CN113484449A - 一种高通量定量和定性分析蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高通量定量和定性分析蛋白质的方法，为同位素标记和数据非依赖采集两者结合高通量定量和定性分析蛋白质。采用本发明提供的方法定量分析蛋白质，结果准确；适用于分析各种样本类型(如血浆样本、组织样本)且无需细胞培养。本发明具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高通量定量和定性分析蛋白质的方法，尤其涉及结合同位素标记和数据非依赖采集的方法高通量定量和定性分析蛋白质。
背景技术
在蛋白质组学研究中，常用的质谱扫描方式有数据依赖采集(data-dependentacquisition，DDA)和数据非依赖采集(data-independent acquisition，DIA)两种模式。DIA结合了DDA和选择反应监测(Selected reaction monitoring，SRM)的特点，将整个扫描范围等分为若干窗口，每个窗口依次选择，碎裂，采集窗口内所有母离子的全部子离子的信息。所以，DIA能够获得扫描范围内所有母离子及二级子离子信息，不会造成低丰度离子信息的丢失，同时突破了高分辨质谱二级定量的通量限制。与DDA相比，DIA具有更好的重现性、更高的灵敏度和更少的缺失值，在定量蛋白质组学中具有良好的应用。因此，DIA特别适用于复杂临床样本(如血浆、脑脊液)的大规模分析，因为这些样本中含有大量动态变化的蛋白质。
随着定量蛋白质组学不断发展，高通量分析需求不断增加，尤其是临床样本的大规模分析。当前DIA数据在质谱采集时间上，通常为血液样本1针1小时，组织类样本1针2小时。除去仪器的维护时间，一天仅仅能分析10个血液样本或者5个组织样本。较低的分析通量大大限制了大规模队列研究的开展。提高蛋白分析的通量对大规模蛋白质组学分析的开展意义重大。
现有的提高DIA通量方法主要是基于质量亏损(NeuCode)的标签与DIA耦合，一次可以平行分析多个样品，从而提高通量。基于质量亏损的标签，主要包括体内标志和体外标志。2015年，Joshua研究者将Neucode SILAC技术与DIA技术耦合起来，即NeuCoDIA技术，具体原理为将质量相差36mDa的重标1和重标2赖氨酸以10：1的比例分别培养细胞，培养一段时间后，提取蛋白，用赖氨酸消化酶进行消化；LC-MS/MS检测时，进行DIA采集，分离窗口设置为27Th，因此相差36mDa的两个峰保证在同一个分离窗口，可以进行共分离和共碎裂。保证了同一个肽段的两个同位素峰产生的y离子同时出现在同一个MS2谱图，进而可以进行相对定量分析。2017年，鲁豪杰基于Neucode SILAC技术，通过对标签进行一定修改后，与DIA技术耦合，实现了4标通量，称为MdFDIA技术。MdFDIA技术的原理：赖氨酸重标和轻标分别培养细胞，然后用赖氨酸消化酶进行消化，得到的肽段再用甲醛进行二甲基化处理，由于甲醛分别用重标和轻标同位素进行标志，这样得到了4种不同质量的肽段，质量差为5.8mDa；进行DIA采集，分离窗口设置为27Th，因此相差5.8mDa的两个峰保证在同一个分离窗口；可以进行共分离和共碎裂；保证了同一个肽段的两个同位素峰产生的y离子同时出现在同一个MS2谱图，进而可以进行相对定量分析。NeuCoDIA技术和MdFDIA技术都是通过代谢途径(细胞培养)对肽段的赖氨酸进行标记来实现通量提升，对于不适合细胞培养的则不适用。同时，嵌入赖氨酸同位素的标记需要特定的Lys-c消化酶酶切产生含有赖氨酸残基的片段用于定量，这导致与胰蛋白酶酶切相比，鉴定的蛋白数量减少。
发明内容
本发明的目的是高通量定量和定性分析蛋白质。
本发明首先保护一种高通量分析蛋白质的方法，可包括如下步骤：
(1)分别提取若干目标样本的蛋白，之后酶解，获得酶解肽段；
(2)完成步骤(1)后，分别用质量数相差大于50Da的标签标记来自不同样本的肽段；
(3)将步骤(2)标记的肽段进行LC-MS/MS检测，采用DDA模式采集数据，构建DDA谱图数据库；
(4)将步骤(2)标记的肽段混合，得到混合肽段；将混合肽段和步骤(2)标记的肽段分别进行LC-MS/MS检测，采用DIA模式采集数据，获得DIA数据；
(5)将步骤(3)构建的DDA谱图数据库和步骤(4)获得的DIA数据进行定性和/或定量分析，通过标签区分来自不同样本的蛋白。
所述步骤(1)中，酶解可采用Trypsin酶和Lys-c酶进行。
所述步骤(1)中，所述目标样本的蛋白、Trypsin酶和Lys-c酶的比例可为400μg：(1.00-1.50)μg：(1.00-1.50)μg(如400:1:1、400:1.5:1.5、400:1.5:1或400:1:1.5)。
所述步骤(1)中，酶解参数可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)酶解10h以上。
所述步骤(1)中，酶解后还包括除盐、真空抽干的步骤，得到酶解肽段。
所述除盐可采用Strata X柱进行。
上述任一所述Trypsin酶具体可为华利世科技公司的产品，产品目录号为LotNo.20201219C。
上述任一所述Lys-C酶具体可为Cell Signaling Technology(CST)的产品，产品目录号为39003S。
所述步骤(2)中，标签可为iTRAQ、TMT或IBT。
在本发明的实施例中，所述标签可为TMT10plex-131标签或iTRAQ8plex-116标签。TMT10plex-131标签质量数为229Da，iTRAQ8plex-116标签质量数为304Da，两者质量数相差75Da。
所述步骤(3)中，DDA谱图数据库采用鉴定软件构建。所述鉴定软件可为maxquant或mascot。
所述步骤(3)中，采用DDA模式采集数据时，一级谱图采集时，保证来自不同样本的同一个肽段的母离子，落在不同的采集窗口中，不会互相干扰；二级谱图定量时，只选择标签标记的肽段进行定量，通过标签判断肽段来自哪个样本；二级碎裂后产生的离子，通过设置二级谱图扫描的起始m/z，通过m/z筛选实现不采集二级谱图上的报告离子。
所述步骤(3)具体可包括High pH RP分离、色谱分离和DDA建库检测。
所述High pH RP分离可为将步骤(2)标记的肽段稀释，之后采用液相系统进行液相分离，在一定波长下监测洗脱峰并收集一个组分，结合色谱洗脱峰图合并样品，每个样本得到若干组分，然后冷冻抽干。
所述色谱分离可为将抽干的肽段样品用流动相复溶，取上清进样，梯度分离。
所述DDA建库检测可为将各个组分经过液相分离后，通过nanoESI源离子化后进入到串联质谱仪进行DDA模式检测。在本发明的一个实施例中，主要参数设置为：离子源电压设置为1.9kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为120000，最大离子注入时间(MIT)为100ms；二级质谱碎裂模式为HCD，碎裂能量设置为NCE 28；分辨率设置为30000，最大离子注入时间(MIT)为100ms，动态排除时间设定为30s。二级质谱起始m/z固定为100；二级碎裂的母离子筛选条件为：电荷2+到6+，峰强度超过5E4的强度排在前20的母离子。AGC设置为：一级3E6，二级1E5。
在本发明的一个实施例中，从UniProt蛋白数据库中下载Homo_sapiens蛋白序列作为参考的蛋白数据库。使用Maxquant软件完成DDA数据的鉴定。
所述步骤(4)中，所述“将混合肽段和步骤(2)标记的肽段进行LC-MS/MS检测，采用DIA模式采集数据，获得DIA数据”可为将混合肽段和步骤(2)标记的肽段经过液相分离后，通过nanoESI源离子化后进入到串联质谱仪进行DIA模式检测。主要参数设置为：离子源电压设置为1.9kV；一级质谱扫描范围400～1250m/z；分辨率设置为120000；最大离子注入时间(MIT)为50ms；将400～1250m/z均分为45个窗口进行连续窗口碎裂及信号采集。离子碎裂模式为HCD，最大离子注入时间(MIT)选用自动模式，碎片离子在Orbitrap中进行检测，分辨率设置为30000，碎裂能量NCE采用分布式碎裂：22.5，25，27.5；AGC设置为1E6。
所述步骤(5)中，将步骤(3)构建的DDA谱图数据库和步骤(4)获得的DIA数据进行定性分析可为将DIA数据和DDA数据库导入Spectronaut软件或Skyline软件，进行定性分析。
所述步骤(5)中，将步骤(3)构建的DDA谱图数据库和步骤(4)获得的DIA数据进行定量分析可为利用R程序计算混合样本中每种标签对应样本的蛋白和肽段的定量信息。
上述任一所述的方法在PRM靶向蛋白采集中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述的方法在PRM靶向采集目标肽段的母离子中的应用也属于本发明的保护范围。
实验证明，本发明提供的方法可以高通量定量和定性分析目标样本中的蛋白质。本发明具有如下优点：(1)适用范围广，适用于各种样本类型(如血浆样本、组织样本)；(2)无需细胞培养；(3)准确定量分析蛋白质。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为iDIA技术原理图。
图2为实施例中iDIA技术流程图。
图3为实施例中iDIA技术定量效果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、iDIA技术的建立
本发明的发明人将同位素标记方法(iTRAQ、TMT、IBT)与DIA技术结合建立了iDIA技术，将传统DIA质谱上机一针采集一个样本转变为一针采集多个样本。设计原理如下：以提高两倍通量为例，例如labelA化学标签质量为m1，labelB标签质量为m2，两种标签的质量差为△m。分别标记两个不同的样本。在一级谱图中，来自不同样本的同一个肽段的母离子，由于他们的标记相差△m，电荷(charge)一般为2+至5+，它们的质荷比差(△m/z)为：△m/z＝△m/charge。DIA二级谱图采集时，设置每个分离窗口为x m/z，为了确保来自不同样本的相同肽段分布在不同的分离窗口，设计窗口原则为△m/z>x。这样可以避免定性、定量时来自其他样本的相同肽段产生相同碎片离子的干扰。进行二级碎裂时，通过优化质谱仪的一系列参数，带有标签的肽段会在任意一个键上进行断裂，在MS2水平上会产生带有标签的b离子和y离子，只选择带有标签的b离子和y离子进行后续的定性定量分析，可以得到对应母离子的肽段序列和定量信息。通过标签的类型可以判断肽段来自哪一个样本。
iDIA技术原理图见图1。
iDIA技术流程图见图2。
iDIA技术定量和定性分析蛋白质的步骤如下：
(1)提取目标样本的蛋白，然后用胰酶和Lys-c酶进行酶解，获得酶解肽段。
(2)分别用质量数相差大于50Da的标签标记来自不同样本的肽段。
(3)将标记后的肽段，分成两部分：一部分用于分组分，进行LC-MS/MS检测时，采用DDA模式采集数据，用鉴定软件(如maxquant、mascot)构建对应的DDA谱图数据库；另一部分用于标记后的肽段混合，进行LC-MS/MS检测时，采用DIA模式采集数据，获得DIA数据。
(4)将DDA谱图数据库和DIA数据导入到DIA定性定量软件(如Spectronaut、Skyline)，进行定性定量分析。
(5)利用生物信息的方法，通过标签区分来自不同样本的蛋白的定性定量信息。
实施例2、采用iDIA技术对Hela细胞的蛋白进行定性定量分析
1、样本蛋白提取及质控
(1)用细胞裂解液对Hela细胞样本进行细胞裂解，然后加入蛋白酶抑制剂，用超声波碎裂细胞，收集蛋白。
(2)向步骤(1)收集的蛋白中加入DTT和烷基化剂(目的为使巯基进行烷基化)，获得样本蛋白溶液。
(3)质控
(3-1)Bradford定量
a、在96孔酶标板A1至A10位置依次加入0μL、2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、12μL、14μL、16μL和18μL浓度为0.2μg/μL的BSA标准蛋白溶液，然后A1至A10位置依次加入20μL、18μL、16μL、14μL、12μL、10μL、8μL、6μL、4μL和2μL无菌水，之后各孔加入180μL考马斯亮蓝G-250定量工作液(北京鼎国昌盛生物技术公司，Lot：63N101100)，用酶标仪测量OD595nm值。根据蛋白浓度和相应的OD595nm值，制备标准曲线。
结果表明，制备的标准曲线为y＝2.2524x+0.015，R2＝0.9917,R2大于0.99，说明制备的标准曲线符合要求。
b、将样本蛋白溶液稀释，得到样本蛋白稀释液。取96孔酶标板，加入20μL样本蛋白稀释液和180μL考马斯亮蓝G-250定量工作液，用酶标仪测量OD595nm值。
c、根据步骤a制备的标准曲线和样本蛋白稀释液的OD595nm值，计算样本蛋白稀释液的蛋白浓度；进一步获得样本蛋白溶液的蛋白浓度。
结果表明，步骤(2)获得的蛋白溶液浓度为5mg/μL，体积为100μL，总量为500mg。
(3-2)SDS-PAGE
取步骤(2)获得的样本蛋白溶液(约200μg蛋白)，加入适量loading buffer，混匀后95℃加热5min，25000g离心5min，取上清点入12％SDS聚丙烯酰胺凝胶的点样孔中，80V恒压电泳30min后再120V恒压电泳120min；电泳结束后，将胶放入快速染脱仪器中10min后，取出胶图扫描。
结果表明，蛋白条带完整，说明蛋白提取合格。
2、蛋白酶解
取步骤1中(2)获得的样本蛋白溶液(含500μg蛋白)，加入1.25μg Trypsin酶(华利世科技，LotNo.20201219C)和1.25μg Lys-C酶(Cell Signaling Technology(CST)，39003S)(蛋白：Trypsin酶：Lys-C酶＝400:1:1)，37℃酶解过夜，之后用Strata X柱进行除盐，真空抽干，得到酶解肽段。
3、肽段标记
(1)取步骤2得到的100μg酶解肽段，加入TMT10plex-131标签(酶解肽段和标签的质量比为1:8)，涡旋震荡后低速离心，室温静止2h，获得TMT10plex-131标记后的肽段，标记为样本1。
(2)取步骤2得到的100μg酶解肽段，加入iTRAQ8plex-116标签(酶解肽段和标签的质量比为1:8)，涡旋震荡后低速离心，室温静止2h，获得iTRAQ8plex-116标记后的肽段，标记为样本2。
(3)分别取iTRAQ8plex-116标记后的肽段0.25μg和TMT10plex-131标记后的肽段0.25μg，按照1:1的量进行混合，得到mix溶液，涡旋震荡后低速离心，室温静止2h，获得TMT10plex-131+iTRAQ8plex-116标记后的肽段1，标记为样本3。
(4)分别取TMT10plex-131标记后的肽段0.084μg和iTRAQ8plex-116标记后的肽段0.417μg，按照1:5的量进行混合，得到mix溶液,涡旋震荡后低速离心，室温静止2h，获得TMT10plex-131+iTRAQ8plex-116标记后的肽段2，标记为样本4。
(5)分别取TMT10plex-131标记后的肽段0.417μg和iTRAQ8plex-116标记后的肽段溶液0.084μg，按照5:1的量进行混合，得到mix溶液,涡旋震荡后低速离心，室温静止2h，获得TMT10plex-131+iTRAQ8plex-116标记后的肽段3，标记为样本5。
4、定性分析
(1)High pH RP分离
分别取TMT10plex-131标记后的肽段和iTRAQ8plex-116标记后的肽段50μg，分别用流动相A(5％ACN，pH9.8)稀释并进样(上样量为50μg)，采用岛津LC-20AD液相系统，分离柱为5μm 4.6x250mm Gemini C18柱，进行液相分离。以300μL/min的流速梯度洗脱：5％流动相B(95％ACN，pH9.8)10min，5％至35％流动相B 40min，35％至95％流动相B1min，流动相B持续3min，5％流动相B平衡10min。在214nm波长下监测洗脱峰并每分钟收集一个组分，结合色谱洗脱峰图合并样品，每个样本分别得到F1-F10 10个组分(TMT10plex-131标记后的肽段的10个组分分别为TMT10plex-131-F1、TMT10plex-131-F2、TMT10plex-131-F3、TMT10plex-131-F4、TMT10plex-131-F5、TMT10plex-131-F6、TMT10plex-131-F7、TMT10plex-131-F8、TMT10plex-131-F9和TMT10plex-131-F10；iTRAQ8plex-116标记后的肽段的10个组分分别为iTRAQ8plex-116-F1、iTRAQ8plex-116-F2、iTRAQ8plex-116-F3、iTRAQ8plex-116-F4、iTRAQ8plex-116-F5、iTRAQ8plex-116-F6、iTRAQ8plex-116-F7、iTRAQ8plex-116-F8、iTRAQ8plex-116-F9和iTRAQ8plex-116-F10；)，然后冷冻抽干。
(2)色谱分离
将抽干的肽段样品用流动相A(2％ACN，0.1％FA)复溶，20000g离心10min后，取上清进样。通过Thermo公司UltiMate 3000UHPLC进行分离。样品首先进入trap柱富集并除盐，随后与自装C18柱(150μm内径，1.8μm柱料粒径，约35cm柱长)串联，以500nL/min流速通过如下有效梯度进行分离：0～5min，5％流动相B(98％ACN，0.1％FA)；5～120min，流动相B从5％线性升至25％；120～160min，流动相B从25％升至35％；160～170min，流动相B从35％升至80％；170～175min，80％流动相B；175～180min，5％流动相B。纳升液相分离末端直接连接质谱仪，进行质谱检测。
(3)DDA建库检测
将10个组分经过液相分离后，通过nanoESI源离子化后进入到串联质谱仪Q-Exactive HF(Thermo FisherScientific，San Jose，CA)进行DDA(Data DependentAcquisition)模式检测。主要参数设置为：离子源电压设置为1.9kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为120000，最大离子注入时间(MIT)为100ms；二级质谱碎裂模式为HCD，碎裂能量设置为NCE 28；分辨率设置为30000，最大离子注入时间(MIT)为100ms，动态排除时间设定为30s。二级质谱起始m/z固定为100；二级碎裂的母离子筛选条件为：电荷2+到6+，峰强度超过5E4的强度排在前20的母离子。AGC设置为：一级3E6，二级1E5。
DDA采集参数见表1。
表1.DDA采集参数
| 第一针 | 第二针 | 第三针 | 第四针 | 第五针 | 第六针 | 第七针 | 第八针 | 第九针 | 第十针 | |
| TMT131 | F1 | F2 | F3 | F4 | F5 | F6 | F7 | F8 | F9 | F10 |
| iTRAQ116 | F1 | F2 | F3 | F4 | F5 | F6 | F7 | F8 | F9 | F10 |
| 上样量(μg) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 上机时间 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
(4)DIA质谱检测
将样本1(即TMT10plex-131标记后的肽段)、样本2(即iTRAQ8plex-116标记后的肽段)、样本3(即TMT10plex-131+iTRAQ8plex-116标记后的肽段1)、样本4(即TMT10plex-131+iTRAQ8plex-116标记后的肽段2)和样本5(即TMT10plex-131+iTRAQ8plex-116标记后的肽段3)经过液相分离后，通过nanoESI源离子化后进入到串联质谱仪Q-Exactive HF(ThermoFisherScientific，San Jose，CA)进行DIA(Data Independent Acquisition)模式检测。主要参数设置为：离子源电压设置为1.9kV；一级质谱扫描范围400～1250m/z；分辨率设置为120000；最大离子注入时间(MIT)为50ms；将400～1250m/z均分为45个窗口进行连续窗口碎裂及信号采集。离子碎裂模式为HCD，最大离子注入时间(MIT)选用自动模式，碎片离子在Orbitrap中进行检测，分辨率设置为30000，碎裂能量NCE采用分布式碎裂：22.5，25，27.5；AGC设置为1E6。
质谱DIA采集参数见表2。
表2.质谱DIA采集参数
| 第一针 | 第二针 | 第三针 | 第四针 | 第五针 | |
| 样本 | TMT131 | iTRAQ116 | TMT131+iTRAQ(1:1) | TMT131+iTRAQ(1:5) | TMT131+iTRAQ(5:1) |
| 上样量(μg) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 采集时间(h) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
(5)DDA数据分析
从UniProt蛋白数据库中下载Homo_sapiens蛋白序列作为参考的蛋白数据库。iDIA技术使用Maxquant软件完成DDA数据的鉴定，作为后续DIA分析的谱图库。操作时以原始下机数据为输入文件，配置好相应参数及数据库，然后进行鉴定和定量分析。其中满足FDR<＝1％的鉴定信息将用于建立最终的谱图库。
(6)DIA数据分析
下机的DIA数据和DDA数据库导入到Spectronaut软件，按照Spectronaut说明书设置参数，进行DIA数据的定性分析。最终获得蛋白以及肽段对应的信息。
5、定量分析
根据标签的标记类型，利用R程序计算每种标签对应样本的蛋白和肽段的定量信息。为了评估iDIA技术定量效果，比较样本3、样本4和样本5的定量结果。肽段比值＝TMT10plex-131标记后的肽段强度值:iTRAQ8plex-116标记后的肽段强度值。结果见图3，具体如下：
对于样本3，定量的肽段中位数比值是1.25，即实际比值为1.25:1；对于样本4，定量的肽段中位数比值是0.3，即实际比值为1:3.14；对于样本5，定量的肽段中位数比值是4.41，即实际比值为4.41:1。结果表明，使用iDIA技术可以获得比较高的定量结果。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种高通量分析蛋白质的方法，包括如下步骤：
(1)分别提取若干目标样本的蛋白，之后酶解，获得酶解肽段；
(2)完成步骤(1)后，分别用质量数相差大于50Da的标签标记来自不同样本的肽段；
(3)将步骤(2)标记的肽段进行LC-MS/MS检测，采用DDA模式采集数据，构建DDA谱图数据库；
(4)将步骤(2)标记的肽段混合，得到混合肽段；将混合肽段和步骤(2)标记的肽段分别进行LC-MS/MS检测，采用DIA模式采集数据，获得DIA数据；
(5)将步骤(3)构建的DDA谱图数据库和步骤(4)获得的DIA数据进行定性和/或定量分析，通过标签区分来自不同样本的蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，酶解采用Trypsin酶和Lys-c酶进行。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述目标样本的蛋白、Trypsin酶和Lys-c酶的比例为400μg：(1.00-1.50)μg：(1.00-1.50)μg。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，标签为iTRAQ、TMT或IBT。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，DDA谱图数据库采用鉴定软件构建；鉴定软件为maxquant或mascot。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，采用DDA模式采集数据时，一级谱图采集时，保证来自不同样本的同一个肽段的母离子，落在不同的采集窗口中，不会互相干扰；二级谱图定量时，只选择标签标记的肽段进行定量，通过标签判断肽段来自哪个样本；二级碎裂后产生的离子，通过设置二级谱图扫描的起始m/z，通过m/z筛选实现不采集二级谱图上的报告离子。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，将步骤(3)构建的DDA谱图数据库和步骤(4)获得的DIA数据进行定性分析为将DIA数据和DDA数据库导入Spectronaut软件或Skyline软件，进行定性分析。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，将步骤(3)构建的DDA谱图数据库和步骤(4)获得的DIA数据进行定量分析为利用R程序计算混合样本中每种标签对应样本的蛋白和肽段的定量信息。
9.权利要求1至8任一所述的方法在PRM靶向蛋白采集中的应用。
10.权利要求1至8任一所述的方法在PRM靶向采集目标肽段的母离子中的应用。
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