CN105301119A - 基于两端非等重标记的蛋白质氨基酸序列从头测序方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于多肽两端非等重稳定同位素标记的蛋白质氨基酸序列从头测序方法。以胞内蛋白酶赖氨酸-C对变性还原烷基化后的蛋白质进行酶切，形成含有N端α-氨基和C端赖氨酸侧链ε-氨基的肽段。样品分成两份后，使用含有不同同位素的标记试剂对多肽N端α-氨基进行选择性衍生；再使用含有不同同位素的标记试剂对多肽C端赖氨酸ε-氨基进行衍生或者在培养细胞时，使用含有同位素标记赖氨酸的培养液来实现对蛋白质中赖氨酸的标记。最后，将样品混合，使用高效液相色谱-质谱进行分离和鉴定。本发明通过标记形成成对存在的多肽碎片离子而加以分辨，降低干扰信号的影响，提高碎片离子选择特异性和多肽测序准确度；提高从头测序的速度。

Description

基于两端非等重标记的蛋白质氨基酸序列从头测序方法

技术领域

本发明涉及标记辅助的蛋白质氨基酸序列从头测序方法，具体地说是一种通过对多肽的N端和C端分别进行稳定同位素标记以鉴别碎片离子的蛋白质氨基酸序列从头测序方法。

背景技术

蛋白质是重要的生物大分子，在生命活动中发挥着重要作用。对蛋白质进行测序对于蛋白质一级结构的分析至关重要。尽管目前有些物种存在蛋白质数据库，可以用搜库的方法对蛋白质氨基酸序列进行分析。但是，大多数物种仍然没有可供检索的蛋白质数据库，并且对于已经存在数据库的物种，由于基因变异也会导致其蛋白质氨基酸序列发生变化。因此，非常有必要发展不依赖于数据库的蛋白质氨基酸序列从头测序方法。文献报道中对蛋白质氨基酸序列进行从头测序的方法主要有以下几种：(1)通过对多肽的N端，使用带有酸性基团的试剂进行衍生，然后使用MALDI质谱进行分析，使得多肽碎片片段基本不含有a、b离子，主要以y离子形式存在，从而可以对y离子进行鉴别，实现对多肽的从头测序；(2)通过对多肽的N端，使用带有碱性基团的试剂进行衍生，然后使用MALDI质谱进行分析，使得多肽碎片片段基本不含有y离子，主要以a或者b离子形式存在，从而可以对其进行鉴别，实现对多肽的从头测序。

多肽两端稳定同位素标记方法是蛋白质组学中一种常用的定量方法，通过在多肽N端和C端分别进行稳定同位素标记，实现两个或者多个样品中的肽段质量相同或者相近，并且在色谱分离过程中具有相同或者相近的保留时间，从而在随后的质谱分析中同时碎裂，所形成的碎片离子具有一定的质量差；通过比较不同样品中碎片离子的质谱信号强度，实现不同样品中多肽和蛋白质的定量(KoehlerCJ，ArntzenMO，TreumannA，ThiedeB，Anal.Bioanal.Chem.，2012，404(4)，1103-1114)。如前所述，目前的蛋白质氨基酸序列从头测序方法，主要通过对一个样品的多肽一端或者两端进行衍生，使多肽在碎裂时主要产生一个系列的碎片离子，从而简化离子碎片种类，进行从头测序。但是，由于多肽的碎裂机理比较复杂，即使对多肽进行前述处理，多肽在碎裂时仍然会产生其它碎片离子，因此特异性不高，影响从头测序的准确性；此外，随着氨基酸序列长度的增加，较大的碎片离子其产生的几率和强度都会降低，不利于从头测序。为此，我们通过将同一个样品分成两份，分别对其中的多肽两端进行稳定同位素标记，通过在质谱分析时形成的成对碎片离子，提高碎片离子辨别的准确度；通过对多肽的两端进行不同的标记，使得多肽的b离子和y离子对质量差异不同，而分辨b离子和y离子；利用b离子和y离子的互补性，实现对长序列多肽的准确从头测序。

发明内容

蛋白质氨基酸序列从头测序比较困难，由于多肽碎裂机理复杂，造成质谱图的复杂性和难以准确分辨碎片离子。同位素标记被广泛应用于蛋白质定量，通过对不同样品进行不同同位素标记，混合后样品在一级谱或者二级谱存在质量差异，从而可以被分辨，并利用一级谱或者二级谱的峰面积或者强度进行定量。本发明的目的是利用对多肽两端进行同位素标记，实现对多肽b和y系列碎片离子的鉴别，提高从头测序的准确度和速度。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

对蛋白质进行变性，还原和烷基化后，使用胞内蛋白酶赖氨酸-C对其进行酶解；酶解产物分成两份后，使用含有不同轻重同位素的标记试剂对其N端氨基和C端赖氨酸进行标记，使两份样品中多肽的分子量差异不大于2Da，并且其质谱中b离子及y离子的质量差异均大于4Da；对标记后的肽段，混合后使用液相色谱-质谱联用进行分析。分析时通过适当扩大碎裂窗口宽度，实现对不同标记肽段的同时碎裂。根据产生的碎片离子对质量差来鉴别b离子和y离子，从而实现对多肽的从头测序。

所述蛋白质氨基酸序列的从头测序方法，具体步骤如下：

(1)蛋白质样品的预处理：对蛋白质采用热变性或者尿素变性，时间为1-2小时；使用10mMDTT对蛋白质变性的同时进行还原；变形和还原完成后，加入碘代乙酰胺在黑暗中放置1小时，对蛋白质进行烷基化。然后将溶液用50mM磷酸钠(pH7.5)将尿素浓度稀释到0.8M，按照底物/酶比25/1(w:w)加入胞内蛋白酶赖氨酸-C，在37℃下孵育过夜。

(2)多肽两端非等重标记：将蛋白质酶解产物分成两份，一份用含有轻同位素的标记试剂对多肽N端氨基进行衍生，通过控制反应溶液的pH值保证衍生的选择性，然后用含有重同位素的标记试剂对多肽C端氨基酸侧链氨基进行衍生或者在培养细胞时，通过加入含有重同位素赖氨酸的培养液实现对赖氨酸的标记；对另一份样品，用含有重同位素的标记试剂对多肽N端氨基进行衍生，通过控制反应溶液的pH值保证衍生的选择性，然后用含有轻同位素的标记试剂对多肽C端氨基酸侧链氨基进行衍生或者在培养细胞时，通过加入含有轻同位素赖氨酸的培养液实现对赖氨酸的标记。

在进行同位素标记时，多肽N端被元素相同但同位素不同标记试剂标记后的质量差异大于或者等于4Da，以防止多肽碎裂形成碎片时同位素的干扰；同样，多肽C端赖氨酸被不同标记试剂标记后，由于标记引起的质量变化之差异大于或者等于4Da，以防止多肽碎裂形成碎片时同位素的干扰。

(3)标记多肽的质谱分析：将不同标记的多肽样品按照1:1的比例混合后，使用反相高效液相色谱进行分离，电喷雾质谱进行鉴定。为了保证不同标记的肽段同时碎裂，将碎裂窗口宽度设为4Da。

发明的蛋白质氨基酸序列从头测序方法可以应用于未知序列蛋白质的准确和快速测序。

本发明具有如下优点：

1.本发明对蛋白质酶解多肽的两端氨基进行标记，反应效率和选择性高。

2.本发明通过将蛋白质多肽样品分成两份，对其两端氨基进行不同同位素标记，使得两份样品中多肽的质量差不超过2Da，在质谱分析中同时被碎裂，形成的二级碎片离子其b离子和y离子均以成对形式存在，利于被分辨，提高了碎片离子鉴定的特异性，有利于准确的从头测序。

3.本发明通过对两份多肽样品两端氨基进行不同同位素标记，在质谱中碎裂后形成的b离子对之间的质量差和y离子对之间的质量差不同，从而可以分辨b和y系列碎片离子，有利于准确的从头测序。

附图说明

图1为蛋白质多肽两端甲基化标记实验流程图；

图2为使用液相色谱-质谱对甲基化标记的多肽进行分析获得的二级质谱图；

图3为蛋白质多肽C端代谢标记和N端的丁二酸酐标记实验流程图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明提供的方法进行详述，但不以任何形式限制本发明。

实施例1

1.基于二甲基化标记的蛋白质酶解多肽两端标记

如图1所示，按如下流程进行标记：

1)蛋白质样品的变性、还原、烷基化和酶解：将100微克蛋白质溶于1毫升8M尿素中，加入100微升10mM二硫苏糖醇，在56℃水浴中放置2小时，然后加入100微升20mM碘代乙酰胺在黑暗中放置1小时。最后将溶液用50mM磷酸钠(pH7.5)将尿素浓度稀释到0.8M，然后按照底物/酶比25/1(w:w)加入胞内蛋白酶赖氨酸-C，在37℃下孵育过夜。

2)多肽两端二甲基化标记：将1)获得的多肽样品分成两等份，

第一份上柱(C18预柱)除盐后，使用甲醛溶液(5μL0.6M氰基硼氢化钠和55μL甲醛(4％,v:v)溶解在1mL1％醋酸中,pH2.8中)对多肽N端进行标记。使用1毫升过量0.1％甲酸除去标记试剂和使用5毫升50mM磷酸钠(pH7.5)溶液对预柱进行平衡后，对多肽的C端赖氨酸侧链ε氨基使用含有4％氘代甲醛和60mM氰基硼氢化钠的50mM磷酸钠缓冲溶液(pH7.5)进行标记和还原。

对于第二份样品，使用同样的标记方法进行二甲基化标记。不同之处是对多肽N端使用含有4％氘代甲醛和60mM氘代氰基硼氢化钠的1mL1％醋酸溶液进行标记，对C端赖氨酸侧链ε氨基使用含有4％氘代甲醛和60mM氰基硼氢化钠的1毫升50mM磷酸钠溶液进行标记。对N端的标记时间为10分钟，而对C端的标记时间为20分钟。

标记后的多肽使用80％乙腈溶液洗脱后，使用真空蒸干。

3)标记多肽的质谱分析：标记后的两份样品混合后，使用Triple-TOF5600plus质谱(ABSCIEX,USA)和nanoUPLC系统(Eskigent,USA)进行分离和分析。流动相A和B(V/V)分别为97.9％水/2％乙腈/0.1％甲酸及97.9％乙腈/2％水/0.1％甲酸。在流速为500nL/min的100％A流动相下，上样到预柱(75μmi.d.×5cm)上，然后被洗脱到分析柱(75μmi.d.×20cm)上。流速设为300nL/min，流动相梯度为：在0到45分钟内从5％到22％B，在45-60分钟内从22％B到35％B，在60-65分钟内从35％B到80％B。在使用80％的流动相B冲洗柱子5分钟后，使用98％的流动相A平衡15分钟。

Triple-TOF5600plus的喷雾电压设为2.6kV。一级质谱扫描范围为350到1250Da(电荷数从+2到+5，cps>80，累积时间0.25s)，后面跟随60个二级扫描(扫描范围从100到1500Da，累积时间为0.04s)。分离窗口设为4Da，获得的多肽二级质谱图如图2所示。获得的原始二级质谱图(图2(a))中含有很多碎片离子，难以分辨出b和y离子。根据多肽两端标记形成的碎片离子对之间的质量差异(b离子相差4.0251Da，y离子质量差异为6.0318Da),可以分辨出b离子(图2(b))和y离子(图2(c))；分辨出的b，y离子使得质谱图大大简化，根据不同离子间的质量差异可以推导出多肽的序列(如图2(b)和图2(c)所示)。

实施例2

基于代谢标记和化学标记的蛋白质酶解多肽两端标记

该实施例中采取了不同的多肽两端标记方法，对于多肽的分离和鉴定方法与上例相同。

1.细胞培养和代谢标记：对于Hela细胞，使用含有10％胎牛血清的DMEM进行培养。为了对赖氨酸进行标记，使用不含有L-赖氨酸的DMEM以及透析过的胎牛血清。“轻”培养液中加入L-赖氨酸(146μg/ml)，“重”培养液中含有同样浓度的[¹³C]L-赖氨酸。

2.蛋白质提取和预处理：细胞收集后，溶解在含有8M尿素和蛋白酶抑制剂的缓冲溶液中。裂解液进行三次超声后，离心收集上清液。轻标和重标的蛋白质使用10mM二硫苏糖醇进行还原，在50mM碳酸氢钠溶液中和56℃下还原1小时,然后在黑暗中室温下使用含有55mM碘代乙酰胺的50mM碳酸氢钠溶液烷基化45分钟-1小时。

3.蛋白质酶解：按照50:1(w/w)的底物/酶比例，使用胞内蛋白酶赖氨酸-C在37℃下在50mM碳酸氢钠溶液中(pH7.5)对轻重标记的蛋白质分别过夜酶解。

4.多肽N端标记：首先对前述轻重标记的多肽C端赖氨酸侧链氨基进行胍基化。在1ml溶液中加入40μL含有2MO-甲基异脲的100mM碳酸氢钠溶液，用2M氢氧化钠溶液调节pH值至11，在37℃下反应2小时。然后通过加入10％的三氟乙酸终止反应，并将溶液pH调节到8.0。按照实施例1中的方法对重代谢标记的肽段使用甲醛进行甲基化，对轻代谢标记的多肽使用氘代甲醛进行甲基化。反应后的样品按照1:1比例混合后进行液相色谱-质谱分析。

本发明通过标记形成成对存在的多肽碎片离子而加以分辨，可以有效降低干扰信号的影响，提高碎片离子选择的特异性和多肽测序的准确度；同时通过标记引起b，y碎片离子对不同的质量差异，实现对b，y离子的分辨，简化了蛋白质氨基酸序列从头测序算法，提高了从头测序的速度。

Claims (8)

1.基于两端非等重标记的蛋白质氨基酸序列从头测序方法，其特征在于：对蛋白质进行变性后，对其中含有的二硫键进行还原，然后用烷基化试剂封闭自由巯基；对处理后的蛋白质采用胞内蛋白酶赖氨酸-C进行酶切；酶切后形成的多肽，使用化学/代谢标记的方法对多肽N端的α-氨基和C端赖氨酸侧链氨基分别进行标记；在进行标记时，将样品分成等量的两份，分别使用含有不同同位素的轻重标记试剂进行标记，使一份样品中的多肽N端采用轻标记试剂进行标记、多肽C端采用重标记试剂进行标记，使另一份样品中的多肽N端采用重标记试剂进行标记、多肽C端采用轻标记试剂进行标记，且使得二份样品间轻重标记的相同肽段的分子量相差不超过2Da；将标记后的二份样品混合，使用一维或者二维液相色谱-质谱联用进行分离和鉴定；在质谱鉴定时，将分离窗口设置为2-8Da，使得不同标记的多肽同时碎裂；根据同位素标记引起的多肽碎片离子质量差异鉴别b(N端)，y(C端)离子，进行蛋白质氨基酸序列从头测序分析。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

蛋白质的变性方式包括：热变性或尿素变性；

使用二硫苏糖醇对二硫键进行还原；

封闭自由巯基的烷基化试剂包括：碘代乙酰胺、碘乙酸、甲基甲烷巯基磺酸或N-乙基马来酰亚胺。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：用胞内蛋白酶赖氨酸-C进行酶切，其中胞内蛋白酶赖氨酸-C的用量为蛋白质质量的1％至10％。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：对蛋白质酶解多肽的两端标记，包括化学标记和/或代谢标记；

化学标记法包括任何可以与氨基发生反应的化学试剂；醛，酸，酸酐，酰氯，酯中的一种；

代谢标记法包括同位素(¹²C及¹³C，、¹⁴N及¹⁵N，或H及氘)标记的赖氨酸，通过在细胞培养液中加入标记的赖氨酸，从而产生赖氨酸被标记的蛋白质。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：对标记后的肽段，使用电喷雾质谱进行检测；为了使不同标记的多肽能够同时碎裂，将二级碎裂窗口设为3-4Da，即母离子质荷比左右各3-4Da的母离子被同时碎裂。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：为了实现多肽碎片离子的分辨以及多肽母离子的同时碎裂，对于分成两等份的样品，一份样品用含有轻同位素的标记试剂对其N端进行标记，使用含有重同位素的标记试剂对其C端赖氨酸进行标记；对于另一份样品，则使用含有重同位素的标记试剂对其N端进行标记，使用含有轻同位素的标记试剂对其C端赖氨酸进行标记；

同位素标记试剂指含有不同轻重同位素(如¹²C及¹³C、¹⁴N及¹⁵N，或H及氘)的标记试剂。

7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：根据同位素标记引起的两份样品中多肽碎片b(N端)离子质量差异MD_b，从多肽二级谱图中挑选成对存在且质量差异为MD_b的b(N端)离子，根据同位素标记引起的两份样品中多肽碎片y(C端)离子质量差异MD_y，从多肽二级谱图中挑选成对存在且质量差异为MD_y的y(C端)离子，根据不同碎片离子之间的质量差异判断存在的氨基酸种类，进行蛋白质氨基酸序列从头测序分析。

8.按照权利要求1所述的从头测序方法，可用于快速准确的未知序列蛋白质测序和鉴定。