法与系统
CN111208299A (zh) * 2018-11-21 2020-05-29 中国科学院大连化学物理研究所 一种交联肽段定性定量分析方法
CN111208299B (zh) * 2018-11-21 2021-05-28 中国科学院大连化学物理研究所 一种交联肽段定性定量分析方法
CN110286153A (zh) * 2019-05-25 2019-09-27 江苏食品药品职业技术学院 一种基于同位素示踪法检测多肽药物的方法
CN110349621B (zh) * 2019-06-04 2021-08-27 中国科学院计算技术研究所 肽段-谱图匹配可信度检验方法、系统、存储介质及装置
CN110349621A (zh) * 2019-06-04 2019-10-18 中国科学院计算技术研究所 肽段-谱图匹配可信度检验方法、系统、存储介质及装置
CN110596261A (zh) * 2019-08-14 2019-12-20 中国农业科学院蜜蜂研究所 利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中中蜂mrjp1蛋白含量的方法
CN112986570A (zh) * 2019-12-02 2021-06-18 中国科学院大连化学物理研究所 基于肽段两末端准等重双标记用于氨基酸序列测定方法
CN112986570B (zh) * 2019-12-02 2022-08-30 中国科学院大连化学物理研究所 基于肽段两末端准等重双标记用于氨基酸序列测定方法
CN114639445A (zh) * 2022-02-18 2022-06-17 五邑大学 一种基于贝叶斯评价和序列搜库的多肽组学鉴定方法及其应用
CN114639445B (zh) * 2022-02-18 2023-09-19 五邑大学 一种基于贝叶斯评价和序列搜库的多肽组学鉴定方法
CN114705796A (zh) * 2022-04-01 2022-07-05 杭州纽安津生物科技有限公司 免疫肽的鉴定方法、终端设备和可读存储介质
CN114705796B (zh) * 2022-04-01 2023-11-07 杭州纽安津生物科技有限公司 免疫肽的鉴定方法、终端设备和可读存储介质

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