CN109142737A - 一种基于二甲基化标记dia策略的蛋白质定量方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于标记的DIA定量方法。它是利用二甲基化反应标记肽段，通过二甲基化标记试剂各种同位素形式有机组合实现肽段样品的多重标记，利用数据非依赖(DIA)采集模式采集数据，提取每重标记相应的DIA数据中多条母离子和子离子的提取离子色谱图，利用提取到的峰面积进行蛋白质的多重定量分析。该方法的优势在于：定量准确度高，重现性好，标记效率高，方法简单，对液质系统重现性要求较低，易于进行样品多维分离，蛋白质组定量分析的通量高。本发明通过标记提高DIA策略的定量准确度及通量，在大样本蛋白质组分析中具有明显的优势。

Description

一种基于二甲基化标记DIA策略的蛋白质定量方法

技术领域

本发明涉及一种基于标记的DIA定量方法，通过标记提高DIA策略的定量准确度及通量。该方法具有定量准确度高，重现性好，标记效率高，方法简单，对液质系统重现性要求较低，易于进行样品多维分离，蛋白质组定量分析的通量高等优点。在大样本蛋白质组分析中具有明显的优势。

背景技术

近些年，生物学、精准医学越来越多的需要蛋白质组学数据，其大样品量对蛋白质组方法的重现性和通量提出了越来越高的要求。常规的数据依赖采集模式下，母离子采集的随机性会造成肽段鉴定的重现性差。因此，近年来，数据非依赖(DIA)的采集模式已经得到了广泛的关注。它的主要优势在于可以实现信息的无损采集，且数据之间具有很高的重现性。但是相应的问题就是二级谱图是大量肽段共碎裂的混合谱图，给后续数据分析提出了更高的难度。目前常用的DIA数据处理采取的策略是类似于MRM的母子离子对提取的策略。但由于每张DIA二级谱中碎片离子数众多，故影响定量准确度，因此提高DIA数据分析准确性具有重要意义和挑战。此外，目前常见的定量方法是基于无标记的策略(Mol.Cell.Proteomics 2012,11,O111 016717.)，标记策略目前仅有基于NeuCoDIA的标记技术(Anal Chem.2015,87,2570.)，但目前通量普遍较低。

发明内容

本发明发展了一种基于二甲基化标记DIA策略的蛋白质定量方法，利用二甲基化反应标记肽段，通过二甲基化标记试剂各种同位素形式有机组合实现肽段样品的多重标记。采用数据非依赖(DIA)采集模式提取相应的母子离子对的提取离子色谱图，实现高通量、高重现性的精确蛋白质组定量。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

1、蛋白质样品经过变性还原烷基化后，按照一定的酶/蛋白比例加入蛋白酶，包括胰蛋白酶、Lys-C酶、Lys-N酶、Glu-C酶、Arg-C酶、Asp-N酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、蛋白酶K的一种或多种，孵育过夜。

2、对待测样品酶解所得肽段分别进行不同同位素标记的二甲基化反应。碱性条件控制pH值为7.5～12，标记时间0.5～12h。

3、对进行相对定量分析的大样本或者基于内标物的绝对定量分析的待测样品和内标物进行多重标记，五重标记试剂选择为：

1-plex：CH₂O+NaBH₃CN(Dim28)；

2-plex：CH₂O+NaBD₃CN(Dim30)；

3-plex：¹³CH₂O+NaBD₃CN(Dim32)；

4-plex：¹³CD₂O+NaBH₃CN(Dim34)；

5-plex：¹³CD₂O+NaBD₃CN(Dim36)。

4、将多重标记样品混合。如分析样品复杂度高，兼容蛋白质组中的二维分离策略。

5、进行后续的液质分析。液质联用中的质谱仪包括静电场轨道阱(Orbitrap)、飞行时间管(TOF)以及傅立叶变换离子回旋共振质量分析器(FT-ICR)。

6、利用DDA模式采集用于鉴定并作为目标提取的肽段信息。利用DIA模式采集数据用于提取定量信息。DIA采集模式包括SWATH、可变窗口SWATH、MSX-DIA、MS^E。

7、对DDA数据进行鉴定，导入软件中进行DIA数据的提取、定量分析。用于谱峰提取的离子包括母离子、特征碎片离子a,b,y,c,z,x离子，提取多条碎片离子的提取离子色谱图(XIC)用于峰面积比较定量。

本发明具有如下优点：

1、定量准确度高，重现性好，动态范围宽。

2、同位素内标的引入有利于DIA数据色谱峰的准确提取、定量结果相关性过滤，提高DIA数据定量准确度。

3、同位素内标的引入避免多样品多次质谱重复间保留时间漂移校正、不同背景干扰影响碎裂的情况，提高DIA数据定量准确度。

4、标记方法效率高，标记试剂价格低廉，步骤简单，实用性强。

5、标记方法对二维分离重现性要求降低，与常见二维分离模式兼容性好，增加了定量覆盖度和定量准确度。

6、同时能够实现五重蛋白质样品的定量分析，提高蛋白质定量分析的通量。

7、适用于大样本量的蛋白质组分析。

附图说明

图1基于二甲基化标记DIA策略定量原理示意图；

图2肽段水平定量结果的boxplot图(左)和histogram图(右)；

图3蛋白水平定量结果的boxplot图(左)和histogram图(右)。

具体实施方式

实施例1

1.蛋白质提取及样品预处理

将E.coli样品用1×PBS清洗三次。用8M尿素+0.1％的蛋白酶抑制剂(cocktail,Sigma-Aldrich,MO)作为裂解液悬浮细胞株。用组织破碎仪在10000的转速下将细胞株超声破碎100s。细胞提取液用25000g离心取上清后，用丙酮沉淀，弃去上清后，蒸干。用8M尿素复溶后用Bradford法测定蛋白浓度。于-20℃保存待用。

1mg E.coli提取蛋白液用2μL 1M DTT 56℃变性还原1h，加入4μL 1M IAA，避光反应40min。然后用50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)将尿素稀释至1M。按照1:50(酶/蛋白，质量比)向Ecoli中加入胰蛋白酶，于37℃酶解过夜。用C18捕集柱除盐蒸干备用。

2.肽段二甲基化标记

E.coli酶解产物分别用CH₂O+NaCNBH₃和¹³CH₂O+NaCNBD₃进行二甲基化标记。标记条件为100μg肽段溶解于500μL 50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中，加入20μL 4％CH₂O及其同位素试剂，20μL 0.6M NaCNBH₃及其同位素试剂。用C18捕集柱除盐蒸干，用A相(含体积浓度2％ACN和体积浓度0.1％FA的水溶液)复溶。用于SWATH采集的样品为轻重标记的E.coli按照质量比H/L＝1:1混合。将所有样品于-20℃保存待用。

3.LC-MS分析

液相色谱条件：流动相，缓冲液A相(含体积浓度2％ACN和体积浓度0.1％FA的水溶液)，缓冲液B相(含体积浓度98％ACN和体积浓度0.1％FA的水溶液),分离梯度为(时间/B相浓度)0min/0％-0.5min/8％-65min/24％-90min/35％-99min/35％-100min/55％-110min/90％，流速为300nL/min。

Library谱图库建立质谱条件：E.coli二甲基化28标记样品采用AB Triple TOF5600+质谱仪(AB SCIEX，Framingham，MA，USA)进行DDA模式数据采集。Full MS采集范围为350-1300m/z，累积时间250ms；MS/MS条件为：采集范围为100-2000，累积时间28ms，选择一级谱中前100强的肽段进行碎裂，动态排除时间为30s。得到126631张谱图。

SWATH定量数据建立条件：将1:1混合的轻重标记E.coli样品采用AB Triple TOF5600+质谱仪(AB SCIEX，Framingham，MA，USA)进行SWATH模式数据采集。Full MS采集范围为350-1250m/z，累积时间50ms；MS/MS条件为：采集范围为100-2000，累积时间90ms，隔离窗口25m/z+1m/z overlap，CES 15.上述每个样品平行进样三次。

4.数据分析

Library谱图库检索方式：用于建立Library谱图库的三针DDA数据使用ProteinPilot软件(AB SCIEX,Ontario,Canada)进行数据检索，用Iodoacetamide进行半胱氨酸烷基化修饰，trypsin进行酶切，加入可变修饰：Special Factors中加入Dimethyl Lysand Nterminal_light,ID focus中包括Biological modifications。数据库使用Swissprot E.coli(20130315),蛋白水平FDR>0.05。

Skyline软件数据处理：Library谱图库为上述Ecoli28-DDA三针鉴定汇总结果，且筛选trypsin酶切，最多2个漏切位点，肽段长度6-30个氨基酸，修饰包含固定修饰：Carbamidomethyl(C),Dimethyl28N(N-term),Dimethyl28K(K)；可变修饰：Oxidation(M),Ammonia-loss(N),Deamidated(NQR),Dehydrated(T),重标为在N-term和K上分别增加4.019Da(¹³C₂D₂-C₂H₂)。选择使用2,3,4价母离子，子离子使用a,b,y离子，使用强度最强的6个母子离子对。MS1中包含3个同位素峰，质量分析器为TOF，分辨率40,000；MS/MS中使用DIA方法，TOF的分辨率为25,000。保留时间窗口为10min。提取结果利用mProphet打分，选择Q值小于0.01的结果用于定量。利用提取的全部离子峰面积的比值作为定量分析结果。

方法评价：

1、1:1混合样品，肽段水平定量到6780条肽段，如图2所示，肽段水平中值取log2后为-0.1129，中值为0.9247；全部肽段中25％的肽段定量结果取log2后为-0.3673，比值为0.7752；全部肽段中75％的肽段定量结果取log2后为0.1498，比值为1.1094。log2值两者相差0.52。比值介于两倍区间的肽段共6192条，占91.3％。

2、1:1混合样品，蛋白水平定量到866条蛋白，如图3所示，蛋白水平中值取log2后为-0.1047，中值为0.9300；全部肽段中25％的肽段定量结果取log2后为-0.2515，比值为0.8400；全部肽段中75％的肽段定量结果取log2后为0.0704，比值为1.0500。log2值两者相差0.32。比值介于两倍区间的蛋白815条，占94.1％。可见该方法定量结果与理论值相符，精密度高。

实施例2

本策略适用于基于内标物的绝对定量分析，用一重标记方法标记目标蛋白内标物，另一重标记方法标记待测样品，其他过程同实施例1。根据目标蛋白两重标记之间相对定量的结果得到待测样品目标蛋白绝对值，进而实现基于DIA策略的目标蛋白绝对定量。该策略实现了高准确度的目标蛋白绝对定量。

实施例3

通过二甲基化五重标记，可以实现高通量的DIA定量。将五份进行相对定量比较的待测样品分别进行二甲基化标记，标记方法为：sample1：CH₂O+NaBH₃CN(Dim28)；sample2：CH₂O+NaBD₃CN(Dim30)；sample3：¹³CH₂O+NaBD₃CN(Dim32)；sample4：¹³CD₂O+NaBH₃CN(Dim34)；sample5：¹³CD₂O+NaBD₃CN(Dim36)。混合后进行DIA数据采集，其他过程同实施例1，分别提取五重标记的母子离子对(Dim28、Dim30、Dim32、Dim34、Dim36)进行比较，即实现了在一次实验中对5份样品同时DIA定量分析，获得了高准确度的大规模蛋白质组定量信息。

实施例4

对样品进行二维分离，在液质联用系统前引入反相色谱、强阳离子交换、强阴离子交换、亲水作用色谱、体积排阻色谱、等电聚焦、离子淌度分离等分离手段。在此采用反相色谱，将五重标记的样品(实施例3)混合后，通过15cm C18反向色谱柱进行分离，60min分离得到60个级分，等间隔合并成12个级分。将每个级分分别进样分析，最终将得到的36个raw文件合并，其他过程同实施例1，获得了更大规模的定量信息，且降低了定量干扰。

Claims (8)

1.一种基于二甲基化标记DIA策略的蛋白质定量方法，其特征在于：蛋白质样品经过变性、还原、烷基化后酶解，利用二甲基化反应标记肽段样品，通过不同同位素形式的2种二甲基化标记试剂组合分别标记肽段样品，实现肽段样品的多重标记，混合标记肽段样品使其在数据非依赖(DIA)采集模式中成组出现，提取每重标记相应的DIA数据中多条母离子和子离子的提取离子色谱图，利用提取到的峰面积进行蛋白质的多重定量分析。

2.按照权利要求1所述的定量方法，其特征在于：多重标记通过二甲基化标记试剂甲醛、氰基硼氢化钠及其相应同位素的组合实现，能够实现2-5个样品的同时定量分析，标记所用试剂分别为：

1-plex：CH₂O+NaBH₃CN(Dim28)；

2-plex：CH₂O+NaBD₃CN(Dim30)；

3-plex：¹³CH₂O+NaBD₃CN(Dim32)；

4-plex：¹³CD₂O+NaBH₃CN(Dim34)；

5-plex：¹³CD₂O+NaBD₃CN(Dim36)。

3.按照权利要求1所述的分析方法，其特征在于：DIA采集模式包括SWATH、可变窗口SWATH、MSX-DIA或MS^E。

4.按照权利要求1所述的定量方法，其特征在于：用于谱峰提取的离子包括母离子、特征碎片离子a,b,y,c,z,x离子，提取1条以上碎片离子的提取离子色谱图(XIC)用于峰面积比较定量。

5.按照权利要求1所述的定量方法，其特征在于：所述的液质联用中的质谱仪包括静电场轨道阱(Orbitrap)、飞行时间管(TOF)或傅立叶变换离子回旋共振质量分析器(FT-ICR)。

6.按照权利要求1所述的定量分析，其特征在于：定量方法适用于2-5个样本的相对定量分析，也适用于基于内标物的高通量绝对定量分析。

7.按照权利要求1所述的定量分析，其特征在于：该方法所用蛋白酶适用于包括胰蛋白酶、Lys-C酶、Lys-N酶、Glu-C酶、Arg-C酶、Asp-N酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、蛋白酶K的多种酶切位点的蛋白酶中的一种或两种以上。

8.按照权利要求1所述的定量分析，其特征在于：该方法兼容DIA样品前处理过程中进行的分级，适用于蛋白质组学中的二维分离策略。