CN108088945A - 基于二甲基化多重标记及特征碎片离子的绝对定量方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多样品多靶标的高通量精确蛋白质组绝对定量方法。它是利用二甲基化反应标记肽段的N末端和赖氨酸氨基,通过二甲基化标记试剂各种同位素形式有机组合实现待测蛋白和/或肽段样品及已知量目标内标物中的蛋白和/或肽段的多重标记。标记后的样品使用液质联用系统进行分析,提取样品和内标物的二级谱中特征碎片离子峰面积进行定量,得到待测样品目标蛋白的绝对量。该方法分析通量高、大大节约分析时间、标记试剂廉价,实际应用性强、定量准确度高,精密度好,动态范围宽,满足基于内标物的多样品分析或基于标准曲线的多靶标分析的需求。
Description
技术领域
本发明涉及一种多重标记的绝对定量方法,可实现多蛋白质或肽段的多样品及相应标准曲线的同时定量,实现多样品多靶标的精确绝对定量。该发明具有方法简单廉价,标记效率高,定量准确度高、精密度好,动态范围宽,绝对定量通量高,免除绝对定量方法优化步骤,适用样品种类宽,方法实用性强等优点。对大样品量的蛋白质组绝对定量分析有显著优势。
背景技术
蛋白质的含量变化与生物体的生命过程息息相关,研究蛋白质的绝对量在了解蛋白质在相互作用网络中的功能、帮助临床疾病的诊断和治疗中有无可取代的作用。对于目标蛋白的绝对定量,采用目标型的质谱方法已经成为实现高重现性、高灵敏度的绝对定量的金标准。
在目标物的绝对定量方法中,传统的选择离子监测(SRM)、多反应监测(MRM)技术已经得到了广泛的应用,但母子离子对选择和方法构建过程限制了SRM/MRM方法的通用性。近年来发展的平行反应监测(PRM)技术可以同时采集一条肽段的全部碎片离子,有效的降低了方法建立的复杂性,同时也实现同时定性定量。但两种方法的通量都不高,难以高通量的验证蛋白浓度。为了提高分析样品的通量,有研究利用化学标记策略增加分析通量,如利用iTRAQ(Nat.Commun.2015,6,5924)、iDiLeu(J.Am.Soc.Mass Spectrom.2015,26,107.)等标记试剂标记,二甲基化标记(Anal.Chem.2012,84,4999.),中子编码赖氨酸标记(Anal.Chem.2016,88,3295.)。但上述方法存在标记多重度限制或对质谱分辨率要求较高等不足。
发明内容
本发明发展了一种基于二甲基化多重标记及特征碎片离子的蛋白质组绝对定量方法,并发展了相应的质谱采集策略。通过上述方法,不仅能够增加同时分析样品的通量,还能够通过绘制标准曲线提高绝对定量的准确度。
为了实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
1、合成目标蛋白和/或肽段的内标物,方法适用于现有绝对定量所用内标物,内标物种类包括肽段、肽段串联体蛋白和蛋白质。内标物获取方法兼容化学合成、细胞培养和无细胞培养。
2、待测蛋白质样品与目标蛋白和/或肽段的内标物经过变性还原烷基化后,按照一定的酶/蛋白比例加入酶,孵育过夜。
3、对待测样品及内标物酶解所得的肽段进行二甲基化标记,控制条件pH值为7.5~12,标记时间0.5~12h。
4、重复上述步骤,根据实验设计将其他待测样品和已知量目标内标物进行不同同位素组合的二甲基化多重标记,上述多重标记方法中,八重标记试剂选择为:
1-plex:CH2O+NaBH3CN(Dim28);
2-plex:13CH2O+NaBH3CN(Dim30L);
3-plex:CH2O+NaBD3CN(Dim30H);
4-plex:13CH2O+NaBD3CN(Dim32L);
5-plex:CD2O+NaBH3CN(Dim32H);
6-plex:13CD2O+NaBH3CN(Dim34L);
7-plex:CD2O+NaBD3CN(Dim34H);
8-plex:13CD2O+NaBD3CN(Dim36)。
5、按照实验设计将多重标记样品混合,进行后续的液质分析。液质联用中的质谱仪包括静电场轨道阱(Orbitrap)、飞行时间管(TOF)以及傅立叶变换离子回旋共振质量分析器(FT-ICR)。
6、进行谱图库的构建,利用数据依赖采集模式(DDA)鉴定到目标蛋白候选肽段的m/z、保留时间、序列等谱图库信息,并作为目标型采集的目标物列表。
7、采集目标肽段的定量信息,质谱的采集模式采用平行反应监测(PRM)或多反应监测(MRM),根据选择多重标记的通量设置相应PRM、MRM采集肽段的质荷比或母子离子对,再根据实际测量样品的复杂程度选择多重累积平行反应监测(MSX-PRM)模式或放大母离子碎裂窗口的平行反应监测模式。
8、提取目标肽段的二级谱定量特征离子的提取离子色谱图,特征离子采用具有同位素标记的a、b、y碎片离子强度或者自身强度增强的a1离子。比较同一肽段不同标记的峰面积,利用目标内标物的峰面积确定待测样品中该肽段的绝对量,进而实现待测物中该蛋白的绝对定量。
本发明具有如下优点:
1、本方法是一种高通量的绝对定量方法,最大满足八个样品的同时分析。方法大大提高了样品分析通量,节约了质谱机时。同时,绝对定量的多重待测样品与内标物在一次质谱运行中同时分析,避免了多次液质分析因仪器稳定性、背景干扰等因素造成的绝对定量误差,提高了绝对定量的准确度。
2、本方法标记试剂价格低廉,反应条件温和,反应速度快,标记效率高(99%以上),一步标记步骤简单,实际应用性强。
3、标记策略在肽段水平上实现,方便绝对定量标准蛋白的制备,与现有绝对定量所用内标物都能够兼容,内标物种类包括肽段、肽段串联体蛋白和蛋白质,内标物获取方法兼容化学合成、细胞培养和无细胞培养。
4、本方法不仅适用于多重样品的同时绝对定量分析,也适用于通过绘制内标曲线,提高绝对定量准确度的策略。
5、使用二甲基化标记策略,二级谱a1离子明显增强,增加了定量准确度。
6、本方法采用PRM相关的采集策略,并利用二级谱特征碎片离子峰面积进行定量分析,定量准确度、精密度高,定量动态范围宽。
7、标记方法中引入质量亏损的标记思路,有效地降低了二级谱图复杂程度,利于二级谱鉴定。
8、本方法采用PRM相关的采集策略,免除了SRM/MRM等策略绝对定量方法优化步骤。
附图说明
图1二甲基化多重标记策略及质谱方法原理示意图;
图2标准蛋白浓度范围及标准曲线示意图;
图3 ADHPFLFCIK肽段多重标记MS质谱图;
图4 ADHPFLFCIK肽段多重标记MS/MS质谱a1离子图。
具体实施方式
实施例1
1.蛋白质酶解
将卵清蛋白、β-酪蛋白、溶菌酶C、细胞色素C、肌红蛋白、转铁蛋白、牛血清白蛋白这七种标准蛋白及E.coli提取蛋白样品分别溶于8M尿素溶液中,加入二硫苏糖醇至终浓度为10mM,56℃变性还原1小时,加入碘乙酰胺至终浓度为20mM,避光反应30min,再将尿素稀释10倍,按照1:50(酶/蛋白,w/w)加入胰蛋白酶,37℃酶解过夜。用C18捕集柱除盐蒸干,用水复溶。
2.肽段二甲基化标记
对每个样品酶解得到的肽段分别进行六重二甲基化标记(Dim30L、Dim30H、Dim32L、Dim32H、Dim34L、Dim34H),具体标记方法如下:
第一重标记:配置标记试剂在1mL pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中加入50μL体积浓度4%13CH2O、50μL质量浓度0.6M NaBH3CN,加入酶解后的肽段溶液,室温标记1h。
第二重标记:与第一重相同的标记方法,标记试剂替换为在1mL pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中加入50μL体积浓度4%CH2O、50μL质量浓度0.6M NaBD3CN。
第三重标记:与第一重相同的标记方法,标记试剂替换为在1mL pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中加入50μL体积浓度4%13CH2O、50μL质量浓度0.6M NaBD3CN。
第四重标记:与第一重相同的标记方法,标记试剂替换为在1mL pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中加入50μL体积浓度4%CD2O、50μL质量浓度0.6M NaBH3CN。
第五重标记:与第一重相同的标记方法,标记试剂替换为在1mL pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中加入50μL体积浓度4%13CD2O、50μL质量浓度0.6M NaBH3CN。
第六重标记:与第一重相同的标记方法,标记试剂替换为在1mL pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中加入50μL体积浓度4%CD2O、50μL质量浓度0.6M NaBD3CN。
用冷冻蒸干仪干燥每重样品后用A相(含体积浓度2%ACN和体积浓度0.1%FA的水溶液)复溶至质量浓度0.5mg/mL。将样品按相应的比例混合,待质谱分析。
3.LC-MS分析
液相色谱条件:流动相,缓冲液A相(含体积浓度2%ACN和体积浓度0.1%FA的水溶液),缓冲液B相(含体积浓度98%ACN和体积浓度0.1%FA的水溶液),样品分离梯度为0到3min,为从0%B到5%B的线性梯度分离,然后进行60min从5%B到22%B的线性梯度分离,再进行8min从22%到35%B的线性梯度分离,流速为300nL/min。
制作目标肽段列表所用DDA模式质谱条件:每个目标蛋白选择Dim32L标记的样品,将7种目标蛋白与E.coli背景干扰按质量比1:1混合。使用Q Exactive,采用DDA模式,FullMS分辨率为70000(m/z=200),质量范围350-1800m/z,最大离子注入时间为100ms,AGC为1e6;MS/MS选择最强的12个离子进行碎裂,动态排除10.0s,碎裂模式为HCD,归一化碰撞能量为28%,分离窗口2.0Da,MS2起始分子量为50.0Da。MS/MS分辨率为17500(m/z=200),最大离子注入时间为50ms,AGC为1e5。三次平行进样。
根据鉴定结果筛选出相应的目标蛋白候选肽段,计算得到相应的同位素多重标记肽段m/z,建立PRM采集列表。
用于绝对定量强度提取的PRM模式质谱条件:将待测样品使用Q Exactive,采用PRM模式,Full MS分辨率为70000(m/z=200),质量范围350-1800m/z,最大离子注入时间为100ms,AGC为1e6;MS/MS加入相应目标肽段m/z及保留时间列表,碎裂模式为HCD,归一化碰撞能量为28%,分离窗口1.0m/z,MSX count为3,MS2起始分子量为50.0Da。MS/MS分辨率为35000(m/z=200),最大离子注入时间为45ms,AGC为3e6。三次平行进样。
4.数据分析
DDA模式数据处理:质谱采集的原始文件使用MaxQuant(v1.5.1.0)软件包,并使用Andromeda作为搜库引擎进行数据库搜索。固定修饰:Carbamidomethyl(C),可变修饰:Acetyl(Protein N-term);Oxidation(M),N-term和K分别为二甲基化32L标记修饰。蛋白质数据库下载于http://www.uniprot.org/,为E.coli K12与7种标准蛋白的组合数据库。一级谱质量容差4.5ppm,二级谱质量容差20ppm,蛋白质酶为trypsin,允许两个漏切位点,肽段和蛋白质的FDR<0.1%。得到目标肽段的m/z、保留时间范围和序列信息、蛋白归属。
PRM模式绝对定量数据处理:利用Skyline软件分析,导入MaxQuant鉴定结果作为谱图库,筛选trypsin酶切,最多2个漏切位点,肽段长度6-30个氨基酸,修饰包含固定修饰:Carbamidomethyl(C),Dimethyl32NL(N-term),Dimethyl32KL(K);可变修饰:Oxidation(M),多重标记分别设置N-term和K上的质量差。使用a1离子作为定量离子。保留时间窗口为10min。提取结果利用mProphet打分,选择Q值小于0.01的结果用于定量。待测肽段的峰面积与内标肽段峰面积相比,即可得到该肽段的绝对浓度。用于定量同一条蛋白的肽段定量结果取平均值作为该蛋白的定量结果。三次重复实验,将所有结果合并到一起,相同的蛋白质取平均数,作为蛋白质的最终定量结果。
方法评价:
1、首先评价方法的可行性和定量准确度。将7种标准蛋白分别进行六重二甲基化标记,然后按照1:2:4:8:12:16的浓度混合作为目标物内标物,逐级稀释成不同浓度范围(如图2所示)测试方法,再按E.coli与卵清蛋白1:1的量加入背景干扰。如图3、图4所示,无论从一级谱还是二级谱,肽段的强度都与混合的比例一致,可见该方法定量结果与理论值相符,能够实现高准确度的定量分析。
2、该方法具有定量动态范围宽、灵敏度高的优势。在测试样品中,该方法可以定量到绝对量最低的牛血清白蛋白,灵敏度可以达到1fmol(5ppm)。
实施例2
利用本方案中五重标记绘制内标曲线,利用其余三重标记实现三份样品的同时绝对定量分析。即对目标蛋白标准品进行五重标记,再根据待测样品中相应蛋白绝对量范围稀释相应目标蛋白标准品,利用五重标记配制内标曲线。加入经过其余三重标记的三份待测样品配制定量分析样品,其他过程同实施例1,进行绝对定量分析。
实施例3
利用本方案加入一重标记的内标,实现七份样品的同时绝对定量分析。即对目标蛋白标准品进行一重标记,再根据待测样品中相应蛋白绝对量范围稀释相应目标蛋白标准品,利用其余七重标记方法标记七份待测样品,其他过程同实施例1,进行多样品的绝对定量分析。
实施例4
质谱的采集方法采用放大窗口的PRM策略,选择二甲基化32L标记样品对应的m/z作为目标列表肽段,放大母离子碎裂窗口至5m/z,其他过程同实施例1或2或3。
实施例5
质谱的采集方法采用常规的PRM策略,目标列表肽段为所有标记肽段,不使用MSX策略,其他过程同实施例1或2或3。
实施例6
选择Dim28、Dim30L、Dim32L、Dim34L、Dim36五重标记方法标记待测样品和内标物,MS/MS中MSX count为5,分辨率为17500(m/z=200)。选择a,b,y离子作为用于定量的碎片离子,其他过程同实施例1。
该方法的优势在于:是一种多样品多靶标的精确绝对定量方法,满足八重样品的同时分析,标记试剂廉价,实际应用性强,定量准确度高,动态范围宽,与现有绝对定量技术兼容性好,实验方法简单,大大提高定量分析的通量,节约分析时间。
Claims (10)
1.基于二甲基化多重标记及特征碎片离子的绝对定量方法,其特征在于:
对1份以上的待测蛋白和/或肽段样品及已知量目标内标物中的蛋白和/或肽段分别采用不同的二甲基化试剂进行分别标记,即可得到物理化学性质相同而相对分子量不同的一组同位素标记的蛋白和/或肽段,再将所得的蛋白和/或肽段混合进行质谱检测;利用液质联用系统进行质谱数据采集,提取样品和内标物的二级谱中相应的特征碎片离子峰强度进行比较,由内标物中已知量目标蛋白和/或肽段的绝对量得到样品中目标蛋白和/或肽段的绝对定量,进而实现多样品多靶标的高通量目标蛋白或肽段的绝对定量。
2.按照权利要求1所述的绝对定量方法,其特征在于:多重标记通过二甲基化标记试剂甲醛、氰基硼氢化钠及其相应同位素的组合实现,能够实现最高7个待测样品的同时定量分析,标记所用不同二甲基化试剂分别为下述中的2个及以上:
1-plex:CH2O+NaBH3CN;2-plex:13CH2O+NaBH3CN;
3-plex:CH2O+NaBD3CN;4-plex:13CH2O+NaBD3CN;
5-plex:CD2O+NaBH3CN;6-plex:13CD2O+NaBH3CN;
7-plex:CD2O+NaBD3CN;8-plex:13CD2O+NaBD3CN。
3.按照权利要求1所述的绝对定量方法,其特征在于:质谱采集模式可选用多反应监测(MRM)或平行反应监测(PRM),根据实际测量样品的复杂程度及所选择多重标记通量选择常用的多反应监测(MRM)或平行反应监测(PRM)、多重累积平行反应监测(MSX-PRM)或放大母离子碎裂窗口的平行反应监测中的至少一种。
4.按照权利要求1所述的绝对定量方法,其特征在于:用于提取离子强度进行比较的碎片离子位于二级质谱图中,采用具有同位素标记的a、b、y碎片离子或者自身强度增加的a1离子中的一种作为定量的特征碎片离子。
5.按照权利要求1所述的定量方法,其特征在于:待测样品为含有蛋白质和/或肽段待测物的样品,包括细胞、生物组织、生物体液、微生物、食品、生物环境污染物或动物排泄物;含有蛋白质和/或肽段待测物的样品需经过蛋白酶酶切,所用蛋白酶为适用于待测物的样品中所有酶切位点的蛋白酶中的一种或二种以上。
6.按照权利要求1所述的定量方法,其特征在于:定量方法适用于目标蛋白质的绝对定量或目标肽段(包含具有翻译后修饰的肽段)的绝对定量。
7.按照权利要求1所述的定量方法,其特征在于:多重定量方法适用于多样品分析或基于标准曲线的目标物分析中的一者,或者二者组合使用。
8.按照权利要求7所述的多重定量方法,其特征在于:
多样品分析即为利用一重标记方法标记已知量目标内标物,其余2-7重标记分别标记2-7个待测样品;
基于标准曲线的目标物绝对定量即为利用2-7重标记分别标记所有目标内标物的2-7个已知浓度梯度,生成MS分析的标准曲线,用其余一重标记方法标记待测样品。
9.按照权利要求1、7或8所述的定量方法,其特征在于:定量方法适用于包括两重、三重、四重、五重、六重或七重待测样品的同时定量分析,也适用于基于标准曲线的多样品同时定量分析。
10.按照权利要求1所述的定量方法,其特征在于:所述的液质联用系统中的质谱仪包括静电场轨道阱(Orbitrap)、飞行时间管(TOF)、三重四级杆(QQQ)或傅立叶变换离子回旋共振质量分析器(FT-ICR)。
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