JP6004359B2 - 質量分析方法及び質量分析データ処理装置 - Google Patents

Description

本発明は、質量分析方法及び該方法に用いられる質量分析データ処理装置に関し、さらに詳しくは、マトリクス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）イオン源を具備する質量分析装置を用いた質量分析方法及び該方法に用いられる質量分析データ処理装置に関する。

近年、タンパク質やペプチド、糖鎖、核酸などの生体由来の高分子化合物の同定や構造解析に、イオンに対する解離操作を伴う質量分析の手法が盛んに利用されている。イオンを解離させる手法としては、イオントラップやコリジョンセルを用いた衝突誘起解離（ＣＩＤ＝Collision Induced Dissociation）がよく用いられているが、イオン源の種類によっては、インソース分解（ＩＳＤ＝In-Source Decay）と呼ばれる手法が用いられることがある。インソース分解はイオン化と同時に又はイオン化の直後にイオン化室内等で生じる開裂のことであり、よく知られているのは、電子イオン化法（ＥＩ）によるイオン化の際の分子イオンの開裂である。

ＭＡＬＤＩ法によるイオン化は一般にソフトなイオン化であると言われ、もともとイオン化に際して開裂を起こしにくいが、例えばレーザ光強度を高める等、イオン化の際のエネルギを高めることで、開裂が促進されることが知られている。特にタンパク質やペプチドを対象とした、ＭＡＬＤＩイオン源におけるインソース分解では、レーザ光の照射によってマトリクスから発生した水素ラジカルによりペプチド主鎖のＮ-Ｃα結合の開裂が誘起され、主としてｃ系列イオン及びこれと対になるｚ系列イオンが生成することが知られている（非特許文献１参照）。こうした現象を利用して、ＭＡＬＤＩ飛行時間型質量分析計においてインソース分解で得られたマススペクトルを解析することにより、ペプチドのアミノ酸配列を推定するといった解析が行われている。
なお、以下の説明では、ＭＡＬＤＩイオン源におけるインソース分解を利用した質量分析方法を「ＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析」と称す。

また、ＭＡＬＤＩイオン源でのインソース分解の起こり易さは、サンプル調製に使用されるマトリクスにも依存しており、非特許文献１〜３によれば、ＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析に適したマトリクスとして、2,5-ジヒドロキシ安息香酸（2,5-Dihydroxybenzoic acid：ＤＨＢ）、1,5-ジアミノナフタレン（1,5-Diaminonaphtalene：ＤＡＮ）、5-アミノ-1-ナフトール（5-Amino-1-naphtol：ＡＮＬ）などが挙げられている。

上述したようにペプチドに対して得られたマススペクトルからアミノ酸配列を推定する際には、既知のアミノ酸配列が収録されたデータベースを用いた検索による手法やプロダクトイオンの質量電荷比差を検出して配列を決定する手法（デノボ（De novo）シーケンシング法）などが使用される（非特許文献６参照）。そうした解析の際には、マススペクトル上で観測されるピークの情報（質量電荷比及び強度）が利用され、一般的には、マススペクトルから得られるプロダクトイオンの情報が多いほど、ペプチドのアミノ酸配列推定の精度は向上する。

しかしながら、得られるプロダクトイオンの情報が多すぎたり、マススペクトルのピークパターンが複雑であったりすると、却ってペプチドのアミノ酸配列決定やタンパク質の同定を行えない（つまり同定不可となる）ことがある。その大きな理由の一つは、プロダクトイオン由来のピークの数が多すぎると、各ピークがどのような種類のプロダクトイオンに属するものであるのかの帰属が困難になるためである。

高山光男、「各種質量分析分解法におけるインソース分解の特徴−Hydrogen-Attachment Dissociation（HAD）」、日本質量分析学会誌、第50巻、第6号、2002年、pp.337-349 ケビン・デムール（Kevin Demeure）、ほか３名、「レイショナル・セレクション・オブ・ジ・オプティマム・マルディ・マトリクス・フォー・トップ-ダウン・プロテオミクス・バイ・イン-ソース・ディケイ（Rational Selection of the Optimum MALDI Matrix for Top-Down Proteomics by In-Source Decay）」、アナリティカル・ケミストリ（Analytical Chemistry）、2007年、79巻、22号、pp.8678-8685 高山光男（Mitsuo Takayama）、ほか２名、「インフルーエンス・オブ・セカンダリ・ストラクチャ・オン・イン-ソース・ディケイ・オブ・プロテイン・イン・マトリクス-アシステッド・レーザ・デソープション/イオニゼイション・マス・スペクトロメトリ（Influence of Secondary Structure on In-Source Decay of Protein in Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry）」、マス・スペクトロメトリ（Mass Spectrometry）、2012年、1巻、第1号、pp.A0001 トーマス・コチャー（Thomas Kocher）、ほか２名、「フラグメンテイション・オブ・ペプチズ・イン・マルディ・イン-ソース・ディケイ・メディエイテッド・バイ・ハイドロジェン・ラディカルズ（Fragmentation of Peptides in MALDI In-Source Decay Mediated by Hydrogen Radicals）」、アナリティカル・ケミストリ（Analytical Chemistory）、2005年、77巻、第1号、pp.172-177 ケビン・デムール（Kevin Demeure）、ほか２名、「ニュー・アドバンセズ・イン・ジ・アンダースタンディング・オブ・ジ・イン-ソース・ディケイ・フラグメンテイション・オブ・ペプチドズ・イン・マルディ-トフ-エムエス（New Advances in the Understanding of the In-Source Decay Fragmentation of Peptides in MALDI-TOF-MS）」、ジャーナル・オブ・アメリカン・ソサイエティ・フォー・マス・スペクトロメトリ（Journal of the American Society for Mass Spectrometry）、2010年、21巻、第11号、pp.1906-1917 吉野健一、ほか３名、「質量分析法と配列データベースを利用するタンパク質同定法」、日本質量分析学会誌、52巻、第3号、2004年、pp.106-129

一般に、ＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析で得られたマススペクトルやＣＩＤを用いたＭＳⁿスペクトルには、目的物質に由来する様々なイオンピークが現れるが、その中で一部のプロダクトイオンだけでもそのイオンの種類が決定されれば、データベース検索などの解析手法を利用したペプチド配列決定の精度が向上する。

本発明はこうした課題に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、ペプチド、タンパク質等の化合物に対するＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析で得られたマススペクトル上で観測されるプロダクトイオンピークの中から、特定のイオン種を容易に識別することができ、その結果を用いてペプチドのアミノ酸配列推定やタンパク質同定の精度を向上させることができる質量分析方法、及び該方法に用いられる質量分析データ処理装置を提供することである。

非特許文献４、５には、マトリクスとしてＤＨＢやＤＡＮを用いたＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析では、測定対象物質由来のｚ系列イオンにマトリクスのラジカルが付加したと推測されるイオン（以下、このイオンを「ｚ＋Matrixイオン」と記す）が観測されることが報告されている。本願発明者は実験によって、ＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析において確かにこうしたイオンが安定的に観測されることを確認するとともに、またマトリクスとしてＡＮＬを用いたＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析においても同様に、測定対象物質由来のｚ系列イオンにマトリクスラジカルが付加したと推測されるイオンが観測されることを見出した。さらにまた、測定対象物質由来のｚ系列イオンはその全てがｚ＋Matrixイオンとして観測されるわけではなく、マトリクスラジカルが付加しないｚ系列イオンも十分な感度で検出されることも見出した。

サンプル調製に用いるマトリクスの質量は当然、ユーザには既知である。そこで、上記のような知見に基づき本願発明者は、この質量を利用して、ＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析において得られるマススペクトル上に観測される筈であるｚ系列イオンのピークと該ｚ系列イオンにマトリクス由来のラジカルが付加したイオン（ｚ＋Matrix）由来のピークとを見出し、目的化合物由来のｚ系列イオンのピークを帰属するという手法に想到した。

即ち、上記課題を解決するために成された本発明に係る質量分析方法の第１の態様は、ＭＡＬＤＩイオン源を具備する質量分析装置を用いた質量分析方法であって、
a)インソース分解を行うことで生成された目的物質由来のプロダクトイオンについてのマススペクトルデータを収集するデータ収集ステップと、
b)前記マススペクトルデータに基づいて得られるピークの中で、マトリクス由来の付加物に相当する質量電荷比差を有するペアピークを検出するペアピーク検出ステップと、
c)前記ペアピーク検出ステップで検出されたペアピークを構成する二本のピークのうちの質量電荷比が小さい方のピークを目的物質由来のｚ系列イオンピークであるとして識別するイオン識別ステップと、
を有することを特徴としている。

また上記第１の態様の質量分析方法を実施するための本発明に係る質量分析データ処理装置は、ＭＡＬＤＩイオン源を具備する質量分析装置において、インソース分解を行うことで生成された目的物質由来のプロダクトイオンについてのマススペクトルデータを処理する質量分析データ処理装置であって、
a)前記マススペクトルデータに基づいて得られるピークの中で、マトリクス由来の付加物に相当する質量電荷比差を有するペアピークを検出するペアピーク検出部と、
b)前記ペアピーク検出部により検出されたペアピークを構成する二本のピークのうちの質量電荷比が小さい方のピークを目的物質由来のｚ系列イオンピークであるとして識別するイオン識別部と、
を備えることを特徴としている。

ここで、上記目的物質は典型的にはタンパク質又はペプチドである。また、マトリクスとしては、ＡＮＬ、ＤＨＢ、ＤＡＮなどを用いればよい。

例えばペプチドを対象とするＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析では、イオン化の際にペプチド由来のｚ系列イオンのラジカルにマトリクスラジカルが結合したと考えられるｚ＋Matrixイオンが生成され、ペプチド由来のｚ系列イオンとｚ＋Matrixイオンのペアピークが観測される。この結合によって、通常、二個の水素ラジカルが脱離するため、ｚ系列イオンとｚ＋Matrixイオンとの質量電荷比差は、マトリクスの質量から二個の水素原子の質量を差し引いた質量電荷比となる。

そこで、上記第１の態様の質量分析方法において、上記ペアピーク検出ステップにおける「マトリクス由来の付加物に相当する質量電荷比差」は、マトリクスの質量から二個の水素原子の質量を差し引いた値であるものとすることができる。そして、イオン識別ステップにおいては、上記のようにペアピークが検出されると、その二本のピークのうちの質量電荷比が小さい方のピークを目的物質由来のｚ系列イオンピークとみなし、その帰属を決定する。このようにして、ＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析により得られた多数のプロダクトイオンの中から容易にｚ系列イオン（厳密にいえばｚ系列イオンであると推定されるイオン）を識別することができる。

ただし、ｚ系列イオン以外のピークが偶然に上記探索対象のペアピークに一致してしまうことを完全に避けることは難しいため、ｚ系列イオンの識別精度を高めるには、上記ペアピークに対し既知の質量電荷比差を有する別のピークを加えたトリプレットピークがマススペクトルに観測されるようにするとよい。このようなピークとして、安定同位体元素で標識したマトリクスラジカルがペプチド由来のｚ系列イオンのラジカルに結合したｚ＋Matrix^*イオンを利用することができる。

即ち、上記課題を解決するために成された本発明に係る質量分析方法の第２の態様は、ＭＡＬＤＩイオン源を具備する質量分析装置を用いた質量分析方法であって、
a)安定同位体標識したマトリクスと非標識マトリクスとを混合したマトリクスを用いて調製したサンプルに対しインソース分解を行うことで生成された目的物質由来のプロダクトイオンについてのマススペクトルデータを収集するデータ収集ステップと、
b)前記マススペクトルデータに基づいて得られるピークの中で、マトリクス由来の付加物に相当する質量電荷比差と、安定同位体標識物質の質量と数とに相当する質量電荷比差とを有するトリプレットピークを検出するトリプレットピーク検出ステップと、
c)前記トリプレットピーク検出ステップで検出されたトリプレットピークを構成する三本のピークのうちの質量電荷比が最も小さいピークを目的物質由来のｚ系列イオンピークであるとして識別するイオン識別ステップと、
を有することを特徴としている。

また上記第２の態様の質量分析方法を実施するための本発明に係る質量分析データ処理装置は、ＭＡＬＤＩイオン源を具備する質量分析装置において、安定同位体標識したマトリクスと非標識マトリクスとを混合したマトリクスを用いて調製したサンプルに対しインソース分解を行うことで生成された目的物質由来のプロダクトイオンについてのマススペクトルデータを処理する質量分析データ処理装置であって、
a)前記マススペクトルデータに基づいて得られるピークの中で、マトリクス由来の付加物に相当する質量電荷比差と、安定同位体標識物質の質量と数とに相当する質量電荷比差とを有するトリプレットピークを検出するトリプレットピーク検出部と、
b)前記トリプレットピーク検出部により検出されたトリプレットピークを構成する三本のピークのうちの質量電荷比が最も小さいピークを目的物質由来のｚ系列イオンピークであるとして識別するイオン識別部と、
を備えることを特徴としている。

上記安定同位体物質としては安定同位体元素¹³Ｃや¹⁵Ｎなどを用いることができる。このような安定同位体元素で標識したマトリクスを非標識マトリクスと併せて用いれば、目的物質由来のｚ＋Matrixイオンのピークよりも所定質量電荷比差だけ高い側にｚ＋Matrix^*イオンのピークが観測されるため、ｚ系列イオン、ｚ＋Matrixイオン及びｚ＋Matrix^*イオンのトリプレットピークを検出することで、ｚ系列イオンの識別精度を向上させることができる。なお、サンプル調製の際に、安定同位体標識したマトリクスと非標識マトリクスとを所定比で、例えば１対１で混合すれば、ｚ＋Matrixイオンとｚ＋Matrix^*イオンとのピーク強度の比はおおよそ、その混合比になる筈である。そこで、トリプレットピークを検出する際に、単に質量電荷比のみならず、ピーク強度比も判定することで、偽のトリプレットピークを排除することができる。

上述したように、ＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析においてマトリクスは目的物質由来のｚ系列イオン、つまりはペプチドのＮ末端側に特異的に結合する。そのため、目的物質由来のｚ＋Matrixイオンに対するＭＳⁿスペクトル（擬似的なＭＳⁿ⁺¹スペクトル）ではＮ末端を含むａ/ｂ/ｃ系列のプロダクトイオンが非標識マトリクスが付加したイオンとして検出され、他方、ｚ＋Matrix^*イオンに対するＭＳⁿスペクトル（擬似的なＭＳⁿ⁺¹スペクトル）では同じａ/ｂ/ｃ系列のプロダクトイオンは安定同位体標識マトリクスが付加したイオンとして検出される。そして、それらａ/ｂ/ｃ系列のプロダクトイオンは安定同位体標識元素の質量及び数に応じた質量差を有することになる。

そこで上記第２の態様の質量分析方法は、さらに、
d)前記トリプレットピーク検出ステップで検出されたトリプレットピークを構成する三本のピークのうちの質量電荷比が２番目に小さいピークと質量電荷比が最も大きいピークとをそれぞれプリカーサイオンとしたＭＳⁿ分析（ｎは２以上の整数）を実行してＭＳⁿスペクトルデータを収集するＭＳⁿスペクトルデータ収集ステップと、
e)前記ＭＳⁿスペクトルデータにより得られる二つのＭＳⁿスペクトルを比較し、安定同位体標識物質の質量と数とに相当する質量電荷比差を有するピークを目的物質由来のａ/ｂ/ｃ系列のイオンピークであるとして識別するイオン２次識別ステップと、
を有するものとすることができる。

一方、Ｎ末端を含まないｘ/ｙ/ｚ系列のプロダクトイオンにはマトリクスは結合していないので、上記二つのＭＳⁿスペクトルにおいて同じ質量電荷比に目的物質に由来するｘ/ｙ/ｚ系列のプロダクトイオンピークが観測されることになる。そこで上記イオン２次識別ステップでは、上記ＭＳⁿスペクトルデータにより得られる二つのＭＳⁿスペクトルを比較し、同一質量電荷比に現れるピークを目的物質由来のｘ/ｙ/ｚ系列のイオンピークであるとして識別することができる。

これにより、目的物質由来のイオンに関してより多くの情報を例えばペプチドのアミノ酸配列決定やタンパク質同定の解析に供することができ、そうした解析の精度を一層向上させることができる。

本発明に係る質量分析方法及び質量データ処理装置によれば、例えばペプチドやタンパク質に対するＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析で得られたマススペクトルの中からｚ系列イオンを容易に識別することができる。これにより、マススペクトル中の一部のイオンピークの帰属を定めた上で、ピーク情報をタンパク質同定やペプチドのアミノ酸配列決定のための解析処理に供することができるので、そうした同定や配列決定の精度が向上する。

本発明に係る質量分析データ処理装置を含むＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳシステムの一実施例の概略構成図。 ＡＮＬマトリクスを使用したときのＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析でｚ＋Matrixイオンが生成されるメカニズムを説明する図。 本実施例のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳシステムにおける解析処理の手順の一例を示すフローチャート。 ＡＮＬマトリクスを用いたときのシトクロムｃに対する実測のＩＳＤマススペクトルを示す図。 ＡＮＬマトリクスを用いたときのユビキチンに対する実測のＩＳＤマススペクトルを示す図。 ＤＡＮマトリクスを用いたときのユビキチンに対する実測のＩＳＤマススペクトルを示す図。 ＳＡマトリクスを用いたときのユビキチンに対する実測のＩＳＤマススペクトルを示す図。 ＤＨＢマトリクスを用いたときのユビキチンに対する実測のＩＳＤマススペクトルを示す図。 ＡＮＬマトリクスを用いたときのシトクロムｃ由来のＩＳＤプロダクトイオン（ｚ₁₅＋ＡＮＬ）をプリカーサイオンとした擬似ＭＳ³スペクトルを示す図。 ＤＡＮマトリクスを用いたときのユビキチン由来のＩＳＤプロダクトイオン（ｚ₁₁＋ＤＡＮ）をプリカーサイオンとした擬似ＭＳ³スペクトルを示す図。 本発明の第２実施例のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳシステムにおけるペプチド解析の処理手順を示すフローチャート。 安定同位体標識マトリクスの一例を示す図。 安定同位体標識マトリクスと非標識マトリクスとを混合したマトリクスを用いたときに得られるＩＳＤマススペクトルの一例を示す図。 本発明の第２実施例の変形例のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳシステムにおけるペプチド解析の処理手順を示すフローチャート。 非標識マトリクスが付加したｚ系列イオン及び安定同位体標識マトリクスが付加したｚ系列イオンをそれぞれプリカーサイオンとして得られるＭＳ²スペクトルの一例を示す図。

［第１実施例］
以下、本発明に係る質量分析データ処理装置を含むＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳシステムの第１実施例について、添付図面を参照しつつ説明する。
図１は第１実施例によるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳシステムの概略構成図である。

図１において、ＭＡＬＤＩイオン源１は、サンプルプレート１０が載置される試料ステージ１１と、引出電極１３と、イオン収束電極１４と、レーザ照射部１５と、反射鏡１６と、を含む。

サンプルプレート１０上には、測定対象物質を含み、所定のマトリクスを用いて調製されたサンプル１２が形成されている。レーザ照射部１５からパルス状に出射されたレーザ光は、反射鏡１６を経てサンプル１２上の１点（厳密には微小領域）に集光される。このレーザ光のエネルギによりサンプル１２からマトリクスとともに測定対象物質が気化し、その際に測定対象物質はイオン化される。ＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析を行う場合には、レーザ光の強度を高め、測定対象物質がイオン化されると同時に又はその直後にイオンの開裂を促進させる。サンプルプレート１０の近傍で生成された各種イオンは引出電極１３とサンプルプレート１０との間に形成されている電場の作用により引き出され、イオン収束電極１４により加速されつつ収束されて白抜き矢印の方向に進む。

イオントラップ２は、環状のリング電極２０と、該リング電極２０を挟んで配置された一対のエンドキャップ電極２１、２２とから成る、三次元四重極型の構成である。上記のようにＭＡＬＤＩイオン源１から送られてきた各種イオンはイオントラップ２の内部に形成される四重極高周波電場の作用によって一旦捕捉され、クーリング作用によりエネルギの収束が行われる。その後、所定のタイミングでエンドキャップ電極２１、２２間に印加される直流電圧により、各イオンに所定の初期エネルギが付与され、それらイオンはイオントラップ２から一斉に吐き出されて質量分析部３へと送られる。なお、図示しないが、イオントラップ２の内部にはアルゴンなどのＣＩＤガスが供給されるようになっており、一時的に捕捉したイオンを共鳴励振させてＣＩＤガスに接触させることでＣＩＤによるイオンの開裂操作が行えるようになっている。

質量分析部３は、イオンが飛行する飛行空間３０と、イオンを反射させる電場を形成する反射器３１と、イオンを検出してイオン量に応じた検出信号を出力する検出器３２と、を含む。上記のようにイオントラップ２から吐き出されて質量分析部３へと送り込まれた各種イオンは、飛行空間３０中を自由飛行し、反射器３１により形成される反射電場の作用で折り返されて再び飛行空間３０を経て検出器３２に到達する。質量分析部３へ導入される時点で各イオンはその質量電荷比に応じた飛行速度を有しており、質量電荷比が小さなイオンほど、早く検出器３２に到達する。

検出器３２から出力された信号はデータ処理部４に入力される。データ処理部４は、データ格納部４１、ｚ系列イオン帰属処理部４２、タンパク質／ペプチド同定処理部４３などの機能ブロックを含む。制御部５はサンプル１２に対する質量分析を実行するために各部を制御する機能と、付設された入力部６及び表示部７を通したユーザインターフェイスの機能とを有する。なお、この制御部５及びデータ処理部４の機能の少なくとも一部は、コンピュータをハードウエア資源とし、該コンピュータにインストールされた専用のソフトウエアを実行することにより実現する構成とすることができる。

本実施例のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳシステムでは、ペプチド又はタンパク質を測定対象物質とし、ＭＡＬＤＩイオン源１においてインソース分解を促進させ、それによって生成されるプロダクトイオン由来のピークが観測されるマススペクトル（擬似的なＭＳ²スペクトル）を解析することで、ペプチドのアミノ酸配列の推定又はタンパク質の同定を行う。ここで、このようなＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析によって観測される特徴的なイオンについて、実測結果に基づいて説明する。

実測条件は以下のとおりである。
（１）試料（測定対象物質）：
(A) 馬由来のシトクロムｃ（Cytochrome c）
(B) 牛由来のユビキチン（Ubiquitin）
（試料（A）、（B）ともに水に溶解）
（２）マトリクス：
(A) 5-アミノ-1-ナフトール（ＡＮＬ）（７０％のアセトニトリル水溶液で調製。なお、％は体積を基準とする。以下同様。）
(B) 1,5-ジアミノナフタレン（ＤＡＮ）（５０％のアセトニトリル／０．１％のトリフルオロ酢酸溶液で調製。以下の(C)、(D)も同様。）
(C) シナピン酸（ＳＡ）
(D) 2,5-ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）
（３）質量分析装置：
ＭＡＬＤＩ四重極イオントラップ飛行時間型質量分析計（島津製作所製 AXIMA-Resonance）

図４はＡＮＬマトリクスを用いシトクロムｃに対して得られたＩＳＤマススペクトル、図５はＡＮＬマトリクスを用いユビキチンに対して得られたＩＳＤマススペクトル、図６はＤＡＮマトリクスを用いユビキチンに対して得られたＩＳＤマススペクトル、図７はＳＡマトリクスを用いユビキチンに対して得られたＩＳＤマススペクトル、図８はＤＨＢマトリクスを用いユビキチンに対して得られたＩＳＤマススペクトルである。これらマススペクトルをみると、いずれも試料由来のｚ系列イオンに各マトリクスが結合したｚ＋Matrixイオン（ｚ＋ＡＮＬ、ｚ＋ＤＡＮ、ｚ＋ＳＡ、ｚ＋ＤＨＢ）がｚ系列イオンと共に検出されていることが確認できる。また、対になるｚ系列イオンとｚ＋Matrixイオンとの質量電荷比差は、それぞれのマトリクスの分子量から２[Da]差し引いた値、つまり水素原子二個分の質量値となっていることが分かる。

図９は、ＡＮＬマトリクスを用いシトクロムｃに対して得られたＩＳＤマススペクトル中で観測されたｚ₁₅＋ＡＮＬイオンをプリカーサイオンとし、該プリカーサイオンに対しＣＩＤを行うことで得られたＭＳ²スペクトル（擬似的なＭＳ³スペクトル）である。また図１０は、ＤＡＮマトリクスを用いユビキチンに対して得られたＩＳＤスペクトル中に検出されたｚ₁₁＋ＤＡＮイオンをプリカーサイオンとし、該プリカーサイオンに対しＣＩＤを行うことで得られたＭＳ²スペクトル（擬似的なＭＳ³スペクトル）である。なお、図１に示したシステムでは、イオントラップ２の内部において、特定の質量電荷比を有するプリカーサイオンの選択と、それに引き続くＣＩＤを行うことができる。

図９及び図１０に示したＭＳ²スペクトルにおいて検出されたｂ系列イオンは、全てｂ＋Matrixイオン（ｂ＋ＡＮＬ又はｂ＋ＤＡＮ）であり、ｙ系列イオンにマトリクスが付加したｙ＋Matrixイオンは検出されない。この結果から、ＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析において、マトリクスはペプチドのＣ末端側ではなくＮ末端側（つまりはＯＨ基が付加している側とは反対側）に結合していることが理解できる。

以上の結果から、例えばマトリクスとしてＡＮＬを使用した場合には、ｚ＋Matrixイオンは図２に示したメカニズムにより生成されるものと推測し得る。即ち、上述したように、特にタンパク質やペプチドを対象としたＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析では、レーザ光照射によってマトリクスから脱離した水素ラジカルの作用により、試料由来のｃ系列イオン及びｚ系列イオンが生成される。水素ラジカルが脱離したＡＮＬイオンは活性が高いため、ｚ系列イオンのＮ末端側に結合してｚ＋Matrixイオンを生成する。この際に水素ラジカルが一個放出されるので、イオンの質量はｚ系列イオンの質量とマトリクスの質量とを加えたものより水素ラジカル二個分だけ小さくなる。その結果、ＩＳＤマススペクトルにおいては、ｚ系列イオンと、マトリクスの質量から２[Da]を差し引いた値だけ該ｚ系列イオンよりも高い側にｚ＋Matrixイオンとが現れる。換言すれば、使用しているマトリクスの質量から２[Da]だけ差し引いた値を指標として、ＩＳＤマススペクトルにおいて観測される多数のイオンの中からｚ系列イオンとｚ＋Matrixイオンとをペアピークとして検出することで、ｚ系列イオンを容易に識別することが可能となる。

上記原理を用いた本実施例のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにおけるペプチド解析の処理手順について図３のフローチャートに沿って説明する。

ユーザは、測定対象物質であるペプチドについて、マトリクスとしてＡＮＬ、ＤＡＮ、ＤＨＢ、又はＳＡのいずれかを用いてサンプルを調製する（ステップＳ１）。そうして調製されたサンプル１２を試料ステージ１１にセットし、ユーザが入力部６において分析開始を指示すると、制御部５の制御の下に、ＭＡＬＤＩイオン源１、イオントラップ２、質量分析部３等が動作し、所定分析条件の下でのＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析が行われる（ステップＳ２）。

データ処理部４においては、検出信号を順次デジタルデータに変換して得られる飛行時間スペクトルデータの飛行時間を質量電荷比に換算することでＩＳＤマススペクトルデータを取得し、これをデータ格納部４１に格納する（ステップＳ３）。ｚ系列イオン帰属処理部４２は、データ格納部４１からＩＳＤマススペクトルデータを読み出し、例えば図４、図５に示したようなＩＳＤマススペクトルを作成する（ステップＳ４）。次に、ＩＳＤマススペクトルについてピーク検出を行い、検出された各ピークの質量電荷比及び強度をピーク情報として収集する（ステップＳ５）。

このときに収集されるピーク情報は、試料に由来する様々な種類のイオンピークの情報を含み、試料由来のｚ系列イオンや上述したｚ＋Matrixイオンによるピークの情報も含まれる。そこで、ｚ系列イオン帰属処理部４２は、質量差が、既知であるＡＮＬマトリクスの質量から２[Da]を差し引いた値に対し所定のマージンを加えた所定範囲に収まるような二本のピーク（ペアピーク）を全て探索する（ステップＳ６）。上述したように、検出されたペアピークは、試料由来のｚ系列イオンとｚ＋Matrixイオンである可能性が高いから、そのペアピークのうちの質量電荷比が小さいほうをｚ系列イオンピークとして帰属させ、質量電荷比が大きいほうをｚ＋Matrixイオンピークとして帰属させる（ステップＳ７）。即ち、ＩＳＤマススペクトルから得られたピーク情報の中で、一部のピークの帰属が決定される。

そうした帰属の情報を含めたピーク情報がタンパク質／ペプチド同定処理部４３に送られる。タンパク質／ペプチド同定処理部４３はそうしたピーク情報に基づいて例えばデータベース検索或いはデノボシーケンスサーチを行うことにより、例えばペプチドのアミノ酸配列を推定したりタンパク質を同定したりする（ステップＳ８）。タンパク質／ペプチド同定処理部４３において使用されるアルゴリズムが何であるのかに拘わらず、多数のピークがどのような種類のイオン由来のものであるのかが全く不明であるとアミノ酸配列推定やタンパク質同定の精度が低くなる。それに対し、本実施例のシステムでは、少なくともｚ系列イオンに関する帰属情報がタンパク質／ペプチド同定処理部４３に供されるので、これを一つの手掛かりとしてアミノ酸配列の推定やタンパク質同定を行うことができ、それ故にアミノ酸配列推定やタンパク質同定の精度を高めることができる。

［第２実施例］
上記第１実施例では、ＩＳＤマススペクトルにおいて検出された多数のピークの中でｚ系列イオンとｚ＋Matrixイオンとに由来するペアピークを探索していたが、例えば夾雑物などに由来するノイズピークが多い状況ではｚ系列イオンではない偽のペアピークが検出される可能性が高くなる。そこで、本発明の第２実施例によるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳでは、真のｚ系列イオンピークの検出精度を上げるために、安定同位体標識マトリクスを利用したプロダクトイオン識別手法を導入する。なお、この第２実施例によるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの装置構成は基本的に第１実施例によるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳと同じであるので、装置構成の説明を略す。

図１１は第２実施例のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳシステムにおけるペプチド解析の処理手順を示すフローチャートである。
この第２実施例のシステムを用いた解析の際には、サンプル調製のために特殊なマトリクスを用いる。即ち、図１２に示すように、安定同位体元素¹³Ｃや¹⁵Ｎを用いて安定同位体標識したマトリクス（Matrix^*）と非標識のマトリクスとを用意し、これらを例えば１対１の比率で以て混合した混合マトリクス（Matrix/Matrix^*）を調製する。そして、この混合マトリクス（Matrix/Matrix^*）を用いてサンプルを調製する（ステップＳ１１）。そのあと、このサンプルに対しＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析を実行してＩＳＤマススペクトルを取得し、ピーク検出を行うまでの処理（ステップＳ１２〜Ｓ１５）は上記第１実施例におけるステップＳ２〜Ｓ５と同じである。

サンプル中の安定同位体標識マトリクスと非標識マトリクスとは同量であるため、ＩＳＤマススペクトルには、安定同位体標識元素の質量及び数に応じた質量差でｚ＋Matrixイオンとｚ＋Matrix^*イオンとがほぼ同じピーク強度でペアピークとして観測される。そのため、図１３に示すように、ＩＳＤマススペクトルには、ｚ系列イオン、ｚ＋Matrixイオン、及びｚ＋Matrix^*イオンという三本のピークからなるトリプレットピークが現れる。そこで、ｚ系列イオン帰属処理部４２は、低質量電荷比側から順に、マトリクス質量−２[Da]の質量差Δｍ、及び安定同位体標識元素の質量に相当する質量差Δｍ^#を有して並び、且つ２番目と３番目のピーク強度がほぼ同じである（実際には、同じであるとみなせる所定の強度差範囲に収まる）ようなトリプレットピークを全て探索する（ステップＳ１６）。

上述したように、検出されたトリプレットピークは、試料由来のｚ系列イオン、ｚ＋Matrixイオン、及びｚ＋Matrix^*イオンである可能性が高いから、そのトリプレットピークの中の質量電荷比が最小であるものをｚ系列イオンピークとして帰属させ、次に質量電荷比が大きいものをｚ＋Matrixイオンピークとして帰属させ、質量電荷比が最大であるものをｚ＋Matrix^*イオンピークとして帰属させる（ステップＳ１７）。そのあとに、そうした帰属の情報を含めたピーク情報を用いて、タンパク質／ペプチド同定処理部４３はペプチドのアミノ酸配列を推定したりタンパク質を同定したりする（ステップＳ１８）。

この第２実施例では、マトリクスの調製等に手間が掛かるものの、ペプチド由来のｚ系列イオンの識別が第１実施例に比べて高精度に行えるので、ペプチドのアミノ酸配列推定やタンパク質同定の精度も向上する。

［第２実施例の変形例］
上述したように、ＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析において、マトリクスはペプチド由来のｚ系列イオンのＮ末端側に特異的に結合する。このことを利用し、インソース分解で生成したイオンをさらにＣＩＤによって開裂させたプロダクトイオンを観測した結果を解析すれば、ｚ系列イオン以外の系列のイオンの識別も可能となる。
図１４は第２実施例の変形例であるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳシステムにおけるペプチド解析の処理手順を示すフローチャートである。このフローチャートに従った処理は上記ステップＳ１７の実行後に加えればよい。

ペプチド由来のｚ＋Matrixイオン及びｚ＋Matrix^*イオンが得られたならば、制御部５による制御の下に、これらイオンをそれぞれプリカーサイオンとしたＭＳ²分析を実行する（ステップＳ２１）。即ち、ペプチド由来の各種イオンをイオントラップ２に一旦捕捉した後、特定の質量電荷比を有するｚ＋Matrixイオンのみをプリカーサイオンとして選択し、その後にＣＩＤガスをイオントラップ２に導入してプリカーサイオンを開裂させる。そうして得られた各種のプロダクトイオンを質量分析部３へ送り込んで質量分析する。また、ｚ＋Matrix^*イオンについても同様にＭＳ²分析を行う。そして、それぞれＭＳ²スペクトルデータを収集する（ステップＳ２２）。
なお、これらデータは１回のＣＩＤ操作に対応したデータであるという意味ではＭＳ²スペクトルデータであるが、ＣＩＤ操作に先立ってインソース分解により開裂しているので、実質的にはＭＳ³分析によって得られるのと同等のデータであり、その意味で擬似的なＭＳ³スペクトルデータであるといえる。

ｚ系列イオン帰属処理部４２はＭＳ²スペクトルデータに基づいてそれぞれＭＳ²スペクトルを作成し（ステップＳ２３）、それらマススペクトルにおいて観測されるピークを検出し、ピーク情報を収集する（ステップＳ２４）。図１５はｚ＋Matrixイオン、ｚ＋Matrix^*イオンをプリカーサイオンとして得られる二つのＭＳ²スペクトル（擬似的なＭＳ³スペクトル）の一例である。マトリクスはｚ系列イオンのＮ末端側に結合しているため、Ｎ末端を含むａ/ｂ/ｃ系列のプロダクトイオンはそれぞれ非標識マトリクス、安定同位体標識マトリクスが付加したイオンとして検出される。そして、二つのＭＳ²スペクトルにおいて互いに対応付けられるａ/ｂ/ｃ系列のプロダクトイオン由来のピークは、プリカーサイオンに含まれる安定同位体標識元素の質量及び数に応じた質量差を有する。図１５ではｂ_n〜ｂ_n+5イオンがこれに相当する。

そこで、上記のようにして得られた二つのＭＳ²スペクトルの間で質量電荷比差が安定同位体標識元素の質量及び数に応じたものであり、且つピーク強度のパターンが一致するような一連のピーク群を探索する（ステップＳ２５）。そして、そうしたピークが見つかったならばそれはａ/ｂ/ｃ系列のプロダクトイオン由来のピークであるとして帰属を定める（ステップＳ２６）。

一方、Ｎ末端を含まない、つまりＣ末端側のｘ/ｙ/ｚ系列のプロダクトイオンにはマトリクスは結合していないので、上記二つのＭＳ²スペクトルにおいて同じ質量電荷比においてピークが観測される。図１５ではｙ_n〜ｙ_n+5イオンがこれに相当する。そこで、上記のようにして得られた二つＭＳ²スペクトルの間で同じ質量電荷比の位置に存在し、且つピーク強度のパターンが一致するような一連のピーク群を探索する（ステップＳ２７）。そして、そうしたピークが見つかったならばそれはｘ/ｙ/ｚ系列のプロダクトイオン由来のピークであるとして帰属を定める（ステップＳ２８）。

このようにＭＳ²スペクトルを利用することで、ａ/ｂ/ｃ系列とｘ/ｙ/ｚ系列のプロダクトイオンの識別を容易に行うことができる。このようにして得られたピーク情報も併せて利用することで、ペプチドのアミノ酸配列の推定や構造解析の精度を向上させることができる。

なお、ｚ系列イオンをプリカーサイオンとしたＭＳ²スペクトルとｚ＋MatrixをプリカーサイオンとしたＭＳ²スペクトルとについて、マトリクス質量−２[Da]の質量差を有するピークを見つけることにより、ａ/ｂ/ｃ系列とｘ/ｙ/ｚ系列のプロダクトイオンの識別をすることも可能ではあるものの、マトリクスが付加したａ/ｂ/ｃ系列のプロダクトイオンは必ずしも適切に識別できるとは限らない。何故なら、ｚ＋Matrixイオンはマトリクスが付加していることによってイオンの性質がｚ系列イオンとは異なることがあり、そのためにＭＳ²スペクトル上でｚ系列イオンのスペクトルパターンとｚ＋Matrixイオンのスペクトルパターンとはかなり異なる可能性があるからである。これに対し、非標識マトリクスと安定同位体標識マトリクスとの性質はほぼ同じであるため、ｚ＋Matrixイオンのスペクトルパターンとｚ＋Matrix^*イオンのスペクトルパターンとはほぼ等しくなり、安定同位体標識の質量差によるａ/ｂ/ｃ系列のプロダクトイオンの識別は容易である。

なお、上記実施例はいずれも本発明の一例にすぎないから、本発明の趣旨の範囲で適宜に修正、変更、追加などを行っても本願請求の範囲に包含されることは明らかである。
例えば、上記実施例のシステムはイオントラップを備えていたが、インソース分解のみでＣＩＤを実行しない場合にはイオントラップは不要である。また、ＣＩＤを伴うＭＳ²分析を実行するためにイオントラップ飛行時間型質量分析計の構成ではなく、飛行時間型質量分析計を直列に接続した、いわゆるＴＯＦ-ＴＯＦの構成としてもよい。即ち、イオン源としてＭＡＬＤＩイオン源を用いさえすれば、質量分析部は様々な構成を採り得る。

１…ＭＡＬＤＩイオン源
１０…サンプルプレート
１１…試料ステージ
１２…サンプル
１３…引出電極
１４…加速電極
１５…レーザ照射部
１６…反射鏡
２…イオントラップ
２０…リング電極
２１、２２…エンドキャップ電極
３…質量分析部
３０…飛行空間
３１…反射器
３２…検出器
４…データ処理部
４１…データ格納部
４２…ｚ系列イオン帰属処理部
４３…タンパク質／ペプチド同定処理部
５…制御部
６…入力部
７…表示部

Claims (7)

1. ＭＡＬＤＩイオン源を具備する質量分析装置を用いた質量分析方法であって、
   a)インソース分解を行うことで生成された目的物質由来のプロダクトイオンについてのマススペクトルデータを収集するデータ収集ステップと、
   b)前記マススペクトルデータに基づいて得られるピークの中で、マトリクス由来の付加物に相当する質量電荷比差を有するペアピークを検出するペアピーク検出ステップと、
   c)前記ペアピーク検出ステップで検出されたペアピークを構成する二本のピークのうちの質量電荷比が小さい方のピークを目的物質由来のｚ系列イオンピークであるとして識別するイオン識別ステップと、
   を有することを特徴とする質量分析方法。
2. ＭＡＬＤＩイオン源を具備する質量分析装置を用いた質量分析方法であって、
   a)安定同位体標識したマトリクスと非標識マトリクスとを混合したマトリクスを用いて調製したサンプルに対しインソース分解を行うことで生成された目的物質由来のプロダクトイオンについてのマススペクトルデータを収集するデータ収集ステップと、
   b)前記マススペクトルデータに基づいて得られるピークの中で、マトリクス由来の付加物に相当する質量電荷比差と、安定同位体標識物質の質量と数とに相当する質量電荷比差とを有するトリプレットピークを検出するトリプレットピーク検出ステップと、
   c)前記トリプレットピーク検出ステップで検出されたトリプレットピークを構成する三本のピークのうちの質量電荷比が最も小さいピークを目的物質由来のｚ系列イオンピークであるとして識別するイオン識別ステップと、
   を有することを特徴とする質量分析方法。
3. 請求項２に記載の質量分析方法であって、
   d)前記トリプレットピーク検出ステップで検出されたトリプレットピークを構成する三本のピークのうちの質量電荷比が２番目に小さいピークと質量電荷比が最も大きいピークとをそれぞれプリカーサイオンとしたＭＳⁿ分析（ｎは２以上の整数）を実行してＭＳⁿスペクトルデータを収集するＭＳ ⁿ スペクトルデータ収集ステップと、
   e)前記ＭＳ ⁿ スペクトルデータにより得られる二つのＭＳ ⁿ スペクトルを比較し、安定同位体標識物質の質量と数とに相当する質量電荷比差を有するピークを目的物質由来のａ/ｂ/ｃ系列のイオンピークであるとして識別するイオン２次識別ステップと、
   を有することを特徴とする質量分析方法。
4. 請求項３に記載の質量分析方法であって、
   前記イオン２次識別ステップでは、前記ＭＳ ⁿ スペクトルデータにより得られる二つのＭＳ ⁿ スペクトルを比較し、同一質量電荷比に現れるピークを目的物質由来のｘ/ｙ/ｚ系列のイオンピークであるとして識別することを特徴とする質量分析方法。
5. 請求項１又は２に記載の質量分析方法であって、
   前記マトリクス由来の付加物に相当する質量電荷比差は、マトリクスの質量から二個の水素原子の質量を差し引いた値であることを特徴とする質量分析方法。
6. ＭＡＬＤＩイオン源を具備する質量分析装置において、インソース分解を行うことで生成された目的物質由来のプロダクトイオンについてのマススペクトルデータを処理する質量分析データ処理装置であって、
   a)前記マススペクトルデータに基づいて得られるピークの中で、マトリクス由来の付加物に相当する質量電荷比差を有するペアピークを検出するペアピーク検出部と、
   b)前記ペアピーク検出部により検出されたペアピークを構成する二本のピークのうちの質量電荷比が小さい方のピークを目的物質由来のｚ系列イオンピークであるとして識別するイオン識別部と、
   を備えることを特徴とする質量分析データ処理装置。
7. ＭＡＬＤＩイオン源を具備する質量分析装置において、安定同位体標識したマトリクスと非標識マトリクスとを混合したマトリクスを用いて調製したサンプルに対しインソース分解を行うことで生成された目的物質由来のプロダクトイオンについてのマススペクトルデータを処理する質量分析データ処理装置であって、
   a)前記マススペクトルデータに基づいて得られるピークの中で、マトリクス由来の付加物に相当する質量電荷比差と、安定同位体標識物質の質量と数とに相当する質量電荷比差とを有するトリプレットピークを検出するトリプレットピーク検出部と、
   b)前記トリプレットピーク検出部により検出されたトリプレットピークを構成する三本のピークのうちの質量電荷比が最も小さいピークを目的物質由来のｚ系列イオンピークであるとして識別するイオン識別部と、
   を備えることを特徴とする質量分析データ処理装置。

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