JP6358172B2 - タンパク質又はペプチドの解析方法及び解析装置 - Google Patents

Description

本発明は、イオンの解離操作を伴う質量分析を利用して、タンパク質やペプチドのアミノ酸配列を推定したりタンパク質やペプチドを同定したりするための解析方法及び解析装置に関する。

タンパク質やペプチドを同定したり或いはそのアミノ酸配列を決定したりする方法の一つとして、質量分析を用いた方法が広く利用されている。
一般に、その解析の手順としては、まず、イオントラップ飛行時間型質量分析装置など、ＭＳⁿ分析が可能な質量分析装置を用い、解析対象であるタンパク質やペプチドに対するＭＳⁿ分析を実施する。即ち、目的のタンパク質やペプチドから生成したイオンを適宜の解離手法で解離させ、元のイオンが断片化した各種のフラグメントイオン（プロダクトイオン）を生成させる。このフラグメントイオンを質量電荷比m/zに応じて分離して検出し、フラグメントイオンのマススペクトルを作成する。

タンパク質やペプチド由来のイオンを解離させる手法として最も一般的なのは、イオンをガス（通常は不活性ガス）と衝突させて解離を促す衝突誘起解離（ＣＩＤ＝Collision Induced Dissociation）である。それ以外に、タンパク質やペプチド由来のイオンの解離には電子移動解離（ＥＴＤ＝Electron Transfer Dissociation）や電子捕獲解離（ＥＣＤ＝Electron Capture Dissociation）などもしばしば用いられる。ＥＴＤやＥＣＤは荷電粒子を利用した不対電子誘導型解離法であるが、荷電粒子の代わりに、非荷電粒子である中性ラジカル粒子を用いた不対電子誘導型解離法も知られている。この種の不対電子誘導型解離法としては、特許文献１に開示されている、ヒドロキシルラジカル（ＯＨラジカル）をイオンに照射するイオン解離法などがある。

上述したような測定によって得られたマススペクトルを利用してタンパク質やペプチドを同定する最も一般的な手法はデータベース検索によるものである（非特許文献１参照）。即ち、既知のタンパク質やペプチドのアミノ酸配列等の情報が収録されたデータベースを利用し、そのデータベースに含まれるタンパク質やペプチドのアミノ酸配列から理論的に算出される断片の質量情報と実測のマススペクトルに現れるフラグメントイオンピークの質量情報とを照合する。そして、その照合の一致度に基づいて、蓋然性の高いタンパク質やペプチドを同定結果としたり、或いは、該当する可能性の高いタンパク質やペプチドの候補を複数抽出して同定結果としたりする。このようなデータベース検索には例えば、マトリクス・サイエンス（Matrix Science）社が提供しているデータベース検索用の解析ソフトウエアであるマスコット（Mascot）に含まれるＭＳ／ＭＳイオンサーチを用いることができる。また、データベースとしては一般に公開されている、例えばSwiss-Protなどの各種のデータベースを利用することができる。

データベースを利用する代わりに、フラグメントイオンのマススペクトルに現れる隣接ピーク間の質量差に一致するアミノ酸を当てはめていくことによってアミノ酸配列を推定する方法もある。これはデノボシーケンシング（De novo sequencing）と呼ばれる手法である。この場合、デノボシーケンシングによってアミノ酸配列が決定されたならば、そのアミノ酸配列に対応するタンパク質やペプチドをデータベース上で探索することにより、タンパク質やペプチドを同定することができる。

上述したようにタンパク質やペプチドを同定するためにデータベース検索、デノボシーケンシングのいずれを用いる場合においても、測定によって得られたマススペクトル上で観測されるフラグメントイオンの種類が多すぎると、フラグメントイオンの帰属、つまりフラグメントイオンに対応する断片の推定が困難になり、タンパク質やペプチドを同定することができなかったり或いは同定精度が大きく低下したりすることがある。これにはいくつかの原因が考えられる。

例えば、測定で観測された或るフラグメントイオンがデータベースに収録されている既知のタンパク質やペプチドに由来するものであったとしても、そのタンパク質やペプチドにおけるフラグメンテーションのメカニズムが完全には解明されていない場合、解析ソフトウエアにおいて算出される、そのタンパク質やペプチドに対応する理論的な断片リストにそのフラグメントイオンが存在しないことがある。その場合、測定で観測されたフラグメントイオンは理論断片に一致しなくなり、結果的に照合の一致度が低下して同定不能となる可能性がある。
また、フラグメントイオンのマススペクトルは単一のタンパク質やペプチドに由来するものであることが望ましいが、イオン解離操作を行う前の目的イオンの選択（プリカーサイオン選択）が不十分であると、複数の物質由来のイオンが同時に解離されてしまい、単一の物質として同定できない可能性がある。

米国特許第７７２３６７６号明細書

吉野 健一、ほか３名、「質量分析法と配列データベースを利用するタンパク質同定法」、Journal of the Mass Spectrometry Society of Japan、Vol.52、No.3、2004年、［online］、［平成２７年５月１２日検索］、インターネット＜URL: http://www.mssj.jp/about/pdf/awards/article/en/ms520106.pdf＞ 西風 隆司（Takashi Nishikaze）、ほか１名、「インフルーエンス・オブ・チャージ・ステート・アンド・アミノ・アシッド・コンポジション・オン・ハイドロゲン・トランスファー・イン・エレクトロン・キャプチャー・ディソシエイション・オブ・ペプタイズ（Influence of Charge State and Amino Acid Composition on Hydrogen Transfer in Electron Capture Dissociation of Peptides）」、ジャーナル・オブ・アメリカン・ソサイエティ・フォー・マス・スペクトロメトリー（Journal of American Society for Mass Spectrometry）、Vol. 21、2010年、pp.1979-1988

本発明は上記課題を解決するために成されたものであり、その目的とするところは、フラグメントイオンのマススペクトルに基づいてデータベース検索やデノボシーケンシングなどの手法により目的とするタンパク質やペプチドのアミノ酸配列を決定したり同定したりする際に、観測されるフラグメントイオンの種類が多い場合であっても、その解析作業を容易にすることができるとともに、解析の精度を向上させることができるタンパク質又はペプチドの解析方法及び解析装置を提供することである。

一般に、タンパク質やペプチドに由来するフラグメントイオンのマススペクトルには多数のピークが現れるが、目的のタンパク質やペプチドが全く未知である場合、一つ一つのピークの帰属を決定するのはかなり煩雑な作業である。こうした作業に際し、多数のフラグメントイオンの中で簡便な方法によって一部のフラグメントイオンの種類を決定することができると、アミノ酸配列の推定や同定はかなり容易になり、その精度の向上も期待できる。

本発明者らは、非荷電粒子を用いた不対電子誘導型解離の一方法として水素ラジカルをイオンに照射することでイオンを解離させる方法の研究を鋭意行っており、特願２０１４−４１２０６号（平成２６年３月４日出願）において、水素ラジカルを用いてペプチド由来のイオンを良好に解離する手法を既に提案している。この新規な解離手法によれば、上述したヒドロキシルラジカルを照射する解離手法とは異なり真空雰囲気の下でもイオンを解離させることができるため、イオントラップに捕捉したイオンも解離することができる。また、ＥＴＤやＥＣＤ等の荷電粒子を利用した不対電子誘導型解離法では解離が行えなかった１価のイオンも高い効率で解離することができる。

本発明者らは水素ラジカル粒子照射によるイオン解離法（Hydrogen Attachment Dissociation、以下「ＨＡＤ」という）に関する各種実験を繰り返す過程で、タンパク質やペプチド由来のイオンに対するＨＡＤによるフラグメンテーションパターンを調べた結果、ｃ系列イオンとａ系列イオンとのペアピーク、又はｚ系列イオンとｘ系列イオンとのペアピークが高い頻度で生成されるという特徴を見出した。なお、ここでいう「ペア」は、タンパク質やペプチド由来のフラグメントイオンの命名則におけるイオン系列を示す英子文字に添字として付される数字が同一である（例えばａ₁とｃ₁、ｘ₁とｚ₁）ことを意味する。これらのペアピークはペプチドの構造上決まる所定の質量差を有しているため、フラグメントイオンのマススペクトル上で観測される多数のフラグメントイオンピークの中からこの質量差を指標とした探索を行うことで、ｃ系列イオン及びａ系列イオン、又はｚ系列イオン及びｘ系列イオンを決定することができる。本発明者はこうした知見に基づき、本発明に想到した。

即ち、上記課題を解決するためになされた本発明に係る解析方法は、タンパク質若しくはペプチドを同定する又はそのアミノ酸配列を決定するための解析方法であって、
a)目的とするタンパク質又はペプチド由来のイオンに水素ラジカルを照射することで該イオンを解離させ、それにより生成されたフラグメントイオンを質量分析することでフラグメントイオンの質量情報を収集する質量分析ステップと、
b)前記質量分析ステップで得られたフラグメントイオンの質量情報について、所定の質量差を有するフラグメントイオンのペアを探索することで、ａ系列イオン及びｃ系列イオン、又は、ｘ系列イオン及びｚ系列イオンを推定する特定フラグメントイオン推定ステップと、
を有し、前記特定フラグメントイオン推定ステップで推定されたイオンの情報をタンパク質若しくはペプチドの同定又はそのアミノ酸配列の決定に利用することを特徴としている。

また上記課題を解決するためになされた本発明に係る解析装置は、タンパク質若しくはペプチドを同定する又はそのアミノ酸配列を決定するための解析装置であって、
a)目的とするタンパク質又はペプチド由来のイオンに水素ラジカルを照射することで該イオンを解離させ、それにより生成されたフラグメントイオンを質量分析することでフラグメントイオンの質量情報を収集する質量分析実行部と、
b)前記質量分析実行部で得られたフラグメントイオンの質量情報について、所定の質量差を有するフラグメントイオンのペアを探索することで、ａ系列イオン及びｃ系列イオン、又は、ｘ系列イオン及びｚ系列イオンを推定する特定フラグメントイオン推定部と、
c)前記特定フラグメントイオン推定部で推定されたイオンの情報を利用しつつ目的とするタンパク質若しくはペプチドの同定又はそのアミノ酸配列の決定を行う解析実行部と、
を備えることを特徴としている。

本発明に係るタンパク質又はペプチドの解析方法及び解析装置において、質量分析を実行するためには、３次元四重極型イオントラップ、多重極リニア型イオントラップ、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析装置のセルなど、高周波電場や磁場の作用によりイオンを所定の空間に閉じ込めるイオン閉じ込め部に水素ラジカルを導入し、該イオン閉じ込め部の内部で目的とするタンパク質やペプチド由来のイオンと水素ラジカルとを反応させて該イオンを解離させるイオン解離部（つまりＨＡＤによるイオン解離部）を備える質量分析装置を用いるとよい。解離によって生成されたフラグメントイオンを質量電荷比毎に分離する手法は特に問わず、例えば飛行時間型質量分離器、四重極マスフィルタなどを利用することができる。また、イオン化法も特に問わず、例えばマトリクス支援レーザ脱離イオン化法、エレクトロスプレイイオン化法などの大気圧イオン化法など、適宜のイオン化法を用いることができる。

特定フラグメントイオン推定部により実施される特定フラグメントイオン推定ステップでは、例えば与えられたフラグメントイオンのマススペクトルについてピークを検出し、各ピークに対応する質量電荷比をフラグメントイオンの質量情報として取得し、所定の質量差を有するフラグメントイオンのペアを探索する。

同じタンパク質又はペプチドに由来するａ_nイオンとｃ_nイオンとの構造の差は既知であり、１価イオンで且つ安定同位体を考えた場合、ｃ_nイオンはａ_nイオンに比べて理論的に４５Daだけ質量が大きい。またｘ_nイオンとｚ_nイオンとの関係も同様であり、ｘ_nイオンはｚ_nイオンに比べて理論的に４２Daだけ質量が大きい。そこで、基本的には質量差が４５Da又は４２Daであるペアピークを探索すればよいが、安定同位体以外の同位体の存在やＨＡＤに際してイオンから一部の水素が脱離したり逆に水素が付加されたりする現象を考慮すると、或る程度の幅を持った質量差を探索することが望ましい。実験に基づく検討によれば、フラグメントイオンのマススペクトル上で観測されるａ_nイオンとｃ_nイオン又はｘ_nイオンとｚ_nイオンのペアピークの質量差は４０〜４６Daの範囲にほぼ収まるから、最大でもこの質量差の範囲のベアピークを探索すればよい。また、１価イオンでなく２価以上の多価イオンのペアピークを探索する場合には、上記質量差を価数で除した質量差を指標として探索を行えばよい。

なお、ａ系列イオンとｃ系列イオンとのペア又はｘ系列イオンとｚ系列イオンとのペアのいずれが観測されるのかは、元のタンパク質やペプチドに含まれるアミノ酸残基の種類とそのアミノ酸残基が存在する位置に依存する。そこで、特定のアミノ酸残基が特定の位置に存在することが推定される場合には、その推定に基づいて観測されるペアピークがａ系列イオンとｃ系列イオンとのペア又はｘ系列イオンとｚ系列イオンとのペアであると判断すればよい。また、ａ系列イオンとｃ系列イオンとのペア又はｘ系列イオンとｚ系列イオンとのペアのいずれか絞ることができない場合には、その両方を仮定したうえでアミノ酸配列の推定や同定を実行し、その過程で蓋然性の高いほうを選択すればよい。

また、上述したように、ＨＡＤによって得られたフラグメントイオンのマススペクトルには、ｃ系列イオンとａ系列イオンとのペアピーク、又はｚ系列イオンとｘ系列イオンとのペアピークが特徴的に観測されるが、多くの場合、ｃ系列イオンはａ系列イオンより信号強度が高く、ｚ系列イオンはｘ系列イオンより信号強度が高い。そこで、この現象を利用して、本発明に係るタンパク質又はペプチドの解析方法及び解析装置では、フラグメントイオンのペアを探索する際に、質量差とともに各フラグメントイオンの信号強度も参照するとよい。

具体的には、ペアとなるｃ_nイオンはａ_nイオンよりも質量が大きく（つまりマススペクトル上では右方にｃ_nイオンピークが出現し）且つ信号強度が高くなると考えられるから、マススペクトル上で上記質量差を有し且つ右方に位置するピークの信号強度が左方に位置するピークの信号強度よりも高いことを条件としてａ系列イオンとｃ系列イオンのペアピークを探索すればよい。また、ペアとなるｘ_nイオンはｚ_nイオンよりも質量が大きく（つまりマススペクトル上では右方にｘ_nピークが出現し）且つ信号強度が低くなると考えられるから、マススペクトル上で上記質量差を有し且つ左方に位置するピークの信号強度が右方に位置するピークの信号強度よりも高いことを条件としてｘ系列イオンとｚ系列イオンのペアピークを探索すればよい。これにより、ペアピークの探索の正確性を向上させることができる。

本発明に係るタンパク質又はペプチドの解析方法によれば、ＨＡＤを用いて取得したタンパク質やペプチド由来のフラグメントイオンの質量情報の中から、特定の系列のイオン、即ち、ａ系列イオン及びｃ系列イオン、又はｘ系列イオン及びｚ系列イオンを容易に且つ的確に識別することができる。それによって、フラグメントイオンの帰属の精度が向上するため、フラグメントイオンの情報を利用したタンパク質やペプチドのアミノ酸配列の決定や同定の精度も向上し、例えば同定不能となる確率を低減させることができる。

本発明の一実施例であるタンパク質解析装置の概略構成図。 Substance PについてＨＡＤを用いて取得したフラグメントイオンのマススペクトル、並びにSubstance Pのアミノ酸配列及び帰属された各系列イオンを示す図。 図２に示したマススペクトルの一部の拡大図。 N-Acetyl-Renin Substrate Tetradecapeptide porcineについてＨＡＤを用いて取得したフラグメントイオンのマススペクトル、並びにN-Acetyl-Renin Substrate Tetradecapeptide porcineのアミノ酸配列及び帰属された各系列イオンを示す図。 BradykininについてＨＡＤを用いて取得したフラグメントイオンのマススペクトル、並びにBradykininのアミノ酸配列及び帰属された各系列イオンを示す図。 Fibrinopeptide AについてＨＡＤを用いて取得したフラグメントイオンのマススペクトル、並びにFibrinopeptide Aのアミノ酸配列及び帰属された各系列イオンを示す図。

本発明に係るタンパク質又はペプチドの解析方法及び解析方法の一実施例について、添付図面を参照して説明する。
図１は本発明の一実施例であるタンパク質解析装置の概略構成図である。

このタンパク質解析装置は質量分析装置を含み、質量分析装置は、目的試料成分をイオン化するイオン源１と、イオン源１で生成されたイオンを高周波電場の作用により捕捉するイオントラップ２と、イオントラップ２から射出されたイオンを質量電荷比に応じて分離する飛行時間型質量分離部３と、分離されたイオンを検出するイオン検出器４とを、真空雰囲気に維持される図示しない真空チャンバの内部に備える。また、質量分析装置は、イオントラップ２内に捕捉されているイオンを解離させるべく該イオントラップ２内に水素ラジカルを導入するための水素ラジカル照射部５と、イオントラップ２内に所定のガスを供給するガス供給部６と、トラップ電圧発生部７と、制御部８と、を有する。イオン検出器４による検出信号はデータ処理部９に入力される。データ処理部９は、本実施例の解析装置に特徴的な解析処理を行うものであり、マススペクトル作成部９１、ペアピーク探索部９２、タンパク質同定部９３を機能ブロックとして含む。

イオン源１は例えば、ＭＡＬＤＩ法などのイオン化法を用いたイオン源である。イオントラップ２は、円環状のリング電極２１と、該リング電極２１を挟んで対向配置された一対のエンドキャップ電極２２、２４と、を含む３次元四重極型のイオントラップである。制御部８による指示に応じてトラップ電圧発生部７は、上記電極２１、２２、２４それぞれに対し、所定のタイミングで高周波電圧、直流電圧のいずれか一方又はそれらを合成した電圧を印加する。飛行時間型質量分離部３はこの例ではリニア型であるが、リフレクトロン型やマルチターン型等でもよく、また飛行時間型の質量分離器ではなく、例えばイオントラップ２自体のイオン分離機能を利用して質量分離を行うものやオービトラップなどでもよい。

水素ラジカル照射部５は、水素ラジカルを貯留した又は水素ラジカルを生成する水素ラジカル供給源５１と、流量を調節可能であるバルブ５２と、水素ラジカルを噴出するノズル５３と、ノズル５３からの噴出流の中心軸上に開口を有し、拡散する水素分子等のガスを分離して細径の水素ラジカル流を取り出すスキマー５４と、を含む。ガス供給源６１は、クーリングガスや場合によってはＣＩＤガスとして使用されるヘリウム、アルゴンなどを貯留したガス供給源６１と、流量を調節可能であるバルブ６２と、を含む。

本実施例のタンパク質解析装置における分析動作を説明する。
イオン源１においてペプチド混合物などの試料から生成された各種イオンはパケット状にイオン源１から射出され、入口側エンドキャップ電極２２に形成されているイオン導入孔２３を経てイオントラップ２の内部に導入される。イオントラップ２内に導入されたペプチド由来のイオンは、トラップ電圧発生部７からリング電極２１に印加される電圧によってイオントラップ２内に形成される高周波電場に捕捉される。そのあと、トラップ電圧発生部７からリング電極２１等に所定の電圧が印加され、それによって目的とする特定の質量電荷比を有するイオン以外のイオンは励振され、イオントラップ２から排除される。これにより、イオントラップ２内に、特定の質量電荷比を有するプリカーサイオンが選択的に捕捉される。

それに続き、ガス供給部６においてバルブ６２が開放され、イオントラップ２内にクーリングガスとしてヘリウムなどの不活性ガスが導入されることで、プリカーサイオンのクーリングが行われる。これにより、プリカーサイオンはイオントラップ２の中心付近に収束される。その状態で、水素ラジカル照射部５のバルブ５２が開放され、水素ラジカル（水素原子）を含むガスがノズル５３から噴出する。その噴出流の前方に位置するスキマー５４により、水素ガスなどのガスは除去され、スキマー５４の開口を通過した水素ラジカルは細径のビーム状となって、リング電極２１に穿設されているラジカル粒子導入口２６を通過する。そして、この水素ラジカルはイオントラップ２内に導入され、イオントラップ２内に捕捉されているプリカーサイオンに照射される。

このときバルブ５２の開度は、イオンに照射される水素ラジカルの流量が所定流量以上になるように調整される。また、水素ラジカルの照射時間も適宜に設定される。それによって、プリカーサイオンは不対電子誘導型の解離を生じ、ペプチド由来のフラグメントイオンが生成される。水素ラジカルによるイオンの解離、つまりＨＡＤのメカニズムは、ペプチド分子イオン中のカルボニル酸素に水素が付着することでラジカルイオンが生成され、このラジカルイオンの作用でＥＴＤやＥＣＤと同様の反応で解離が生じるものであると推測される。ＨＡＤにより生成された各種フラグメントイオンはイオントラップ２内に捕捉され、クーリングが行われる。

そのあと、所定のタイミングでトラップ電圧発生部７からエンドキャップ電極２２、２４に直流高電圧が印加され、これにより、イオントラップ２内に捕捉されていたイオンは加速エネルギを受け、イオン射出孔２５を通して一斉に射出される。こうして一定の加速エネルギを持ったイオンが飛行時間型質量分離部３の飛行空間に導入され、飛行空間を飛行する間に質量電荷比に応じて分離される。イオン検出器４は分離されたイオンを順次検出する。イオン検出器４からの検出信号を受けたデータ処理部９において、マススペクトル作成部９１はイオントラップ２からのイオンの射出時点を時刻ゼロとする飛行時間スペクトルを作成する。そして、予め求めておいた質量校正情報を用いて飛行時間を質量電荷比に換算することにより、フラグメントイオンによるマススペクトルを作成する。

こうして得られたマススペクトルにはタンパク質やペプチドに由来する各種のフラグメントイオンピークが観測されるが、ＨＡＤによるイオン解離を行った場合、ａ系列イオンとｃ系列イオンとのペアピーク、又はｘ系列イオンとｚ系列イオンとのペアピークが特徴的に観測される。このことを、実測例を参照しつつ以下に説明する。

実測に用いたサンプルは次の４種類である。
＜サンプルＡ＞サブスタンスＰ（Substance P）
アミノ酸配列：［ＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭ−ＮＨ₂］、分子量：1347.6
＜サンプルＢ＞N-Acetyl-Renin Substrate Tetradecapeptide porcine
アミノ酸配列：［Ａｃ−ＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬＬＹＳ］、分子量：1801.1
＜サンプルＣ＞ブラディキニン（Bradykinin）
アミノ酸配列：［ＲＰＰＧＦＳＰＦＲ］、分子量：1060.21
＜サンプルＤ＞フェブリノペプチドＡ（Fibrinopeptide A）
アミノ酸配列：［ＡＤＳＧＥＧＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ］、分子量：1536.56
また、ＭＡＬＤＩ用サンプル調製に利用したマトリクスは、α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid（ＣＨＣＡ）と3-Aminoquinokine/α-cyano-4-hydroxycinnamic acid（３ＡＱ／ＣＨＣＡ）とである。また、測定に使用した質量分析装置は、図１に示したような、水素ラジカル粒子照射機構を具備したＭＡＬＤＩデジタルイオントラップ飛行時間型質量分析計（MALDI-DIT-TOF MS：島津製作所製）である。

図２、図４、図５、及び図６にはそれぞれ、実測で得られたサンプルＡ〜Ｄのフラグメントイオンのマススペクトルを示す。また図３は図２に示したマススペクトルの一部拡大図である。また、図２、図４、図５、及び図６においてマススペクトルの上部には、各サンプルのアミノ酸配列と帰属されたａ系列、ｃ系列、ｘ系列、ｚ系列イオンを示している。なお、図２〜図６では、本来であれば下付き文字で示すべき各系列イオンの添字を通常の大きさの文字で示している。

図３から分かるように、ＨＡＤによるイオン解離では、フラグメントイオンの理論質量に対して数ダルトン（Da）高い又は逆に数ダルトン低いフラグメントイオンも観測される。しかしながら、理論質量から乖離したイオンが単独で観測されることは殆どなく、理論質量と一致するイオンとその理論質量から数ダルトンの範囲内で乖離したイオンとが混在して観測される。そこで、図２〜図６では、理論質量から乖離しているフラグメントイオンについては各イオン種を示す記号（例えば「ｃ₄」）の後に＋１や−１というように、乖離している質量（つまりは理論質量からの質量差）を記載している。非特許文献２には、理論質量から質量が乖離しているこれらのフラグメントイオンは、フラグメンテーション時におけるフラグメントイオン間での水素転移に由来するということが報告されている。またそれだけでなく、ＨＡＤによる水素の付加反応又は脱離反応に由来するフラグメントイオンも含まれると推定される。さらにまた、安定同位体以外の同位体元素の影響により、１Da単位（１価イオンの場合）で安定同位体のみを考慮した理論質量から乖離した質量を持つイオンも含まれる。

図２〜図５に示したように、これらマススペクトルにおいては、ｃ系列イオンとａ系列イオンとがそれぞれペアピークとして検出されていることが分かる。なお、図４、図５からも分かるように、プロリン（Ｐ）のＮ末端側ではｃ系列イオンが生じないという特徴がある。ペアであるｃ系列イオンとａ系列イオンの理論的な質量差は４５Daであるが、本発明者らがこれまで実験的に確認しているところでは、測定で検出されたａ系列イオン及びｃ系列イオンにおいて理論質量からの質量の乖離は、ａ系列イオンで−１〜＋３Da、ｃ系列イオンで−２Da〜＋１Daの範囲にほぼ収まる。ａ系列イオンはａn+2、ｃ系列イオンはｃnが生成しやすい傾向があるため、ａ系列イオンとｃ系列イオンのペアピークの質量差は４３Da（＋３Da〜−２Da）つまりは４１〜４６Daの範囲にほぼ収まるということができる。

一方、図６に示したサンプルＤに対するマススペクトルでは、Ｃ末端側を含むフラグメントイオンであるｚ系列イオン及びｘ系列イオンがそれぞれペアピークとして多数検出されていることが分かる。ｚ系列イオンとｘ系列イオンとの理論的な質量差は４２Daであるが、本発明者らがこれまで確認しているところでは、測定で検出されたｚ系列イオン及びｘ系列イオンにおいて理論質量からの質量の乖離は、ｚ系列イオンで−１〜＋２Da、ｘ系列イオンで−１Da〜＋３Daの範囲にほぼ収まる。ｚ系列イオンはｚn+1、ｘ系列イオンはｘn+2が生成しやすい傾向があるため、ｘ系列イオンとｚ系列イオンのペアピークの質量差は４３Da（＋２Da〜−３Da）つまりは４０〜４５Daの範囲にほぼ収まるということができる。

ａ系列イオンとｃ系列イオンのペア又はｘ系列イオンとｚ系列イオンのペアのいずれが検出されるのかは、ペプチドに含まれるアミノ酸残基の種類とペプチド内でそのアミノ酸残基が存在する位置とに依存する。例えば、正イオンモードによる質量分析では、正の電荷を保持し易い塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）がぺプチドのＮ末端側に位置するとａ系列イオンとｃ系列イオンのペアが検出され易くなり、同じ塩基性アミノ酸がＣ末端側に位置するとｘ系列イオンとｚ系列イオンのペアが検出されやすくなるという傾向がみられる。サンプルＡ、Ｂ、Ｃではいずれもアルギニン（Ｒ）がぺプチドのＮ末端側に位置している。一方、サンプルＤではアルギニンがぺプチドのＣ末端側に位置している。したがって、こうした特定のアミノ酸残基がペプチドに含まれており、その位置が推定可能であるような場合には、フラグメントイオンのマススペクトルで観測されるペアピークがａ系列イオンとｃ系列イオンのペア又はｘ系列イオンとｚ系列イオンのペアのいずれであるのかを推測することができる。

上述したように、観測されるペアピークがａ系列イオンとｃ系列イオンのペア又はｘ系列イオンとｚ系列イオンのペアのいずれか不明であっても、１価イオンのみを考慮する場合には、質量差４３Da±３Da程度の範囲つまりは質量差が４０〜４６Daの範囲に収まるペアピークを探索することで、マススペクトルに出現するフラグメントイオンピークの中でａ系列イオンとｃ系列イオン又はｘ系列イオンとｚ系列イオンを推定することができる。もちろん、この４３Da±３Daという質量差は１価イオンを想定したものであり、２価以上の多価イオンのペアピークを探索する場合には、上記質量差を価数で除した値を指標としてペアピークを探索すればよい。

本実施例のタンパク質解析装置においては、マススペクトル作成部９１においてフラグメントイオンのマススペクトルが作成されると、ペアピーク探索部９２が上述した質量差（例えば４３Da±３Daの範囲の質量差）を有するペアピークを全て探索し抽出する。そして、その抽出されたペアピークに対応するフラグメントイオンがａ系列イオンとｃ系列イオン又はｘ系列イオンとｚ系列イオンであるとの情報をタンパク質同定部９３に入力する。タンパク質同定部９３はデータベース検索を用いて又はデノボシーケンシングを用いて、タンパク質・ペプチドのアミノ酸配列の決定及びタンパク質・ペプチドの同定を行うものである。

タンパク質同定部９３においてデータベース検索を用いてアミノ酸配列の決定及び同定を行う場合、そのデータベース検索の際にマススペクトルから検出される各フラグメントイオンの質量情報を利用するが、ここでは上述したａ系列／ｃ系列イオン又はｘ系列／ｚ系列イオンであるとの情報も併せて利用する。即ち、これらの情報が付加されているフラグメントイオンについては、ａ系列／ｃ系列イオンとｘ系列／ｚ系列イオンとの２通りを仮定してデータベース検索を実行する。もちろん、ａ系列／ｃ系列イオンとｘ系列／ｚ系列イオンとのいずれかの推定が可能である場合には、２通りを仮定せずに一方のみに絞ったデータベース検索を行えばよい。上述のように２通りを仮定してデータベース検索を行った場合、最終的にａ系列／ｃ系列イオンとｘ系列／ｚ系列イオンのいずれが正解であるかが明らかになるが、その場合でもフラグメントイオン種を全く絞り込まない場合と比べれば同定精度は明らかに向上する。

また、タンパク質同定部９３においてデノボシーケンシング解析を行う場合には、ａ系列／ｃ系列イオンとｘ系列／ｚ系列イオンのいずれかに絞り込めていなくても、連続したａ系列／ｃ系列イオン又はｘ系列／ｚ系列イオンが検出されるため、ａ系列／ｃ系列イオン又はｘ系列／ｚ系列イオンのどちらかを仮定して、ピーク間の質量差をアミノ酸残基の質量に当てはめていけばペプチドのアミノ酸配列を推定することができる。この場合にも、フラグメントイオンの系列が不明である場合に比べればアミノ酸配列の推定精度は明らかに向上する。

なお、上記実施例では、質量差のみに着目して特定の系列のフラグメントイオンのペアを探索していたが、図２〜図６に示したマススペクトルを見れば分かるように、殆どの場合、ペアであるｃ系列イオンの信号強度（ピーク強度）はａ系列イオンの信号強度よりも高く、同じくペアであるｚ系列イオンの信号強度はａ系列イオンの信号強度よりも高い。そこで、質量差のほかに信号強度の高低も利用してペアピークを探索すると、より効率良く且つ的確にペアピークを見つけることができる。即ち、ａ系列／ｃ系列イオンのペアを探索する際には、所定の質量差を有し質量電荷比が高い側のピークが低い側のピークよりも信号強度が高いペアを探索すればよい。一方、ｘ系列／ｚ系列イオンのペアを探索する際には、所定の質量差を有し質量電荷比が低い側のピークが高い側のピークよりも信号強度が高いペアを探索すればよい。

また、図３に示したように、一つのフラグメントイオンのピークは孤立したピークではなく、通常、質量が異なる複数のピークから成るピーク群である。ペアピークの質量差を調べる際には、一つのピーク群の中で信号強度が最大であるピークを用いればよいが、その代わりに、一つのピーク群に含まれる複数のピークをスムージング処理することでピーク幅の広い一つのピークを求め、そのピークのピークトップ間の質量差を調べるようにしてもよい。また、その際にはピークの重心位置を求め、その重心位置に対応する質量電荷比から質量差を調べるようにしてもよい。

また、特に価数の大きな多価イオンも考慮する必要がある場合には、価数の相違するフラグメントイオンピークが混じるためにマススペクトルが非常に複雑になり、ペアピークの探索が困難になる。そこで、その場合には、デコンボリューション処理を行うことで多価イオンの価数を求め、１価イオンに換算したマススペクトルを再構成して上述したような処理を行うとよい。

また、本実施例のタンパク質解析装置における質量分析装置の構成は適宜に変形することができる。例えば、イオントラップは３次元四重極型のイオントラップでなく多重極リニア型イオントラップでもよい。また、イオントラップの代わりに、磁場の作用によりイオンを閉じ込めるフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析装置のセルなどに閉じ込めたイオンに対して水素ラジカルを照射するようにしてもよい。もちろん、そうした所定の空間に閉じ込められたイオンではなく、例えばイオン流に対してそれに斜交するように又はその流れと同方向若しくは逆方向に水素ラジカルを照射し、イオンを解離させるようにしてもよい。

さらにまた、上記実施例は本発明の一例にすぎず、上記記載以外の点について、本発明の趣旨の範囲で適宜、変形、追加、修正を行っても、本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。

１…イオン源
２…イオントラップ
２１…リング電極
２２、２４…エンドキャップ電極
２３…イオン導入孔
２５…イオン射出孔
２６…ラジカル粒子導入口
３…飛行時間型質量分離部
４…イオン検出器
５…水素ラジカル照射部
５１…水素ラジカル供給源
５２…バルブ
５３…ノズル
５４…スキマー
６…ガス供給部
６１…ガス供給源
６２…バルブ
７…トラップ電圧発生部
８…制御部
９…データ処理部
９１…マススペクトル作成部
９２…ペアピーク探索部
９３…タンパク質同定部

Claims (4)

1. タンパク質若しくはペプチドを同定する又はそのアミノ酸配列を決定するための解析方法であって、
   a)目的とするタンパク質又はペプチド由来のイオンに水素ラジカルを照射することで該イオンを解離させ、それにより生成されたフラグメントイオンを質量分析することでフラグメントイオンの質量情報を収集する質量分析ステップと、
   b)前記質量分析ステップで得られたフラグメントイオンの質量情報について、所定の質量差を有するフラグメントイオンのペアを探索することで、ａ系列イオン及びｃ系列イオン、又は、ｘ系列イオン及びｚ系列イオンを推定する特定フラグメントイオン推定ステップと、
   を有し、前記特定フラグメントイオン推定ステップで推定されたイオンの情報をタンパク質若しくはペプチドの同定又はそのアミノ酸配列の決定に利用することを特徴とするタンパク質又はペプチドの解析方法。
2. 請求項１に記載のタンパク質又はペプチドの解析方法であって、
   前記特定フラグメントイオン推定ステップでは、最大４０〜４６Daの範囲の質量差を有するフラグメントイオンのペアを探索することを特徴とするタンパク質又はペプチドの解析方法。
3. 請求項１又は２に記載のタンパク質又はペプチドの解析方法であって、
   前記特定フラグメントイオン推定ステップでは、フラグメントイオンのペアを探索する際に、質量差とともに各フラグメントイオンの信号強度も参照することを特徴とするタンパク質又はペプチドの解析方法。
4. タンパク質若しくはペプチドを同定する又はそのアミノ酸配列を決定するための解析装置であって、
   a)目的とするタンパク質又はペプチド由来のイオンに水素ラジカルを照射することで該イオンを解離させ、それにより生成されたフラグメントイオンを質量分析することでフラグメントイオンの質量情報を収集する質量分析実行部と、
   b)前記質量分析実行部で得られたフラグメントイオンの質量情報について、所定の質量差を有するフラグメントイオンのペアを探索することで、ａ系列イオン及びｃ系列イオン、又は、ｘ系列イオン及びｚ系列イオンを推定する特定フラグメントイオン推定部と、
   c)前記特定フラグメントイオン推定部で推定されたイオンの情報を利用しつつ目的とするタンパク質若しくはペプチドの同定又はそのアミノ酸配列の決定を行う解析実行部と、
   を備えることを特徴とするタンパク質又はペプチドの解析装置。

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