CN106885858A - 一种高效的痕量临床病人样本的高通量全蛋白组学定量分析方法 - Google Patents

一种高效的痕量临床病人样本的高通量全蛋白组学定量分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种针对痕量临床病人样本的一整套从组织获得、蛋白提取、蛋白酶解到蛋白质质谱高通量自动定量分析的方法。应用本发明可以解决临床病人组织样本量少，蛋白提取效率低，蛋白量少且难以利用蛋白质组学进行高通量、自动化疾病标志物和治疗靶点筛选等技术问题。

Description

一种高效的痕量临床病人样本的高通量全蛋白组学定量分析 方法
技术领域
本发明属临床医学诊断技术领域，具体涉及一种痕量临床病人样本的蛋白组学模型及其构建方法和应用。
背景技术
2015年1月20日，时任美国总统奥巴马在国情咨文演讲中提出了“精准医学(Precision Medicine)”计划，旨在推动个体化基因组学研究，依据个人基因信息为癌症及其他疾病患者制定个体医疗方案。简单来说，“精准医学”就是指根据每个病人的个人特征量体裁衣式地制定个性化治疗方案。它是由“个性化医疗”联合最新的遗传检测技术发展而来。遗传检测并不仅仅只是基因检测，其范围更广，是对受检者与相关微生物(如感染因子、共生微生物等)的遗传物质(包括DNA、RNA、染色体)及其产物(如蛋白质、代谢物及小分子)进行检测，为疾病诊疗、健康管理提供信息与线索。目前已有的一些新型基因组学标志物，包括全基因组DNA序列、全外显子组DNA序列、表达谱、小RNA等，然而以蛋白质作为疾病标志物的仍然少之又少。究其原因，主要是临床病人样本在获取时极其困难，样本量又非常少，而蛋白质组学的研究对象蛋白质又无法像基因组学研究的DNA、RNA那样可以通过PCR得到扩增，因此疾病蛋白标志物的开发受到极大的限制。
肾小球肾炎是肾脏疾病的主要类型，是指肾小球固有细胞增殖和(或)白细胞浸润引起的以肾小球细胞成分增多为特征的一类疾病。根据发病机制和致病类型，肾小球肾炎分为5类：免疫复合物相关性肾小球肾炎、寡免疫复合物性肾小球肾炎、抗肾小球基膜肾炎、单克隆免疫球蛋白相关性肾小球肾炎和C3肾病。其中，免疫复合物相关性肾小球肾炎，是以特定类型的免疫复合物蛋白在肾小球的沉积为特征的一类疾病。目前在临床上除了以免疫荧光结果(或不太常用的免疫组化结果)为基础、并结合光镜和电镜结果进行诊断分型外，尚未开发出灵敏、精准和自动化的诊断手段。近年来，美国的梅奥医学中心(Mayo Clinic)等顶尖医疗机构开始开发肾小球石蜡切片激光显微切割结合质谱蛋白质组学的方法，对肾脏病病人肾小球的全蛋白组进行检测后用于临床诊断和分型，获得了较好结果。但是，受限于肾小球石蜡切片激光显微切割获取到的蛋白量，这一检测方法一般采取非标记蛋白质谱定量方法进行分析，只能检测和定量到的几十种不同的高丰度蛋白种类。另外，因为石蜡切片本身制作以及从中提取蛋白的过程复杂，步骤繁琐，造成样品不同程度的损失和引入误差，严重影响质谱分析的结果和最终的疾病诊断。
同位素标记相对和绝对定量技术(isobaric Tags for Relative and AbsoluteQuantitation，iTRAQ)是由美国SCIEX公司研发的一种体外同种同位素标记的相对与绝对定量技术。该技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较多达8组样品之间的蛋白表达量，对数千个蛋白一次完成自动定量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。然而，该技术对蛋白量的要求较高，一般每组样品需要50μg以上的蛋白进行标记后混合，才能进行下游的HPLC分级，从而实现103数量级的蛋白定量。然而，多数情况下，临床穿刺获得的病人组织样品量非常少，还要用于切片、染色等病理分析，只有极微量的组织可供蛋白质组学检测。痕量的组织样本，如激光显微切割获取肾小球，肉眼观察不明显，且不易进行操作，又带来一个总蛋白如何提取的新问题。因此，亟需针对此类痕量临床病人样本开发一整套从组织获得、蛋白提取、蛋白酶解到蛋白质质谱高通量自动定量分析的技术。
发明内容
本发明专利需要解决的问题是临床病人组织样本量少，蛋白提取效率低，蛋白量少且难以利用蛋白质组学进行高通量、自动化疾病标志物和治疗靶点筛选的技术障碍。
本发明的目的可以通过以下措施来达到：1.将手术获得或穿刺活检获得的临床病人组织根据需要进行激光显微切割，获取痕量的相同大小的组织。2.将痕量病人组织采用非接触式超声破碎高效提取总蛋白。3.将获得的蛋白进行还原烷基化，并进行胰蛋白酶酶解。收集酶解肽段脱盐后取微量肽段进行质谱分析，根据肽段数量对不同组蛋白的浓度完成相对定量。4.对不同组病人样品按照流程进行iTRAQ试剂的标记，并真空抽干后进行痕量样品的HPLC预分级。5.将HPLC分级获得的肽段提交到在线二维液相色谱质谱联用系统(2D-LC-MS/MS)进行全蛋白质组学定量分析。6.通过生物信息学工具分析，高通量高准确度的筛选和确认疾病标志物和治疗靶点蛋白，真正通过质谱蛋白质组学手段实现精准医学疾病诊断。
本发明所述的生物信息学工具，包括使用ProteinPilot搜索引擎处理所得的LC-MS/MS iTRAQ定量数据，将ProteinPilot搜索获得的不同组病人样品蛋白定量原始数据进行深入的生物信息学分析，包括HeatMap分析、Venn图分析、GO分析、KEGG分析和蛋白家族表达变化聚类分析等，筛选出潜在的与不同疾病进程相关的蛋白，用于检测试剂盒的开发和临床诊断。
本发明提供了一种稳定、高效的痕量临床病人样本高通量蛋白质组学分析方法。每组只需200ng的病人组织蛋白样品，即可实现最多八组不同病人样品组间＞1500种蛋白的定量比较。同已有技术相比，本发明的特色和创新之处在于利用质谱相对定量解决了痕量病人样品蛋白定量的难题，将非接触式超声破碎方法应用于痕量组织蛋白的高效提取；同时，创造性的将iTRAQ联合HPLC预分级技术应用到痕量样品(＜200ng蛋白)的定量，只需要正常样品量(50μg)的1/250即可对103数量级的蛋白完成不同组间的定量比较，大大提高了蛋白组学在疾病标志物和治疗靶点基础研究和临床上的应用。
图例说明
图1.痕量临床病人样本的高通量全蛋白组学定量分析技术示意图。
图2.痕量临床肾病病人iTRAQ标记后肽段混合物的HPLC洗脱曲线。
图3.两个与肾病严重程度呈显著正相关的蛋白Collagen alpha(IV)chain和Complement C3的特定肽段iTRAQ定量的原始图。
图4.在不同程度肾病病人中鉴定并定量到的所有蛋白的HeatMap。
图5.在不同程度肾病病人中表达上调蛋白的Venn图。A.在三组不同程度肾病的同组两个病人中表达上调蛋白的Venn图。B.在三组不同程度肾病病人中分别表达上调蛋白的Venn图。图6.在不同程度肾病病人中表达上调蛋白的GO分析示例-生物学功能分析(Biologicai Process)。
图7.不同程度肾病病人中表达上调蛋白的聚类分析：A.Collagen蛋白家族；B.补体系统蛋白家族。
具体实施例方式
本专利适用于各种临床病人样本，在此以肾病病人肾穿刺活检样本为例。
样品制备
表1.材料与试剂
样品收集
根据临床指标选择某种肾病不同病程的病人，考虑性别、年龄等指标较为一致，并有充足样品作检测。样品分为四组：无肾病对照组，肾病早期，肾病中期，肾病晚期，各2个生物学重复。对肾小球显微切割，每个样品激光微分离获得10个肾小球(存放于-20℃冰箱，冰上运输)。
蛋白质提取
将样品收集在含有50μl RIPA裂解缓冲液的1.5mL离心管中，使用Parafilm膜封管口。使用Bioruptor在冰水浴中进行非接触式超声破碎裂解肾小球，频率0.5min on/0.5minoff，时长15min，重复两次。将所得裂解液在4000g，4℃下离心15分钟，后续在12，000g，4℃下离心15分钟除去组织和细胞碎片，吸取上清至新Eppendorf管。根据说明书，用BCA试剂盒测定蛋白质浓度，保证每组样品使用相同的蛋白量进行后续的iTRAQ标记。本实验中，由于起始肾小球数量一致，各组样品的总蛋白量相对一致。为了保证尽量多的样品用于质谱检测，未进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色验证蛋白量。
蛋白酶酶解
蛋白质溶液加入2μl 50mM Tris-(2-CarboxyEthyl)Phosphine(TCEP)在60℃下还原1hr，随后加入1μl 200mM Methyl Methane-ThioSulfonate(MMTS)在室温下避光烷基化反应30min。随后，对样品进行超滤管酶解，将样品加至10K超滤管滤膜上，10000rpm，4℃下离心30min，50μl 0.5M TriEthylAmmonium Bicarbonate(TEAB)洗三次。最后，对于第一次消化过夜以1∶50胰蛋白酶/蛋白溶液(质量体积比)加入胰蛋白酶，对于第二次4小时消化以1∶100胰蛋白酶/蛋白溶液(质量体积比)加入胰蛋白酶。10000rpm，4℃下离心30min后，再加入50μl 0.5M TEAB至超滤膜上，离心收集肽段溶液。
iTRAQ标记
胰蛋白酶消化后，通过Strata X C18 SPE柱(Phenomenex)将肽脱盐并真空干燥。肽段在0.5M TEAB中重悬，并根据制造商的方案对8-plex iTRAQ试剂盒进行处理。简言之，将1单位的iTRAQ试剂(定义为标记1.8mg蛋白质所需的试剂量)解冻并在80μl ACN中重构。然后将iTRAQ试剂加入肽段混合物并在室温下避光温育2小时，在标记完成后将八组病人肽段合并，真空离心干燥后进入HPLC预分级。
表2.不同病人样本iTRAQ标记信息
HPLC预分级
在分级痕量临床病人之前，利用和实际病人样品相同蛋白量(1.6μg)的大肠杆菌总蛋白酶解产物测试HPLC系统，确认系统对于分级该数量级的肽段有效。然后，通过高pH反相HPLC使用Agilent 300Extend C18柱(5μm颗粒，4.6mm ID，250mm长度)将iTRAQ标记后混合样品分级。简言之，首先在pH 8的10mM甲酸胺中用2％至98％乙腈梯度在36分钟内将肽段分离成36个级分。然后，将肽合并成12个级分，并通过真空离心干燥。
基于LC-MS/MS的定量蛋白质组学检测
表3.材料与试剂
质谱仪
AB Sciex Triple-TOF 5600+
LC-MS/MS分析
将肽段溶解于上样缓冲液(2％FA，3％ACN)中，使用溶剂A(2％ACN，0.1％FA)直接加载到反相预制柱(Chrom XP C18-CL-3m 120A，Eksigent)上。然后在反相分析柱(3C18-CL-120，3μm，120A，Eksigent)上进行肽段分离，所用的LC方法为：在90分钟内溶剂B(98％ACN，0.1％FA)线性梯度由4％上升到22％进行肽段分离，接下来22分钟内溶剂B线性梯度由22％上升到35％，并在4分钟内升至80％溶剂B，最后在80％溶剂B保持4分钟。所有操作在Eksigent NanoLC 2D系统上以300nl/min的恒定流速进行，并通过Triple-TOF 5600+质谱仪(AB Sciex)分析所得肽段。在与Eksigent NanoLC 2D系统串联的TripleTOF 5600+质谱仪(AB Sciex)的离子源中对肽段进行加质子化，随后进行三级四重杆串联质谱(MS/MS)检测。在轨道阱中以70,000的分辨率检测到完整的肽段。在15秒动态排除的MS扫描中，一次MS扫描之后，选择离子计数高于1.5E4阈值的前20个前体离子交替进行MS/MS扫描。在进行MS/MS实验时，使用NCE设置为33；在17,500的分辨率下检测到离子碎片。施加的电喷雾电压为2.0kV。使用自动增益控制(AGC)来防止离子阱的过度填充；积累5E4离子以产生MS/MS谱图。对于MS扫描，m/z扫描范围设定为350-1800。
数据库搜索
使用ProteiaPilot搜索引擎处理所得的LC-MS/MS iTRAQ定量数据。针对Uniprotall_Human数据库进行搜索。胰蛋白酶/P被指定为裂解酶，允许多达3个缺失的裂解，每个肽4个修饰和5个电荷。允许的质量数偏差设置为MS 20ppm，MS/MS 0.02Da。Cys上的氨基甲酰甲基化被指定为固定修饰，并且Met上的氧化，Ser，Thr，Tyr上的磷酸化和蛋白质N-末端上的乙酰化被指定为可变修饰。将蛋白质、肽和修饰位点的假发现率(FDR)阈值指定为1％。最小肽长度设置为7。所有其他参数设置为默认值。
生物信息学分析和疾病标志物筛选
将ProteinPilot搜索获得的不同组病人样品蛋白定量原始数据进行深入的生物信息学分析，包括HeatMap分析、Venn图分析、GO分析、KEGG分析和蛋白家族表达变化聚类分析等，筛选出潜在的与不同肾病进程相关的蛋白，并进行Western blot和ELISA等验证。最后确认与不同肾病进程相关的疾病蛋白标志物，用于肾病检测试剂盒的开发和临床诊断。

Claims (5)

1.一种高效的痕量临床病人样本的高通量全蛋白组学定量分析方法，其特征是利用iTRAQ技术高效分析痕量的临床病人样本，高通量的实现全蛋白质组定量和比较，筛选出疾病相关蛋白和标志物。
2.根据权利要求1所述的高通量全蛋白组学定量分析方法，其特征是利用非接触式超声破碎提取痕量组织样本总蛋白。
3.根据权利要求1所述的高通量全蛋白组学定量分析方法，其特征是对痕量临床病人样本肽段进行iTRAQ标记并联合HPLC分级。
4.根据权利要求1所述的高通量全蛋白组学定量分析技术，其特征是包括以下步骤：
将获得的临床病人组织根据需要进行激光显微切割，获取痕量的相同大小的组织；
将痕量病人组织采用非接触式超声破碎提取总蛋白；
将获得的蛋白进行还原烷基化，并进行胰蛋白酶酶解，收集酶解肽段脱盐后取微量肽段进行质谱分析，根据肽段数量对不同组蛋白的浓度完成相对定量；
对不同组病人样品按照流程进行iTRAQ试剂的标记，并真空抽干后进行痕量样品的HPLC预分级；
将HPLC分级获得的肽段提交到在线二维液相色谱质谱联用系统进行全蛋白质组学定量分析；
通过生物信息学工具分析，高通量高准确度的筛选和确认疾病标志物和治疗靶点蛋白，实现精准医学疾病诊断。
5.根据权利要求1所述的一种高效的痕量临床病人样本的高通量全蛋白组学定量分析技术在蛋白质疾病标志物的筛选和疾病临床诊断中的应用。
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