CN110494955B - 离子分析装置及离子裂解方法 - Google Patents

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Abstract

在离子阱(2)的内部捕捉到前体离子后，自电子照射部(7)将30eV以上的高能量的电子导入到离子阱(2)内，利用电子与离子的相互作用来使该离子的价数增加。接着，自氢自由基照射部(5)使氢自由基进入到离子阱(2)内，通过HAD法使离子裂解。在HAD法中，离子的价数越高，裂解效率越高。因此，即使在使用例如MALDI离子源那样几乎只生成1价离子的离子源的情况下，也能够在离子阱(2)内使前体离子的价数增加，从而提高裂解效率。

Description

离子分析装置及离子裂解方法
技术领域
本发明涉及将源自试样成分的离子捕捉到离子阱内后使该捕捉到的离子以1阶段或多阶段裂解并且对通过该裂解所生成的离子进行分析的离子分析装置及用于该离子分析装置的离子裂解方法。此处所说的离子分析装置包括质谱分析装置或者离子迁移率分析装置，质谱分析装置利用离子阱自身或利用外部的质量分离器，将离子根据质荷比进行分离并检测，离子迁移率分析装置利用外部的离子迁移率计，将离子根据迁移率进行分离并检测。
背景技术
为了鉴定高分子化合物或解析其结构，近年来，广泛利用如下的质谱分析法：将作为目标的源自化合物的离子捕捉到离子阱的内部后进行1阶段或多阶段裂解，将由此生成的产物离子(碎片离子)根据质荷比进行分离并检测。作为用于这种质谱分析的装置，周知有：利用离子阱自身进行质谱分析的离子阱型质谱分析装置、自离子阱排出产物离子并利用外部的飞行时间型质谱仪对该产物离子进行质谱分析的离子阱飞行时间型质谱分析装置等。
在这种质谱分析装置中，作为将分子量大的离子裂解的方法，使利用电场的作用进行共振激发所得到的离子与氩等气体碰撞而诱发裂解的碰撞诱导裂解(CID＝CollisionInduced Dissociation)法是最常见的，除此之外，还已知有红外多光子吸收裂解(IRMPD＝Infrared Multi-Photon Dissociation)法、紫外光裂解(UVPD＝UltraViolet PhotoDissociation)法、电子转移裂解(ETD＝Electron Transfer Dissociation)法、电子捕获裂解(ECD＝Electron Capture Dissociation)法等各种各样的裂解法。
使蛋白质、肽等源自生物试样的高分子化合物的离子裂解时，广泛使用ETD法、ECD法。
在ETD法中，将负的分子离子作为反应离子照射到离子阱内，使其在离子阱内与源自试样成分的离子碰撞而产生相互作用。通过该相互作用而使反应离子的电子移动至源自试样成分的离子的质子，该质子转化为氢自由基。由该反应生成的离子的自由基种类(radical species)进行键特异性裂解。另一方面，在ECD法中，将1eV左右的低能量的电子照射到离子阱内，在离子阱内在源自试样成分的离子的质子上加成电子。由此，该质子转化为氢自由基，由该反应生成的离子的自由基种类进行键特异性裂解。
ETD法、ECD法与CID法等碰撞性裂解法不同，是不成对电子诱导型的裂解法，因此肽主链的N-Cα键的断裂特异性地发生。因此，积极生成难以通过CID法生成的c/z系列的碎片离子。另外，以保持有糖链等修饰部位的状态发生裂解，因此容易进行修饰物的鉴定、修饰部位的确定。由此，ETD法、ECD法对于生物高分子化合物的综合结构解析是有用的。
另外，本发明人等开发了氢附着裂解法(Hydrogen-Attachment Dissociation、以下简称为HAD法)作为新型的离子裂解法，并在专利文献1、非专利文献1等中提出。简单地说，HAD法是使氢自由基(＝氢原子)附着于离子并时该离子裂解的方法，可认为其裂解机理自身与ECD法、ETD法类似。即，HAD法也是一种不成对电子诱导型的离子裂解法，具有与ETD法、ECD法同样的优点。
如上所述，ETD法、ECD法具有对生物高分子化合物的结构解析有利的特征，但在理论上只能进行2价以上的多价离子的裂解。这是因为，源自试样成分的1价离子在自由基反应后很快就变成中性。另外，已知：即使价数为2以上，对于低价数(大约6价左右以下)的离子，裂解效率也低，得不到足够用于结构解析的信息。
与此相对，HAD法中利用的氢自由基为中性，不存在伴随裂解而分子离子的价数减少的情况，因此在理论上可应用于包括1价在内的所有离子。然而，实际上，在HAD法中也是前体离子的价数越高，裂解效率越高，若前体离子为低价数，则难以得到足够用于结构解析的信息。
图12为以源自泛素(Ubiquitin)的1价离子为前体离子并通过HAD法进行裂解所得到的MS/MS谱(产物离子谱)。由图12可知，几乎检测不到本应通过裂解而生成的产物离子。另一方面，图13为以使用电喷雾离子化(ESI)法将试样成分离子化而生成的源自泛素的13价离子为前体离子并通过HAD法进行裂解所得到的MS/MS谱。在图13中能够清楚地确认到有益于结构解析的各种产物离子。由该结果可知，在HAD法中，对于低价数的前体离子的裂解效率低。
如上所述，在使用HAD法、ETD法及ECD法的MS/MS分析中，若前体离子的价数低则裂解效率低，因此期望前体离子的价数高。然而，通常离子的价数取决于离子化法的种类、样品的碱度、质量值等，因此也常有只生成1价～2价左右的低价数的离子的情况。特别是在进行将碱性氨基酸残基(精氨酸及赖氨酸)的N末端侧的肽键切断的利用胰蛋白酶的消化法等前处理的情况下，由于样品的碱度低，因此难以得到多价离子。另外，基于基质辅助激光解吸离子化(MALDI)法等的特定离子化法中，通常只能得到1价离子。因此，当想要利用HAD法、ETD法或ECD法以使离子裂解时，样品的前处理法、离子化法大幅受到限制。
作为改善这种离子裂解法对低价数离子的裂解效率的方法，以往已知有通过使气体与前体离子碰撞或对前体离子照射红外激光来提高该离子的内能的方法(参照非专利文献2)。然而，这种方法难以调整所施加的能量，若前体离子的内能变得过高，则存在翻译后修饰发生脱离等、结构解析所需的信息丢失的担心。
图14为以1价的肽离子为前体离子并通过HAD法进行裂解所得到的MS/MS谱。(a)为在HAD反应中自外部对离子阱内的离子照射比最佳激光强度弱约10％的红外激光所得到的结果。另外，(b)为照射最佳激光强度的红外激光所得到的结果，(c)为照射比最佳激光强度强约10％的红外激光所得到的结果。如图14的(b)所示，在激光强度最佳的情况下，清楚地观测到对结构解析有用的产物离子，但在激光强度弱的情况下(参照(a))，有用的产物离子的强度非常低。另一方面，在激光强度强的情况下(参照(c))，出现许多无助于结构解析的源自其它产物离子的峰。
如此自外部对前体离子施加的能量只是比最佳值稍有增减，裂解效率就显著降低。另外，施加的能量的最佳值取决于肽的氨基酸序列、向离子阱内导入的缓冲气体的压力等，因此难以在测定时将施加能量调整为最佳。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2015/133259号
专利文献2：美国专利申请公开第2008/0035841号说明书
专利文献3：美国专利申请公开第2017/0221694号说明书
非专利文献
非专利文献1：高桥(H.Takahashi)，其他6人，“Hydrogen Attachment/Abstraction Dissociation(HAD)of Gas-Phase Peptide Ions for Tandem MassSpectrometry”，Analytical chemistry，2016年，Vol.88，No.7，pp.3810-3816
非专利文献2：R.A.Zubarev，其他7人，“Electron capture dissociation forstructural characterization of multiply charged protein cations”，Analyticalchemistry，2000年，Vol.72，No.3，pp.563-573
非专利文献3：B.A.Budnik，其他1人，“MH 2+ion production from protonatedpolypeptides by electron impact:observation and determination of ionizationenergies and a cross-section”，Chemical Physics Letters，2000年，Vol.316，No.1，pp.19-23
非专利文献4：Y.M.Eva Fung，其他2人，“Electron ionization dissociation ofsingly and multiply charged peptides”，Journal of the American ChemicalSociety，2009年，Vol.131，No.29，pp.9977-9985
非专利文献5：Donald Rapp，其他2人，“Cross Sections for DissociativeIonization of Molecules by Electron Impact”，Journal of Chemical Physics，1965年，Vol.42，pp.4081
非专利文献6：K.Breuker，其他4人，“Detailed unfolding and folding ofgaseous ubiquitin ions characterized by electron capture dissociation”，Journal of the American Chemical Society，2002年，Vol.124，No.22，pp.6407-6420
非专利文献7：Cs Koncz，其他1人，“Calculated cross sections for thesingle ionization of fullerenes by electron impact”，Nuclear Instruments andMethods in Physics Research Section B，1997年，Vol.124，No.2，pp.435-437
非专利文献8：Luciano H.Di Stefano，其他2人，“Size-Dependent HydrogenAtom Attachment to Gas-Phase Hydrogen-Deficient Polypeptide Radical Cations”，Journal of the American Chemical Society，2018年，Vol.140，No.2，pp.531？533，DOI:10.1021/jacs.7b10318
发明内容
发明要解决的问题
本发明是为了解决上述问题而做出的，其主要目的在于提供一种在使离子裂解时即使作为目标的源自试样成分的前体离子的价数低的情况下也能够实现高裂解效率的离子分析装置及离子裂解方法。
另外，本发明的另一目的在于提供如下的离子分析装置及离子裂解方法：不仅提高前体离子的裂解效率，而且能够可靠地获得对于推断例如蛋白质、肽之类的生物高分子化合物等的结构而言重要的信息。
用于解决问题的方案
解决上述问题的方案之一为将作为目标的源自试样成分的前体离子捕捉到离子分析装置内，使其价数增加来提高前体离子的裂解效率。作为使离子的价数增加的一个方法，以往已知有对离子照射电子来通过与电子离子化法类似的机理使价数增加的方法。非专利文献3、4中示出了以下内容：通过对于被磁场约束型的FT-ICR离子阱捕捉到的前体离子照射具有几十eV左右的能量的电子，从而实现价数的增加。但是，该价数的增加最多为1、2价左右，而且价数增加的效率只有百分之几。本发明人猜想其主要原因为如下两个。
(1)由于电子照射而价数增加的离子通常能量过剩，但在FT-ICR室内的气压极低(1×10-5Pa以下)，因此几乎不进行由与气体碰撞所带来的内能的稳定化(冷却)。因此，受到电子照射的前体离子大多在价数增加至高价数之前因过剩的内能发生断裂，难以以高价数的前体离子的形态存在。
(2)在使用磁场约束的FT-ICR室中阱内的虚拟电势低。因此，当具有高能量的电子与前体离子碰撞时，该离子的能量超过虚拟电势，因此该离子有时从离子阱中逸脱。
本发明人着眼于以下情况：在利用了电场的约束的四极杆型的离子阱中，由电子照射得到的前体离子的价数增加效果低的如上所述的原因不会造成严重的问题。即，在通常的四极杆型离子阱中，为了对捕捉到的离子进行冷却而向离子阱内导入冷却气体，因此，离子阱内部的气压不像FT-ICR室那样低，内能增加的离子在短时间内被冷却。另外，通常的四极杆型离子阱的虚拟电势比磁场约束型的FT-ICR室高得多，很难想象受到电子照射的离子会从阱中逸脱。本发明人基于这种见解而想到将通过电子照射增加价数的技术结合到电场约束型的离子阱中，并且通过实验确认了其效果，由此完成了本发明。
即，为了解决上述问题而做出的本发明的第一方式所涉及的离子分析装置使源自试样成分的离子在离子阱的内部裂解，对由此生成的产物离子进行分析，所述离子分析装置具备：
a)四极杆型的离子阱，其利用高频电场的作用来捕捉源自试样成分的离子；
b)电子照射部，其对被所述离子阱捕捉到的作为裂解对象的离子照射具有30eV以上的能量的电子；以及
c)裂解促进部，其使与由所述电子照射部产生的电子发生了相互作用的离子裂解。
另外，为了解决上述问题而做出的本发明的第一方式所涉及的离子裂解方法使在离子阱的内部捕捉到的源自试样成分的离子裂解，在所述离子裂解方法中，
对利用高频电场的作用在四极杆型的离子阱的内部捕捉到的作为裂解对象的离子照射具有30eV以上的能量的电子，并且，在照射该电子的同时或紧挨着照射该电子后，通过规定的方法使与电子发生了相互作用的离子裂解。
在本发明的第一方式所涉及的离子分析装置及离子裂解方法中，对通过裂解而生成的离子、即产物离子进行分析的方法没有特别限定。即，本发明所涉及的离子分析装置包括对产物离子进行质谱分析的质谱分析装置、对产物离子的离子迁移率进行分析的离子迁移率计等。
另外，上述离子阱可以为包括1个环电极和一对(2个)端盖电极的三重四极杆型的离子阱、以及包括四根杆电极的四极杆型的线性离子阱中的任一者。但是，从容易将离子捕捉到有限的空间内、并且由于在维持着将离子捕捉到该空间内的状态下照射电子而容易调整照射电子的时间的观点出发，优选使用三重四极杆型的离子阱。
在本发明所涉及的离子分析装置及离子裂解方法中，对于由于高频电场的作用而被捕捉到四极杆型离子阱内的前体离子，自电子照射部照射具有30eV以上的适宜的能量的电子。通过照射电子，从而前体离子的内能增加，并且其价数增加。非专利文献5中记载了以下内容：在电子离子化法中，通过照射具有30eV以上的能量的电子，使离子化效率急剧升高。因此，在本发明中，也能够通过照射具有30eV以上的能量的电子，来使前体离子的价数增加，由此提高前体离子的裂解效率。
在例如使用HAD法作为离子裂解法的情况下，裂解促进部对于通过与电子发生相互作用而价数增加或内能增加的前体离子照射规定流量的氢自由基，由此促进该前体离子的裂解。如上所述，当前体离子的价数增加而变为多价离子时，HAD法等各种裂解法的裂解效率提高。另外，即使在前体离子的价数没有充分增加的情况下，当受到电子照射而前体离子的内能增加时，与不存在利用由电子照射引起的内能的增加的情况相比容易发生裂解。其结果，容易观测到对试样成分的结构解析有用的产物离子。
在本发明所涉及的离子分析装置及离子裂解方法中，由裂解促进部实施的离子的裂解方法代表性地为HAD法、ECD法、ETD法等不成对电子诱导型的裂解法。
在使用ECD法作为离子裂解法的情况下，上述裂解促进部通过对前体离子照射电子来促进该前体离子的裂解，但为了利用ECD法进行裂解而照射的电子的能量最多为1eV左右，与自上述电子照射部照射的电子的能量(30eV以上)完全不同。当然，在照射电子这一点上是相同的，因此可以事先设为能够调整在对在离子阱内部捕捉到的离子照射电子的电子照射部中的电子的能量，在将较高能量的电子导入到离子阱内来增加前体离子的价数后，将较低能量的电子照射于前体离子来促进基于ECD法的裂解。
如上所述，通过使用ECD法等不成对电子诱导型的裂解法，在解析对象的试样为蛋白质、肽等生物高分子化合物的情况下，能够获得对c/z系列的碎片离子、加成有糖链等修饰物的状态的肽片段等的结构解析有用的信息。
另外，非不成对电子诱导型的裂解法、例如CID法、IRMPD法、UVPD法等其它许多的裂解法通常也是前体离子的价数越高，裂解效率越高。因此，由裂解促进部实施的离子的裂解方法也可以是这种裂解法。特别是如果设为所述裂解促进部通过碰撞诱导裂解法使离子裂解，则不需要IRMPD法、UVPD法那样的光学体系统的结构，因此装置的结构变得简单。
在电场约束型的离子阱中，与磁场约束型的离子阱相比，针对离子的虚拟电势高，离子的约束效果高，但是对电子的约束效果低。因此，自电子照射部向离子阱内仅单纯导入电子时，存在以下情况：导入的电子的一部分被浪费，难以充分提高离子阱内的电子密度。若离子阱内的电子密度低，则电子与离子接触的机会少，有难以得到离子的价数增加、内能增加的效果的倾向。
于是，在本发明的第一方式所涉及的离子分析装置及离子裂解方法中，优选的是，使导入到离子阱的一次电子直接作用于离子来促进该离子的价数增加、内能的增加，而且向构成离子阱的电极的内表面照射一次电子，向前体离子照射与该一次电子相应地从该电极的内表面释放出的二次电子。由此，能够使离子阱内部的电子密度提高至对于与前体离子的气相反应而言足够的程度。
另外，被离子阱捕捉到的离子发生振动，但其在离子阱的中心附近存在的概率高。因此，在将一次电子用于与离子的反应的情况下，优选将该电子以在离子阱的中心部聚焦的方式照射。由此，即使在向离子阱导入的电子的量较少的情况下，也能够增加电子与离子接触的机会。
在第一方式所涉及的离子分析装置及离子裂解方法中，在如上述那样使一次电子直接作用于离子的情况下，由于后述那样的理由，电子的能量高得超出必要是不理想的。因此，优选的是，将电子的能量设为约30eV以上，将其上限设为约200eV以下，更优选设为100eV以下。即，优选将电子的能量的范围设定为30eV～100eV左右的范围。另一方面，在将二次电子用于反应的情况下，根据本发明人的实验研究及公知的与二次电子放射系数相关的见解，为了得到充分的价数增加效果，电子的能量优选设为100eV以上，更优选设为125eV，关于其上限，优选的是，设为对于许多金属而言二次电子放射系数低于1的10keV，优选设为5keV，更优选设为3keV，更进一步优选设为2keV。
这种具有高能量的电子直接碰撞于前体离子的情况下，存在以下担忧：该离子的内能变得过高，立即因过剩的能量而发生断裂，从而得不到高价数的前体离子。另外，若离子捕捉的虚拟电势低，则也有受到高能量的电子的碰撞的离子从离子阱中被排出的担心。
与此相对，在电场约束型的离子阱中，为了对被电场约束的离子进行冷却而向离子阱的内部导入冷却气体(通常为非活性气体)，因此内能暂时过剩的前体离子与冷却气体接触而能量减少。因此，不易发生由如上所述的过剩的能量导致的断裂，电子的照射容易带来价数的增加。另外，如上所述，电场约束型的离子阱与磁场约束型的离子阱相比，针对离子的虚拟电势相当高，因此能够还将受到高能量的电子的碰撞的离子捕捉到离子阱内。由此，能够避免前体离子的减少。
如上所述，为了防止离子具有过剩的内能，在本发明所涉及的离子分析装置及离子裂解方法中，优选的是，以使所述离子阱的内部的气压成为约1×10-3[Pa]以上的方式向该离子阱的内部导入规定的气体。由此，能够通过与电子接触而将具有过剩的内能的离子迅速冷却。
在通常的四极杆型的离子阱中，在捕捉离子时，对构成该离子阱的电极施加规定频率的正弦波高电压。在该情况下，离子捕捉用的高频电场的强度伴随时间经过而时时刻刻地变化，因此被约束的离子的势能、二次电子的生成条件时时刻刻地变化。其结果，对于二次电子的生成效率、离子的价数增加反应效率而言最佳的电位状态不是固定的，即使照射相同能量的电子，离子的价数增加、内能的增加有时也不稳定。
因此，在本发明所涉及的离子分析装置及离子裂解方法中，优选的是，还具备电压产生部，所述电压产生部对构成所述离子阱的电极施加矩形波状的高频电压，以形成用于在该离子阱的内部捕捉离子的电场，即，使用数字驱动方式的离子阱作为离子阱(参照专利文献2)。
在该结构中，对构成离子阱的电极施加的电压为二进制，因此被约束的离子的势能成为二进制值。另外，自电极释放出的二次电子的生成条件也成为以二进制变化的状态。因此，对于二次电子的生成效率、离子的价数增加反应效率而言最佳的电位状态在规定的期间内几乎是固定的，能够在使前体离子的价数稳定地增加的基础上或在使前体离子的内能稳定地增加的基础上，使该前体离子裂解。
或者，也可以采取如下构成：在为了捕捉离子而对构成离子阱的电极施加的电压维持着正弦波电压的状态下，对电子照射部施加使构成该离子阱的电极与电子照射部的电位差成为矩形波那样的高频电压。根据该构成，也能够获得与如上所述那样使用数字驱动方式的离子阱的情况同样的效果。
另外，在本发明所涉及的离子分析装置中，可以采用如下构成：还具备氢自由基供给部，该氢自由基供给部用于在所述电子照射部所进行的电子照射时或电子照射后向所述离子阱的内部导入氢自由基。此外，也能够通过例如对氢气照射电子来生成氢自由基。因此，氢自由基供给部不仅包括向离子阱直接供给氢自由基的构件，还包括向离子阱供给氢气并通过电子照射使其发生自由基化的构件。另外，若使用自高温丝释放热电子的构件作为电子照射部，则向离子阱或其附近导入的氢气流出到离子阱外后与高温的钨丝接触，从而生成氢自由基。因此，氢自由基供给部还包括向离子阱和/或其附近供给氢气并使其与丝接触从而生成氢自由基的构件。
根据本发明人的研究，由于电子照射而价数增加的离子成为自由基种类，因此存在以下情况：在这种状态下，为了裂解而照射的氢自由基(HAD法的情况)等发生附着，离子转化为非自由基种类，变得稳定而难以裂解。与此相对，当在电子照射时或电子照射后事先向离子阱内导入氢自由基时，自由基种类的离子转化为非自由基种类，因此之后在为了裂解而照射的氢自由基等的作用下变得容易裂解。由此，根据上述构成，能够提高离子的裂解效率，生成更多量的产物离子。另外，为了使自由基种类的离子转化为非自由基种类而照射氢自由基的情况下，因后述理由而优选照射2000℃以下的氢自由基。
另外，优选采用如下构成：在作为上述构成的离子分析装置中，所述裂解促进部通过碰撞诱导裂解法使离子裂解，在对在所述离子阱的内部生成的产物离子进行质谱分析的质谱分析装置中，获取在向所述离子阱的内部导入了氢自由基时的产物离子谱、以及在不向该离子阱的内部导入氢自由基时的产物离子谱，利用该多个产物离子谱来对试样中的成分进行解析。
在向离子阱内导入了氢自由基时的产物离子谱与在不向离子阱内导入氢自由基时的产物离子谱中，生成的产物离子的系列不同。因此，根据上述构成，能够得到反映出试样成分、特别是受到翻译后修饰的肽的结构的各种产物离子的信息，能够容易且高精度地进行结构解析。
在上述第一方式中，通过电子照射部对前体离子照射电子来使价数增加后，接着利用裂解促进部使离子裂解，但也能够不使用裂解促进部就使离子裂解。即，也能够通过电子的作用使价数增加且内能变高的离子直接裂解。这是利用通过照射高能量的电子所产生的作用来使离子裂解的，被称为电子诱导裂解(EID＝Electron-Induced Dissociation)法(例如专利文献3)。
本发明人认为，与气相色谱仪等中使用的基于电子离子化(EI＝ElectronIonization)法的试样成分的离子化同样地，基于EID法的前体离子的裂解是通过照射高能量的电子而发生的，因此生成的离子也与通过EI法生成的离子类似。在EID法中，无论前体离子的价数如何，都能够高效率地使离子裂解。另外，在EID法中，不是使试样成分离子化，而是使在离子源中由试样成分生成的(前体)离子裂解，因此无论离子源的种类如何，都能够生成与通过EI法生成的离子类似的系统的离子。
另外，EI法在其它离子化法(ESI法、MALDI法)之前已经投入实用，收录有通过对源自多种化合物的离子进行质谱分析所得到的质谱数据的库已经存在，在使用气相色谱质谱联用仪等的试样成分的分析等中被广泛使用。使用该库，将对通过EID法生成的离子进行质谱分析所得到的质谱数据与为了使用气相色谱质谱联用仪等的分析用途而制作出的充实的库进行对照，从而能够进行例如蛋白质、肽那样若不是MALDI离子源等特定的离子源就难以离子化的源自生物试样的化合物的综合结构解析。
即，为了解决上述问题而做出的本发明的第二方式所涉及的离子分析装置使源自试样成分的离子在离子阱的内部裂解，对由此生成的产物离子进行分析，所述离子分析装置具备：
a)四极杆型的离子阱，其利用高频电场的作用来捕捉源自试样成分的离子；
b)电子照射部，其对被所述离子阱捕捉到的作为裂解对象的离子照射具有30eV以上的能量的电子；
c)质谱分析部，其对通过照射所述电子而裂解得到的离子进行质谱分析，来获取质谱数据；
d)库，其收录有针对多个已知化合物通过对利用电子离子化法生成的离子进行质谱分析所得到的质谱数据；以及
e)质谱数据对照部，其将由所述质谱分析部得到的质谱数据与所述库中收录的所述已知化合物的质谱数据进行对照。
所述库中收录的质谱数据可以为将所述已知化合物实际通过电子离子化进行离子化后进行质谱分析所得到的质谱数据，或者也可以为通过仿真等求出的质谱数据。
在第二方式所涉及的离子分析装置中，上述离子阱也可以为包括1个环电极和一对(2个)端盖电极的三重四极杆型的离子阱、以及包括四根杆电极的四极杆的线性离子阱中的任一者。但是，从容易将离子捕捉到有限的空间内、并且由于在维持着将离子捕捉到该空间内的状态下照射电子而容易调整照射电子的时间的观点出发，优选使用三重四极杆型的离子阱。
本发明的第一方式所涉及的离子分析装置的上述的优选方式中的以下方式等在第二方式所涉及的离子分析装置中也同样有效：使导入到离子阱中的一次电子直接作用于离子来促进该离子的价数增加、内能的增加；向构成离子阱的电极的内表面照射一次电子，将与该一次电子相应地从该电极的内表面释放出的二次电子照射于前体离子；将电子以在离子阱的中心部聚焦的方式照射；使用数字驱动方式的离子阱。
发明的效果
根据本发明的第一方式所涉及的离子分析装置及离子裂解方法、以及第二方式所涉及的离子分析装置，在离子阱中使离子裂解时，即使在作为目标的源自试样成分的前体离子的价数低的情况下，也能够通过使其价数增加或使离子的内能增加，来实现高的裂解效率。由此，例如在对通过裂解而生成的产物离子进行质谱分析的质谱分析装置中，能够充分收集对试样成分的结构解析有用的产物离子的信息，能够进行准确的结构解析。
另外，在第一方式所涉及的离子分析装置、离子裂解方法中，特别是利用HAD法、ECD法、ETD法等作为裂解法的情况下，能够以高灵敏度获得对于推断蛋白质、肽之类的生物高分子化合物的结构而言重要的产物离子信息。由此，能够良好地进行这种生物高分子化合物的综合结构解析。
进而，在第二方式所涉及的离子分析装置中，对于蛋白质、肽之类的若不是MALDI离子源等特定的离子源则难以离子化的生物高分子化合物，也能够通过与收录有多种已知化合物的质谱数据的库进行对照来进行综合结构解析。
附图说明
图1为本发明的第一实施例的离子阱飞行时间型质谱分析装置的概要构成图。
图2为电子密度增加的机理的说明示意图。
图3为以在离子阱内捕捉到的源自泛素的1价离子为前体离子在分离后不进行离子裂解地进行质谱分析所得到的质谱(a)、以及以源自泛素的1价离子为前体离子进行分离并进行了电子照射后进行质谱分析所得到的质谱(b)。
图4为示出通过实验研究对1价的源自富勒烯(C60)及P物质的离子照射电子时的电子的能量与离子的价数增加效率的关系所得到的结果的图。
图5为对1价的肽离子不进行电子照射地通过HAD法将离子裂解后进行质谱分析所得到的MS/MS谱(a)、对同样的离子边进行电子照射边通过HAD法将离子裂解后进行质谱分析所得到的MS/MS谱(b)。
图6为示出以有无电子照射来比较1价的源自肽的c7离子的信号强度所得到的结果的图。
图7为本发明的第二实施例的离子阱飞行时间型质谱分析装置的概要构成图。
图8为对1价的磷酸肽离子进行电子照射后进行质谱分析所得到的MS/MS谱(a)、以及对1价的槲皮素离子进行电子照射后进行质谱分析所得到的MS/MS谱(b)。
图9为通过照射电子使价数增加的前体离子的质谱及其同位素分布的放大图。
图10为通过照射电子使价数增加的前体离子的同位素分布(a)、及在通过照射电子而使前体离子的价数增加后向离子阱内导入了高温的氢自由基时的前体离子的同位素分布(b)。
图11为在通过照射电子使前体离子的价数增加后向离子阱内导入了低温的氢自由基时的质谱及前体离子的同位素分布的放大图。
图12为以源自泛素的1价的离子为前体离子通过HAD法进行裂解所得到的MS/MS谱。
图13为以使用ESI法进行离子化而生成的源自泛素的13价的离子为前体离子通过HAD法进行裂解所得到的MS/MS谱。
图14为在改变了为了使离子的能量增加而照射的激光强度时以1价的肽离子为前体离子通过HAD法进行裂解所得到的MS/MS谱。
具体实施方式
[第一实施例]
参照附图对于本发明的第一实施例的离子阱飞行时间型质谱分析装置说明构成和操作。
图1为本实施例的离子阱飞行时间型质谱分析装置的概要构成图。
本实施例的质谱分析装置在维持真空环境的未图示的真空腔的内部具备：离子源1，其将目标试样中的成分离子化；离子阱2，其利用高频电场的作用来捕捉由离子源1生成的离子；飞行时间型质量分离部3，其将自离子阱2射出的离子根据质荷比m/z进行分离；以及离子检测器4，其对分离出的离子进行检测。本实施例的质谱分析装置还具备：氢自由基照射部5，其用于为了通过HAD法使在离子阱2内捕捉到的离子裂解而向该离子阱2内导入氢自由基；气体供给部6，其向离子阱2内供给规定的气体；电子照射部7，其向离子阱2内照射电子；阱电压产生部8；控制部9；以及数据处理部10。
未图示的离子源1为MALDI离子源，对试样照射激光而将该试样中的成分离子化。离子阱2为包括圆环状的环电极21、以及隔着该环电极21相对配置的一堆端盖电极22、24的三重四极杆型的离子阱。根据控制部9的指示，阱电压产生部8对于上述电极21、22、24中各电极，在规定的时机施加高频电压和直流电压中的任一者、或者将它们进行合成所得到的电压。飞行时间型质量分离部3在本例中为直线型，但也可以为反射型、多回转型等，另外，也可以不是飞行时间型的质量分离器，而是例如利用离子阱2自身的离子分离功能来进行质量分离的质量分离器、轨道阱等。
氢自由基照射部5包括：氢气供给源51；阀52，其能够调整氢气供给源51的流量；喷嘴53，其喷出氢气；丝(钨丝)55，其配置在喷嘴53的前端与分离器(skimmer)54的入口之间；以及分离器54，其在来自喷嘴53的喷出流的中心轴上具有开口，将扩散的氢分子等气体分离，取出细径的氢自由基流。气体供给部6包括：气体供给源61，其储存有用作缓冲气体、冷却气体等的氦、氩等；阀62，其能够调整气体供给源61的流量；以及气体导入管63。电子照射部7包括电子枪等，能够将调整过能量的电子流导入到离子阱2内。另外，阱电压产生部8使用矩形波电压而非正弦波电压来作为高频电压。其理由在后文详细说明。
简单说明本实施例的质谱分析装置中的基本分析动作。
在离子源1中由肽混合物等试样生成的各种离子(主要为1价的离子)以包状从离子源1射出，经过形成于入口侧端盖电极22的离子导入孔23而被导入到离子阱2的内部。导入到离子阱2内的源自肽的离子被高频电场捕捉，所述高频电场是通过自阱电压产生部8施加于环电极21的高频高电压而在离子阱2内形成的。然后，自阱电压产生部8对环电极21等施加规定的电压，由此使包含在除作为目标的具有特定质荷比的离子以外的质荷比范围内的离子被激发，从离子阱2中被排除。由此，在离子阱2内选择性地捕捉具有特定质荷比的前体离子。
随后，在气体供给部6中打开阀62，向离子阱2内导入冷却气体，从而使前体离子冷却，收敛于离子阱2的中心附近。在该状态下，控制部9打开氢自由基照射部5的阀52，将氢气从喷嘴53喷出。自未图示的电源对位于该喷出流的前方的丝55供给电流，加热至高温，对该丝55吹送氢气，从而生成氢自由基。未因丝55发生自由基化的氢气等气体利用分离器54而被去除，穿过分离器54的开口的氢自由基成为细径的束状，穿过钻设于环电极21的自由基粒子导入口26。然后，该氢自由基被导入到离子阱2内，被照射于在离子阱2内捕捉到的前体离子。
预先以使照射于离子的氢自由基的流量成为规定流量以上的方式调整阀52的开度等。另外，氢自由基的照射时间也预先适宜设定。由此，前体离子发生不成对电子诱导型的裂解，生成源自肽的产物离子。生成的各种产物离子被捕捉到离子阱2内，与冷却气体接触而被冷却。然后，在规定的时机自阱电压产生部8对端盖电极22、24施加规定的直流高电压，由此，在离子阱2内捕捉到的离子接受加速能量，通过离子射出孔25而被一齐射出。
如此具有一定的加速能量的离子被导入到飞行时间型质量分离部3的飞行空间，在飞行于飞行空间的期间根据质荷比而被分离。离子检测器4依次检测被分离的离子，接收到该检测信号的数据处理部10制作例如以离子自离子阱2的射出时间点为时间零点的飞行时间谱。然后，使用预先求出的质量校正信息将飞行时间换算成质荷比，从而制作产物离子的质谱。数据处理部10基于根据该质谱得到的信息(质量信息)等进行规定的数据处理，从而鉴定试样中的成分(肽)。
在本实施例的质谱分析装置中，对在离子阱2内捕捉到的前体离子直接照射氢自由基，从而使该前体离子裂解而生成产物离子。但是，虽然离子因照射氢自由基而发生裂解，但若该离子的价数小则裂解效率低。另外，通过MALDI法生成的离子基本上为1价的离子。因此，在本实施例的质谱分析装置中，提高基于HAD法的裂解的效率来提高产物离子的检测灵敏度，因此在即将离子裂解前自电子照射部7向离子阱2内照射高能量(30eV以上)的电子，试图利用该电子与离子的相互作用来使离子的价数增加。
此处，对于对离子照射电子所带来的价数增加的效果，使用实验结果进行说明。
图3的(a)为以在离子阱2内捕捉到的源自泛素的1价的离子为前体离子进行分离后不进行离子裂解地进行质谱分析所得到的质谱，图3的(b)为以同样的源自泛素的1价离子为前体离子进行分离并在500ms的期间内照射电子后进行质谱分析所得到的质谱。图3的(a)中仅能观测到1价的离子，而图3的(b)中观测到了2价～6价的离子。由此，能够确认因照射电子而离子的价数切实地增加。
根据非专利文献6，关于泛素，报告了能够对于6价～13价的离子通过ECD法进行充分的裂解。ECD法与HAD法的离子裂解的机理几乎相同，因此能够推测为在HAD法中也同样能够对于6价～13价的离子进行充分的裂解。如上所述那样通过照射电子使离子的价数自1价增加至2价～6价的范围，因此通过对照射电子后的前体离子照射自由基氢，或者通过边照射电子边照射自由基氢，能够充分良好地进行基于HAD法的裂解。
图4为示出通过实验研究对于1价的源自富勒烯(C60)及P物质(Substance P)的离子照射电子时的电子能量与离子的价数增加效率([M+H]2+/[M+H]+)的关系所得到的结果的图。电子照射的时间为500ms。基于电子照射的富勒烯的价数增加效率(ElectronIonization)的碰撞截面积记载于非专利文献7，已知该效率在50eV左右的电子能量下饱和。与此相对，图4的结果中，在比它高一个数量级的500eV的电子能量下价数增加效率饱和。根据该电子能量的差异可以推测出，此处产生的离子的价数增加反应不是由高能量的直接的电子照射得到的，而是由在构成离子阱2的环电极21等的电极内表面生成的二次电子得到的。
如图2所示，当具有高能量的一次电子碰撞于环电极21等导电体时，自该导电体释放出比一次电子更多量的二次电子。这种二次电子的生成效率伴随一次电子的能量增加而上升，该效率在一次电子的能量达到数百eV左右时饱和。由此可以认为，图4所示的价数增加效率的电子能量取决性与相对于照射的电子能量的二次电子的生成效率相对应。电场约束型的离子阱2难以效率良好地约束电子，但如上所述那样通过使高能量的一次电子碰撞于电极21等而释放出二次电子，从而能够提高离子阱2的内部空间中的电子密度，以实用的反应时间实现前体离子的价数增加。当然，在不利用自环电极21等释放出的二次电子而是对离子直接照射约30eV以上的高能量的电子的情况下，若提高该电子密度至某种程度，或者若使电子流聚焦在离子以高概率存在的离子阱2的中心部，则也能够以实用的反应时间实现前体离子的价数增加。
此外，在如上所述那样使自电子照射部7射出的电子碰撞于离子阱2的环电极21的内表面等、并将由此生成的二次电子用于前体离子的价数增加的情况下，优选的是，事先将自电子照射部7照射的电子(一次电子)的能量设为例如30eV～2keV左右的范围。另外，为了提高二次电子的释放效果，可以由功函数低的导电性构件形成电极自身或在电极的表面形成功函数低的导电性覆膜层。
另外，在由于照射电子而使前体离子的内能过度增大时，为了减少其能量来避免断裂，优选以使电子照射时的离子阱2内部的气压成为1×10-3Pa以上的方式控制冷却气体的供给。
另外，如上所述的电子照射所带来的离子的价数增加效果取决于该离子所具有的的势能，因此当该势能变动时，即使持续照射相同能量的电子，价数增加效果自身也变动，难以稳定地得到高的裂解效率。与此相对，在本实施例的质谱分析装置中，利用矩形波电压作为离子捕捉用的高频电压。由此，捕捉到的离子所具有的势能交替地取二进制值，能够避免像利用正弦波电压作为高频电压时那样势能时时刻刻连续地变动的情况。其结果，即使持续照射相同能量的电子，也能够稳定地实现充分高的价数增加效果，实现高裂解效率。
上述说明中，以受到电子照射的前体离子的价数自1价增加至6价左右为前提，但在前体离子的价数不变高(或其增加的程度小)的情况下也通过前体离子的内能增加而使一部分键的切断的效率上升，有时能够观测到在不照射电子时无法观测的产物离子。在该情况下，若不适当控制供给至离子的能量，则也存在例如翻译后修饰脱离等、得不到对结构解析有用的信息的担心。在本实施例的质谱分析装置中，能够在电子照射部7中利用使电子加速的加速电压来对离子照射的电子的能量进行准确的控制。另外，为了捕捉离子而对环电极21施加作为矩形波的高频电压，因此，如上所述，被捕捉到的离子的势能取二进制值，通过照射固定能量的电子，由与电子的相互作用带来的离子的内能的增加也是稳定的。由此，能够防止离子的内能过度变高。
对于对离子照射电子所带来的产物离子的强度增加的效果，使用实验结果进行说明。
图5的(a)为对于离子阱2内的1价肽离子(Acetyl-DRVYIHPFHLLVYS)不进行电子照射地通过HAD法使离子裂解后进行质谱分析所得到的MS/MS谱，(b)为对于相同的离子边进行电子照射(照射电子能量：500eV)边通过HAD法使离子裂解后进行质谱分析所得到的MS/MS谱。
如图5的(a)所示，即使不进行电子照射，也以充分的强度观测到了c10、c11、c12等产物离子。另一方面，如图5的(b)所示，可知：通过进行电子照射，也能够观测到在不照射电子时未能观测到的c7以下的产物离子。另外，在电子照射时还观测到前体离子的价数增加的MH2+离子。此时，对离子阱2的环电极21施加的高频电压的振幅为1kV，因此可以认为离子阱2的中心部的离子的势能为其1/2的500V，一次电子的能量也为500V。另一方面，已知上述肽离子的由电子照射所带来的价数增加反应的最佳电子能量为100eV左右(参照非专利文献4)。由此推测出，本反应中也是不仅自外部导入的一次电子参与，而且在构成离子阱2的环电极21等的表面生成的低能量的二次电子也参与。但是，可以推测为即使对离子直接照射电子而不利用二次电子，也会观测到实用上充分的强度的产物离子。
图6为以有无电子照射来比较上述c7离子的信号强度所得到的实验结果。由图6可知，通过电子照射而使源自HAD的c7离子的信号强度增加至约2.5倍。由此推测出，通过电子与前体离子的相互作用，离子的内能增加，从而HAD的反应效率增加。
此外，非专利文献8中报告了在对胰岛素B链的4价的正离子照射电子后照射氢自由基但是几乎未附着的实验结果。该实验结果与上述本实施例的实验结果不同。非专利文献8中未记载氢自由基的供给量、电子照射等详细的实验条件，但认为该文献中记载的实验中未确认到氢自由基的附着可能是因为氢自由基的生成量不足。如本发明人在专利文献1中所记载的那样，氢自由基富于反应性，因此例如在用于将氢自由基引导至离子阱内的配管的内壁、腔壁等处容易再结合而形成氢分子。可以认为，为了充分确保参与裂解反应的自由基量，对于源自试样成分的离子存在的空间，需要例如以4×1010[atoms/s]以上的流量、3×1012[atoms/m3]以上的密度导入氢自由基，但可以认为非专利文献8中氢自由基的量未达到该条件，因此未确认到氢自由基的附着。
[第二实施例]
接着，参照图7、图8对于本发明的第二实施例的离子阱飞行时间型质谱分析装置进行说明。
图7为第二实施例的离子阱飞行时间型质谱分析装置的概要构成图，对与图1所示的第一实施例的离子阱飞行时间型质谱分析装置相同的构成要素标记相同的符号。若将图1与图7比较则可知，本第二实施例的离子阱飞行时间型质谱分析装置不具备用于进行基于HAD法的离子裂解的氢自由基照射部5，通过来自电子照射部7的电子照射使价数增加，并且还实施了离子裂解。
即，在本第二实施例的离子阱飞行时间型质谱分析装置中，在离子阱2内选择性地捕捉具有特定质荷比的前体离子后，自气体供给部6向离子阱2内导入冷却气体，将前体离子冷却。然后，自电子照射部7向离子阱2内以规定时间照射高能量的电子，从而使前体离子的价数增加，并且通过电子的作用使该价数增加的离子裂解。如此，通过照射高能量的电子而使前体离子裂解的方法被称为电子诱导裂解(EID)法。
另外，第二实施例的离子阱飞行时间型质谱分析装置的数据处理部10具备保存有谱库12的存储部11、以及作为功能块的谱数据对照部13，连接有输入部14与显示部15。谱库12中，收录有对于已知的多个化合物中的各个化合物对通过电子离子化法生成的离子进行质谱分析所得到的质谱数据。
图8的(a)为对于离子阱2内的1价的磷酸肽离子(苏氨酸1位为磷酸化：pT)以250ms的期间进行电子照射(照射电子能量：500eV)后进行质谱分析所得到的MS/MS谱。若观察图8的(a)则可知，通过与电子离子化法同样的机理而观测到前体离子的价数增加的2价离子(MH+2)，并且以充分的强度观测到多种产物离子。产物离子为a/c/x/z系列，因此推断与HAD法、ETD法、ECD法等同样地发生了不成对电子诱导型的裂解。另外，大半的产物离子为结合有磷酸的状态，与裂解相伴的修饰物的脱离也几乎没有发生。但是，如上所述，与ECD法中使用的照射电子相比能量大不相同，可以说显然是与基于ECD法的裂解不同的机理。
此处，产物离子的收集效率接近30％，非常高，与在使用以往的磁场约束型FT-ICR离子阱时报告的(参照非专利文献3、4)产物离子的收集效率相比高一个数量级左右。可以认为该差是由磁场约束型FT-ICR离子阱的虚拟电势与利用电场约束的数字驱动方式的三重四极杆型离子阱的虚拟电势之差造成的。
如此，通过电子照射也能够进行使前体离子的价数增加后的离子裂解。在该情况下，能够仅利用电子照射部7来实现价数增加和离子裂解，因此能够使构成大大简化。
另外，图8的(b)为对于通过MALDI法进行离子化并在离子阱2内捕捉到的作为1价的低分子化合物的槲皮素(Quercetin)进行电子照射后进行质谱分析所得到的MS/MS谱。由图8的(b)所示的MS/MS谱可知，不仅对于肽离子那样的高分子化合物，而且对于低分子化合物也能够检测到多个断裂离子峰，本实施例的方法是有效的。
在第二实施例的离子阱飞行时间型质谱分析装置中，当得到如图8所示的质谱时，谱数据对照部13求出与在存储部11内的库12中收录的已知化合物的质谱数据的一致度(质量峰的位置的质荷比、质量峰的强度比等的一致度)。然后，按照该一致度从高到低的顺序提取规定数量的化合物，将这些化合物名称与质谱显示于显示部15。此外，谱数据对照部13在将由离子检测器4得到的质谱数据与在库12中收录的已知化合物的质谱数据进行对照时，以容许规定范围的质量误差的方式判定质量峰的位置(质荷比)的一致或不一致。规定范围的质量误差可以采用预先在装置中存储的质量误差的范围，也可以每一次由用户通过输入部14输入质量误差的范围来进行设定。
基于EID法的前体离子的裂解使用与在气相色谱质谱联用仪等中广泛使用的基于电子离子化(EI＝Electron Ionization)法的试样成分的离子化类似的机理。因此，当使用EID法使前体离子裂解时，能够生成与通过EI法生成的离子类似的系统的离子。另外，在EID法中，无论前体离子的价数如何，都能高效率地使离子裂解。进而，使在离子源由试样成分生成的(前体)离子断裂，而不是将试样成分直接离子化，因此无论离子源的种类如何，都能够以高效率生成与通过EI法生成的离子同样的离子。
EI法从很久之前就已投入实用，在其库中收录有大量的已知化合物的质谱数据。在第二实施例的离子阱飞行时间型质谱分析装置中，将使由离子源1生成且被离子化的试样成分裂解而获取到的质谱数据与在谱库12中收录的质谱数据进行对照。因此，对于像蛋白质、肽那样若不是MALDI离子源等特定离子源则难以离子化的源自生物试样的化合物，也能够进行综合结构解析。
本发明人进行了将图8的(b)所示的槲皮素的MS/MS谱与为了使用电子离子化(EI)法的解析用途而制作出的市售的谱库(NIST 14)中收录的质谱进行对照的谱映射。该库中，也收录了精确质量(302.042653Da)与槲皮素完全相同、仅羟基的键合位置不同的结构异构体的类黄酮的质谱，但在图8的(b)的MS/MS谱的谱映射中，作为正确的化合物的槲皮素成为最高分。即，可知如本实施例这样将使用EID法使前体离子裂解所得到的MS/MS谱与为了EI法用途而制作出的谱库中收录的质谱进行对照，从而能够准确地鉴定化合物。
上述实施例均为一例，可以依照本发明的主旨适当变更。
第一实施例中说明了使用HAD法的例子，但例如离子裂解的机理与HAD法几乎相同的ECD法、ETD法也显然能够得到与上述同样的效果。另外，CID法、IRMPD法、UVPD法等裂解法中也是通常前体离子的价数越高，裂解效率越高。因此，当然也能够将本发明应用于搭载有使用这种离子裂解法使前体离子裂解的离子阱的质谱分析装置。
另外，在上述各实施例的质谱分析装置中，通常使用非活性气体作为冷却气体，但在第一实施例中，也可以通过利用氢气作为冷却气体或混入氢气来赋予额外的效果。
因电子照射而价数增加的前体离子为自由基种类[M+nH](n+1)+*，因此不稳定。根据本发明人的研究判明了，当向捕捉了处于这种状态的前体离子的离子阱内导入氢自由基时，发生氢自由基附着于前体离子的现象。其结果，作为自由基种类的前体离子成为化学稳定的非自由基种类的离子[M+nH](n+1)+。在基于HAD法、ETD法、ECD法等的离子裂解的情况下，当电子、氢自由基附着于作为自由基种类的前体离子时，存在该前体离子反而不再是自由基种类并变得难以裂解的担心。
与此相对，当如上所述那样通过氢自由基的作用使因价数增加而成为自由基种类的前体离子暂时稳定化时，通过用于离子裂解的电子、氢自由基的作用而成为自由基种类，变得容易发生裂解。由此，产物离子的生成效率提高。
图9为在第一实施例的离子阱飞行时间型质谱分析装置中对保持于离子阱2中的肽离子照射高能量的电子所得到的结果，可知生成了价数增加的自由基离子[M+H]2+*。
图10的(b)为对于电子离子化所得到的自由基价数增加离子[M+H]2+*照射专利文献1中记载的具有指向性的高温的氢自由基(2300K)所得到的结果。由与图10的(a)中所示的仅通过电子照射所得到的结果的比较可知，与通常的HAD测定同样地，因氢自由基的附着和取出而离子复杂地分布。图10的(b)中非自由基离子与自由基离子混合存在，当使其通过CID等断裂时，会产生自由基诱导裂解和热裂解的复杂断裂峰，因此难以解析。
通常，为了使氢自由基附着于非自由基离子或从离子取出氢自由基，需要使用上述那样的高温的氢自由基。但是，本发明人通过实验发现，对于自由基离子，即使是低温的氢自由基也会充分地附着。
图11为在第一实施例的离子阱飞行时间型质谱分析装置中对保持于离子阱2中的肽离子照射电子、并对由此得到的价数增加自由基离子[M+H]2+*照射室温左右的低温的氢自由基所得到的结果，可知得到了清楚的+1Da的非自由基的价数增加离子。如此通过照射低温的氢自由基，能够选择性地生成非自由基的价数增加离子。
在该测定中，代替照射如专利文献1中记载那样的由热裂解源生成的具有指向性的高温的氢自由基，如图1所示，将钨丝55设置在离子阱2的附近，照射通过对该丝55施加电流来进行加热从而在丝55的表面附近生成的无指向性的氢自由基。这种无指向性的氢自由基在输送至离子阱2的中心前已与离子阱2的壁面等接触而被冷却，降低至室温左右。氢自由基也能够通过与供给其自身的流路的壁面等接触等而被冷却。氢自由基的温度为比专利文献1中记载的温度低的温度(例如2000℃以下)即可，由此能够得到比以往更容易解析的谱。
另外，在发明人等另外进行的验证中可知，通过使水蒸气、氢气高频放电而生成的氢自由基的温度低于通过热裂解源生成的氢自由基温度，通过直接照射通过高频放电生成的自由基，也能够得到与上述同样的效果。通常，高频放电的频率越高，自由基温度越下降，因此优选通过RF频率以上的频率的高频放电来进行放电，从而生成氢自由基，更优选通过微波波段以上的频率的高频放电来生成氢自由基。另外，与电容耦合型的高频放电相比，电感耦合型的高频放电所生成的自由基温度更低，因此优选使用电感耦合型的高频放电。
另外，在采用在通过对保持于离子阱2中的离子照射电子来增加前体离子的价数后进行基于CID法的离子裂解的构成时，也能够进行如下的解析。
在使用通常的、即不含H2气体的非活性气体作为冷却气体的情况下，如图9所示，通过照射电子使价数增加的前体离子为自由基种类，当通过CID法使其裂解时，主要生成a/x、c/z系列的产物离子。另一方面，若使用H2气体(或使用包含H2气体的非活性气体)作为冷却气体，通过如上所述那样与丝接触等方法使其进行自由基化，将由此生成的低温的氢自由基导入到离子阱2内，则如图11所示，价数增加的前体离子为非自由基种类，当通过CID法使其裂解时，主要生成b/y系列的产物离子。即，根据氢自由基的照射的有无，通过裂解得到的产物离子的系列不同。因此，优选的是，获取照射氢自由基的MS/MS谱与不照射氢自由基的MS/MS谱这两者，将这两个MS/MS谱互补地利用(例如合并)来进行结构解析。由此，得到的产物离子的种类增加，因此肽的结构解析变得容易。
此外，上述各实施例的质谱分析装置中使用了MALDI离子源。但当然不拘泥于离子化法的方式。另外，离子阱也可以不是三重四极杆的结构，而是线性离子阱。
另外，上述的各实施例仅为本发明的一例，因此除了上述记载的事项以外，即使在本发明的主旨的范围内适当进行变形、追加、修改，也当然包括在本申请权利要求书的范围之内。
附图标记说明
1：离子源；2：离子阱；21：环电极；22、24：端盖电极；23：离子导入孔；25：离子射出孔；26：自由基粒子导入口；3：飞行时间型质量分离部；4：离子检测器；5：氢自由基照射部；51：氢气供给源；52：阀；53：喷嘴；54：分离器；55：丝；6：气体供给部；61：气体供给源；62：阀；63：气体导入管；7：电子照射部；8：阱电压产生部；9：控制部；10：数据处理部。

Claims (17)

1.一种离子分析装置，使源自试样成分的离子在离子阱的内部裂解，对由此生成的产物离子进行分析，所述离子分析装置的特征在于，具备：
a)四极杆型的离子阱，其利用高频电场的作用来捕捉源自试样成分的离子；
b)电子照射部，其对被所述离子阱捕捉到的作为裂解对象的离子照射具有30eV以上的能量的电子，以使所述作为裂解对象的离子的价数增加；以及
c)裂解促进部，其在由所述电子照射部进行了电子的照射后，使与电子发生了相互作用的离子裂解。
2.根据权利要求1所述的离子分析装置，其特征在于，
所述裂解促进部通过不成对电子诱导型的裂解法使离子裂解。
3.根据权利要求1所述的离子分析装置，其特征在于，
还具备氢自由基供给部，该氢自由基供给部用于在所述电子照射部所进行的电子照射时或电子照射后向所述离子阱中导入氢自由基。
4.根据权利要求3所述的离子分析装置，其特征在于，
所述氢自由基供给部通过微波放电来生成氢自由基。
5.根据权利要求3所述的离子分析装置，其特征在于，
所述氢自由基供给部通过电感耦合型的高频放电来生成氢自由基。
6.根据权利要求3所述的离子分析装置，其特征在于，
通过使所述氢自由基与用于供给该氢自由基的流路或所述离子阱的壁面碰撞，来对所述氢自由基进行冷却。
7.根据权利要求3所述的离子分析装置，其特征在于，
所述氢自由基的温度为2000℃以下。
8.根据权利要求1所述的离子分析装置，其特征在于，
所述裂解促进部通过碰撞诱导裂解法使离子裂解。
9.根据权利要求1所述的离子分析装置，其特征在于，
还具备气体供给部，该气体供给部以使所述离子阱的内部的气压成为1×10-3[Pa]以上的方式向该离子阱的内部导入规定的气体。
10.根据权利要求1所述的离子分析装置，其特征在于，
所述裂解促进部通过碰撞诱导裂解法使离子裂解，
在对由所述离子阱生成的产物离子进行质谱分析的质谱分析装置中，获取在向所述离子阱的内部导入了氢自由基时的产物离子谱、以及在不向该离子阱的内部导入氢自由基时的产物离子谱，利用这些产物离子谱来对试样中的成分进行解析。
11.一种离子分析装置，使源自试样成分的离子在离子阱的内部裂解，对由此生成的产物离子进行分析，所述离子分析装置的特征在于，具备：
a)四极杆型的离子阱，其利用高频电场的作用来捕捉源自试样成分的离子；
b)电子照射部，其对被所述离子阱捕捉到的作为裂解对象的离子照射具有30eV以上的能量的电子，以使所述作为裂解对象的离子的价数增加；
c)质谱分析部，其对通过照射所述电子而裂解得到的离子进行质谱分析，来获取质谱数据；
d)库，其收录有针对多个已知化合物通过对利用电子离子化法生成的离子进行质谱分析所得到的质谱数据；以及
e)质谱数据对照部，其将由所述质谱分析部得到的质谱数据与所述库中收录的所述已知化合物的质谱数据进行对照。
12.根据权利要求11所述的离子分析装置，其特征在于，
所述质谱数据对照部在将由质谱分析部得到的质谱数据与所述库中收录的所述已知化合物的质谱数据进行对照时，以容许预先决定的范围的质量误差的方式判定质量峰的位置的一致或不一致。
13.根据权利要求1或11所述的离子分析装置，其特征在于，
还具备电压产生部，该电压产生部对构成所述离子阱的至少一个电极施加矩形波状的高频电压，以形成用于在该离子阱的内部捕捉离子的电场。
14.根据权利要求1或11所述的离子分析装置，其特征在于，
还具备电压产生部，该电压产生部对所述电子照射部施加使构成所述离子阱的电极与该电子照射部的电位差成为矩形波状的高频电压，构成该离子阱的电极被施加用于在所述离子阱的内部捕捉离子的电压。
15.根据权利要求1或11所述的离子分析装置，其特征在于，
所述电子照射部对构成所述离子阱的至少一个电极的内表面照射电子，来对离子照射与该电子相应地从该电极的内表面释放出的二次电子。
16.一种离子裂解方法，使在离子阱的内部捕捉到的源自试样成分的离子裂解，所述离子裂解方法的特征在于，
对利用高频电场的作用在四极杆型的离子阱的内部捕捉到的作为裂解对象的离子照射电子以使所述作为裂解对象的离子的价数增加，并且，在照射该电子的同时或紧挨着照射该电子后，通过规定的方法使与电子发生了相互作用的离子裂解。
17.一种离子分析方法，使源自试样成分的离子在离子阱的内部裂解，对由此生成的产物离子进行分析，所述离子分析方法的特征在于，包括以下步骤：
a)利用高频电场的作用来在四极杆型的离子阱内捕捉源自试样成分的离子；
b)电子照射步骤，对被所述离子阱捕捉到的作为裂解对象的离子照射具有30eV以上的能量的电子，以使所述作为裂解对象的离子的价数增加；以及
c)裂解促进步骤，在所述电子照射步骤后，使与电子发生了相互作用的离子裂解。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201802917D0 (en) 2018-02-22 2018-04-11 Micromass Ltd Charge detection mass spectrometry
US11882438B2 (en) * 2018-10-29 2024-01-23 Zorday IP, LLC Network-enabled electronic cigarette
WO2020202455A1 (ja) * 2019-04-02 2020-10-08 株式会社島津製作所 イオン分析装置
JP7109026B2 (ja) * 2019-04-17 2022-07-29 株式会社島津製作所 イオン分析装置
WO2021014487A1 (ja) * 2019-07-19 2021-01-28 株式会社島津製作所 イオン分析装置
WO2021059600A1 (ja) * 2019-09-27 2021-04-01 株式会社島津製作所 イオントラップ質量分析計、質量分析方法および制御プログラム
US20230048972A1 (en) * 2020-03-12 2023-02-16 Shimadzu Corporation Ion analysis device
US11842891B2 (en) 2020-04-09 2023-12-12 Waters Technologies Corporation Ion detector
JP7409260B2 (ja) * 2020-08-19 2024-01-09 株式会社島津製作所 質量分析方法及び質量分析装置

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102067275A (zh) * 2008-06-20 2011-05-18 株式会社岛津制作所 质量分析装置
JP2013228211A (ja) * 2012-04-24 2013-11-07 Shimadzu Corp 質量分析装置及び質量分析方法

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6511575B1 (en) * 1998-11-12 2003-01-28 Canon Kabushiki Kaisha Treatment apparatus and method utilizing negative hydrogen ion
JP3536029B2 (ja) * 1999-12-02 2004-06-07 株式会社日立製作所 イオントラップ質量分析方法およびイオントラップ質量分析計
CA2340150C (en) * 2000-06-09 2005-11-22 Micromass Limited Methods and apparatus for mass spectrometry
DE60210056T2 (de) * 2001-03-22 2006-11-16 Syddansk Universitet Massenspektrometrisches Verfahren mit Elektroneneinfang durch Ionen und Massenspektrometer zum Durchführen des Verfahrens
DE10213652B4 (de) * 2002-03-27 2008-02-21 Bruker Daltonik Gmbh Verfahren zur Bestrahlung von Ionen in einer Ionenzyklotronresonanz-Falle mit Elektronen und/oder Photonen
US7202473B2 (en) * 2003-04-10 2007-04-10 Micromass Uk Limited Mass spectrometer
CA2525978C (en) * 2003-05-30 2011-07-19 Purdue Research Foundation Process for increasing ionic charge in mass spectrometry
JP4275545B2 (ja) * 2004-02-17 2009-06-10 株式会社日立ハイテクノロジーズ 質量分析装置
GB0404106D0 (en) * 2004-02-24 2004-03-31 Shimadzu Res Lab Europe Ltd An ion trap and a method for dissociating ions in an ion trap
GB2414855A (en) 2004-03-30 2005-12-07 Thermo Finnigan Llc Ion fragmentation by electron capture
DE102005005743B4 (de) * 2005-02-07 2007-06-06 Bruker Daltonik Gmbh Ionenfragmentierung durch Beschuss mit Neutralteilchen
DE102008023693A1 (de) * 2008-05-15 2009-11-19 Bruker Daltonik Gmbh 3D-Ionenfalle als Fragmentierungszelle
JP5039656B2 (ja) * 2008-07-25 2012-10-03 株式会社日立ハイテクノロジーズ 質量分析装置および質量分析方法
US8158934B2 (en) * 2009-08-25 2012-04-17 Agilent Technologies, Inc. Electron capture dissociation apparatus and related methods
WO2012124020A1 (ja) * 2011-03-11 2012-09-20 株式会社島津製作所 質量分析装置
US9595426B2 (en) 2011-10-07 2017-03-14 Shimadzu Corporation Method and system for mass spectrometry data analysis
FR3007524B1 (fr) * 2013-06-24 2017-12-29 Institut National De La Rech Agronomique - Inra Systeme et procede de detection et de quantification par spectrometrie de masse et par activation d'especes moleculaires ionisees
EP4220684A1 (en) 2014-03-04 2023-08-02 Shimadzu Corporation Ion analyzer
CN106415260B (zh) * 2014-06-13 2021-04-06 Dh科技发展私人贸易有限公司 使用质谱分析法分析脂质的方法
US9978578B2 (en) 2016-02-03 2018-05-22 Fasmatech Science & Technology Ltd. Segmented linear ion trap for enhanced ion activation and storage

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102067275A (zh) * 2008-06-20 2011-05-18 株式会社岛津制作所 质量分析装置
JP2013228211A (ja) * 2012-04-24 2013-11-07 Shimadzu Corp 質量分析装置及び質量分析方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20200035478A1 (en) 2020-01-30
WO2018190013A1 (ja) 2018-10-18
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