WO2023171024A1 - 核酸の構造解析方法及び核酸の構造解析装置 - Google Patents

核酸の構造解析方法及び核酸の構造解析装置 Download PDF

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WO2023171024A1
WO2023171024A1 PCT/JP2022/040077 JP2022040077W WO2023171024A1 WO 2023171024 A1 WO2023171024 A1 WO 2023171024A1 JP 2022040077 W JP2022040077 W JP 2022040077W WO 2023171024 A1 WO2023171024 A1 WO 2023171024A1
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nucleic acid
ions
analysis
fragment ions
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Inventor
祥聖 山内
秀典 ▲高▼橋
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株式会社島津製作所
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid structural analysis method and a nucleic acid structural analysis apparatus.
  • mass spectrometry has been used as a method for analyzing the structure of nucleic acids, that is, determining the base sequence of DNA or RNA, and identifying the type of chemical modification or the site where the chemical modification has been performed.
  • the method is widely used.
  • a mass spectrometer capable of performing MS n analysis (n is an integer of 2 or more), which is mass spectrometry that involves ion cleavage n-1 times, is used to analyze the nucleic acid to be analyzed. Perform MS n analysis.
  • ions generated from the target nucleic acid are dissociated using an appropriate dissociation method to generate various fragment ions (also called product ions) that are fragments of the original ions (these are called precursor ions). .
  • fragment ions are separated and detected according to m/z (mass-to-charge ratio), and a mass spectrum representing the m/z and detected intensity of each fragment ion is created.
  • Methods for dissociation of precursor ions in the MS n analysis of nucleic acids as described above include the collision-induced dissociation (CID) method, in which precursor ions are collided with a gas (usually an inert gas) to promote dissociation, and infrared laser.
  • CID collision-induced dissociation
  • IRMPD infrared multiphoton dissociation
  • ETD electron transfer dissociation
  • ECD Electron capture dissociation
  • fragment ions base-eliminated ions in which a nucleic acid base (hereinafter sometimes simply referred to as a base) is detached may be generated (for example, (Refer to Non-Patent Document 1), internal fragment ions are generated when the sugar-phosphate skeleton of the precursor ion dissociates at multiple locations, and neutral loss ions are generated when uncharged chemical species are removed from the precursor ion.
  • the problem is that it is easy to do.
  • the ETD method or ECD method the above-mentioned base-detachment ions, internal fragment ions, or neutral loss ions are unlikely to occur.
  • the ETD method and the ECD method are generally effective only for positive ions, and it is difficult to dissociate negative ions.
  • negative ETD NETD
  • the ETD method and the ECD method can only dissociate multivalent ions due to their principles.
  • ions generated by ionization methods such as matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) are mainly monovalent positive ions, so dissociation of monovalent positive ions cannot be performed. Otherwise, it would be a major limitation as an analytical method.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption ionization
  • the present invention has been made in view of these points, and its purpose is to develop a structure of a nucleic acid that can accommodate precursor ions of various charges and that allows easy estimation of the structure of a nucleic acid based on a mass spectrum.
  • An object of the present invention is to provide an analysis method and a nucleic acid structure analysis device.
  • the method for analyzing the structure of nucleic acids according to the present invention includes: By introducing hydrogen radicals into the space where ions derived from the test nucleic acid exist, the ions are dissociated, and the m/z of the plurality of fragment ions is determined by mass spectrometry of the plurality of fragment ions generated thereby.
  • a HAD-MS n analysis step for collecting information on a structure estimation step of estimating the structure of the test nucleic acid based on m/z information of the plurality of fragment ions obtained in the HAD-MS n analysis step; It has the following.
  • the nucleic acid structure analysis device which has been made to solve the above problems, includes: By introducing hydrogen radicals into the space where ions derived from the test nucleic acid exist, the ions are dissociated, and the m/z of the plurality of fragment ions is determined by mass spectrometry of the plurality of fragment ions generated thereby.
  • a HAD-MS n analysis execution unit that collects information on a structure estimation unit that estimates the structure of the test nucleic acid based on m/z information of the plurality of fragment ions obtained by the HAD-MS n analysis execution unit; It has the following.
  • nucleic acid structure analysis method or nucleic acid structure analysis apparatus it is possible to deal with precursor ions of various charges and to easily estimate the structure of a nucleic acid based on a mass spectrum.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a nucleic acid structure analysis apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • 3 is a flowchart showing an example of a nucleic acid structure analysis procedure performed by the apparatus.
  • FIG. 2 is a diagram showing a mass spectrum of fragment ions obtained by CID-MS 2 analysis of a nucleic acid specimen, as well as the base sequence of the nucleic acid specimen and the assigned series ions.
  • FIG. 2 is a diagram showing a mass spectrum of fragment ions obtained by HAD-MS 2 analysis of a nucleic acid sample, as well as the base sequence of the nucleic acid sample and assigned series ions.
  • 3 is a flowchart showing another example of the procedure for analyzing the structure of nucleic acids using the apparatus.
  • the present inventors have been actively researching a method of dissociating ions by attaching hydrogen radicals to ions as a method of unpaired electron-induced dissociation using uncharged particles, and have been conducting research on a method for dissociating ions by attaching hydrogen radicals to ions.
  • a method for effectively dissociating the derived ions has already been proposed (see Patent Document 1). According to this dissociation method, monovalent ions and negative ions that cannot be dissociated by unpaired electron-induced dissociation methods using charged particles such as ETD and ECD can be dissociated with high efficiency.
  • HAD Hydrogen Attachment Dissociation
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram showing a nucleic acid structure analysis apparatus according to this embodiment.
  • This nucleic acid structure analysis apparatus includes a mass spectrometer, which includes an ion source 1 that ionizes a target sample component (i.e., a test nucleic acid), and an ion source 1 that captures ions generated by the ion source 1 by the action of a high-frequency electric field.
  • the ion trap 2 includes an ion trap 2, a time-of-flight mass separator 3 that separates ions ejected from the ion trap 2 according to m/z, and an ion detector 4 that detects the separated ions.
  • the mass spectrometer also includes a hydrogen radical supply unit 5 for supplying hydrogen radicals into the ion trap 2 in order to dissociate the ions trapped in the ion trap 2, and a hydrogen radical supply unit 5 for supplying hydrogen radicals into the ion trap 2, and a hydrogen radical supply unit 5 for supplying a predetermined gas into the ion trap 2.
  • It has a gas supply section 6, a trap voltage generation section 7, and a control section 8.
  • a detection signal from the ion detector 4 is input to the data processing section 9.
  • these ion source 1, ion trap 2, time-of-flight mass separator 3, ion detector 4, hydrogen radical supply section 5, gas supply section 6, trap voltage generation section 7, and control section 8 are according to the present invention. This corresponds to the "HAD-MS n analysis execution unit" in .
  • the actual state of the control unit 8 and data processing unit 9 is a computer such as a personal computer.
  • the data processing unit 9 performs analysis processing characteristic of the nucleic acid structure analysis apparatus according to this embodiment, and includes a mass spectrum creation unit 91, a peak extraction unit 92, a structure estimation unit 93, and a display processing unit 94. Included as a functional block. These functional blocks are realized by executing a predetermined program installed in the computer in advance.
  • a storage unit 95 provided in the computer constituting the data processing unit 9 stores a nucleic acid database (nucleic acid DB) 96 containing information such as base sequences of a large number of known natural or artificial nucleic acids. .
  • an input section 97 consisting of a keyboard and a pointing device such as a mouse
  • a display section 98 consisting of a liquid crystal display or the like.
  • the ion source 1 is, for example, an ion source that uses an ionization method such as the MALDI method.
  • the ion trap 2 is a three-dimensional quadrupole ion trap that includes an annular ring electrode 21 and a pair of end cap electrodes 22 and 24 facing each other with the ring electrode 21 interposed therebetween.
  • the trap voltage generation section 7 applies one of a high frequency voltage and a DC voltage, or a voltage that is a combination thereof, to each of the electrodes 21, 22, and 24 at a predetermined timing.
  • time-of-flight mass separator 3 is of a linear type in this example, it may be of a reflectron type, multiturn type, etc., and it is not a time-of-flight mass separator, but uses the ion separation function of the ion trap 2 itself, for example.
  • An orbitrap or the like that performs mass separation may also be used.
  • the hydrogen radical supply unit 5 includes a hydrogen radical supply source 51 that stores hydrogen radicals or generates hydrogen radicals, a valve 52 that can adjust the flow rate, a nozzle 53 that spouts hydrogen radicals, and a jet flow from the nozzle 53.
  • the skimmer 54 has an opening on the central axis of the skimmer 54 and separates diffused gas such as hydrogen molecules to extract a small-diameter flow of hydrogen radicals.
  • the gas supply unit 6 includes a gas supply source 61 storing an inert gas such as helium gas or argon gas, and a valve 62 whose flow rate can be adjusted.
  • a gas supply source 61 storing an inert gas such as helium gas or argon gas
  • a valve 62 whose flow rate can be adjusted.
  • Step 101 HAD-MS n analysis of test nucleic acid
  • a sample containing a test nucleic acid is subjected to mass spectrometry with ion dissociation (hereinafter referred to as HAD-MS n analysis) using the HAD method.
  • HAD-MS n analysis mass spectrometry with ion dissociation
  • various ions generated from the sample containing the test nucleic acid in the ion source 1 are ejected from the ion source 1 in the form of a packet, and pass through the ion introduction hole 23 formed in the entrance side end cap electrode 22 to the ion trap. It is introduced inside 2.
  • Ions derived from the test nucleic acid introduced into the ion trap 2 are captured by a high frequency electric field formed within the ion trap 2 by a voltage applied to the ring electrode 21 from the trap voltage generating section 7. Thereafter, a predetermined voltage is applied from the trap voltage generator 7 to the ring electrode 21 and the like, thereby exciting ions other than ions having a specific target m/z and expelling them from the ion trap 2. Thereby, precursor ions having a specific m/z are selectively captured in the ion trap 2.
  • valve 62 is opened in the gas supply section 6, and an inert gas is introduced into the ion trap 2 as a cooling gas, thereby cooling the precursor ions.
  • an inert gas is introduced into the ion trap 2 as a cooling gas, thereby cooling the precursor ions.
  • the precursor ions are focused near the center of the ion trap 2.
  • the valve 52 of the hydrogen radical supply section 5 is opened, and gas containing hydrogen radicals is ejected from the nozzle 53.
  • Gas such as hydrogen gas is removed by the skimmer 54 located in front of the jet flow, and the hydrogen radicals that have passed through the opening of the skimmer 54 become a narrow beam shape, and the radicals formed in the ring electrode 21 are The particles pass through the particle inlet 26.
  • These hydrogen radicals are then introduced into the ion trap 2 and react with precursor ions captured within the ion trap 2.
  • the opening degree of the valve 52 is adjusted so that the flow rate of hydrogen radicals introduced into the ion trap 2 is equal to or higher than a predetermined flow rate (for example, 4 ⁇ 10 10 [atoms/s]).
  • the introduction time of hydrogen radicals is also set appropriately.
  • the precursor ion undergoes unpaired electron-induced dissociation, and fragment ions derived from the precursor ion are generated.
  • fragment ions generated by ion dissociation (ie, HAD) due to the reaction with hydrogen radicals as described above are captured in the ion trap 2 and cooled.
  • a high DC voltage is applied from the trap voltage generator 7 to the end cap electrodes 22 and 24 at a predetermined timing, and as a result, the fragment ions trapped in the ion trap 2 receive acceleration energy, and the ion injection hole 25 and are ejected all at once.
  • fragment ions having a certain acceleration energy are introduced into the flight space of the time-of-flight mass separator 3, and are separated according to m/z while flying through the flight space.
  • the ion detector 4 sequentially detects the separated fragment ions.
  • the mass spectrum creation unit 91 creates a time-of-flight spectrum with the time point at which fragment ions are ejected from the ion trap 2 as time zero. Then, by converting the flight time into m/z using mass calibration information obtained in advance, a mass spectrum of fragment ions is created.
  • a nucleic acid specimen (base sequence: 5'-GCACATTG-3', molecular weight: 2409.6), which is a single-stranded DNA, was used, and the nucleic acid specimen was subjected to MS 2 with ion dissociation by CID. (ie, CID-MS 2 analysis) and MS 2 analysis with ion dissociation by HAD (ie, HAD-MS 2 analysis).
  • the mass spectrometer used for the measurement was a MALDI digital ion trap time-of-flight mass spectrometer (MALDI-DIT-TOF MS, manufactured by Shimadzu Corporation) equipped with a hydrogen radical particle irradiation mechanism, as shown in FIG.
  • the nucleic acid preparation was introduced into the ion source 1, and MS 2 analysis was performed using the trivalent negative ion [M-3H] 3- as the precursor ion.
  • precursor ions are dissociated by supplying CID gas from gas supply section 6 to ion trap 2
  • precursor ions are dissociated from hydrogen radical supply section 5 to ion trap 2.
  • the precursor ion was dissociated by supplying hydrogen radicals.
  • the results of the CID-MS 2 analysis are shown in FIG. 3, and the results of the HAD-MS 2 analysis are shown in FIG. 4.
  • FIGS. 3 and 4 above the mass spectra of fragment ions, the base sequence of the nucleic acid preparation and identifiers indicating each ion type assigned from the peaks on the mass spectra are shown.
  • each peak in the mass spectrum is given an identifier representing the m/z of the peak and the ion species corresponding to the peak.
  • the identifier represents each ion species as a fragment ion series according to the naming rules for nucleic acid dissociation patterns.
  • fragment ions containing the 5' end are written as a n - , b n - , c n - , d n -, and fragment ions at the 3' end in the opposite direction are w m - , x m -. , y m - , z m - .
  • fragment ions at the 3' end in the opposite direction are w m - , x m -. , y m - , z m - .
  • the subscripts n and m indicate the number of constituent units (ie, the number of nucleotides) from the corresponding end to the dissociation site.
  • the mass spectrum (CID spectrum) shown in Figure 3 includes peaks of fragment ions with retained nucleobases that can be attributed to the base sequence, as well as peaks of fragment ions from which the nucleobases have been removed, which cannot be assigned to the base sequence.
  • [X-B(Y)] was observed.
  • [a 5 -B(A)] 2- in the figure is a peak in which one nucleobase adenine (A) is detached from the a 5 2- ion, but the 2- Since it is not possible to determine which of the two A's has been removed, this peak does not contribute to estimating the base sequence.
  • Such base elimination peaks not only do not contribute to estimation of the base sequence, but also complicate the mass spectrum, making it difficult to analyze the base sequence based on the mass spectrum.
  • the mass spectrometry conditions were adjusted to increase the amount of precursor ions and to improve the HAD reaction efficiency. It is thought that by doing so, it is possible to increase the types of fragment ions and improve the base sequence coverage (sequence coverage).
  • Step 102 Creation of peak list
  • the peak extraction section 92 extracts the mass spectrum from the mass spectrum under predetermined conditions (for example, the signal intensity is equal to or higher than a predetermined threshold value, etc.). ), and create a peak list that describes the m/z and intensity of each peak. Further, the peak extracting unit 92 inputs information to the structure estimating unit 93 along with the peak list that “the ions corresponding to each peak listed in the peak list are fragment ions retaining a nucleobase.” do.
  • Step 103 Estimation of structure of test nucleic acid
  • the structure estimating unit 93 that receives the information and the peak list estimates the base sequence of the test nucleic acid by database search or de novo sequencing.
  • the structure estimation unit 93 estimates a plurality of fragments that can be generated from each known nucleic acid based on the base sequence of each of the many known nucleic acids recorded in the nucleic acid database 96. Create an m/z list, which is a list containing the base sequences of The list is compared with the peak list of the test nucleic acid.
  • the test nucleic acid structure analysis apparatus since the test nucleic acid is analyzed by HAD-MS n analysis, it is assumed that all fragment ions generated from the test nucleic acid are base-retaining ions. I can do it. Therefore, in the apparatus according to the present embodiment, when performing the database search as described above, in addition to the peak list of the test nucleic acid, the above-mentioned "ions corresponding to each peak listed in the peak list are The information that the ion is a fragment ion that retains a nucleobase is also used.
  • the structure estimation unit 93 calculates the case where the ion corresponding to each of the plurality of fragments that can be generated from the known nucleic acid is a base-retaining ion.
  • an m/z list is created in which the base sequence of each fragment is associated with the theoretical m/z of the corresponding ion, and the m/z list for each known nucleic acid is Check against the nucleic acid peak list. Then, for each known nucleic acid, a score indicating the probability that the base sequence of the known nucleic acid is the same as the base sequence of the test nucleic acid is calculated.
  • the following processing is executed. First, for each peak included in the peak list of the test nucleic acid, it is determined whether the m/z of the peak falls within a predetermined m/z range centered on the theoretical m/z of a fragment that may arise from the known sequence. It is determined whether the peak can be assigned to the fragment by examining. Once it has been determined whether or not all the peaks in the peak list can be attributed, a total value of assigned peaks is calculated by summing up the signal intensities of all the peaks that can be assigned, and all peaks detected in the mass spectrum are calculated.
  • the total value of all peaks is calculated by summing the signal intensities of the peaks of , and the score is calculated based on the ratio of the total value of assigned peaks and the total value of all peaks.
  • This score indicates the degree of agreement between the base sequence of the known nucleic acid and the mass spectrum obtained by actually measuring the test nucleic acid. This can be said to match the mass spectrum obtained.
  • a score as described above is calculated for each of the plurality of known nucleic acids recorded in the nucleic acid database 96, and the base sequence of the known nucleic acid with the highest score is used as the estimation result of the base sequence of the test nucleic acid. .
  • the composition of the test nucleic acid is estimated from the m/z of the precursor ion of the test nucleic acid, and the composition predicted from the composition is Derive multiple base sequences (predicted sequences). Then, for each predicted sequence, the base sequences of multiple fragments that can be generated from the nucleic acid having the predicted sequence and the theoretical m/z of the ion (fragment ion) corresponding to each fragment are calculated, and the base sequence and the theoretical m/z of the ion (fragment ion) corresponding to each fragment are calculated. Create a list of masses that are associated with m/z.
  • Step 104 Displaying results
  • the display processing unit 94 displays the estimation result of the base sequence of the test nucleic acid on the display together with the mass spectrum of the fragment ion derived from the test nucleic acid obtained in step 101. 98 screen.
  • the structure estimating device in this embodiment further estimates the base sequence of the test nucleic acid.
  • the type etc. may be estimated.
  • the storage unit 95 stores the types of chemical modifications to nucleotides, the amount of change in m/z caused by various modifications, and the site within the nucleic acid that undergoes the modification. If it is known, a modification database is stored in which information about the part concerned is registered.
  • the modification database is referred to and structure estimation taking into account various chemical modifications is performed. I do.
  • the type of chemical modification imparted to the test nucleic acid or the type of chemical modification and the site to which the modification is applied
  • a nucleotide is composed of a sugar, a phosphate group, and a base
  • the types of chemical modifications stored in the modification database are broadly classified into modifications to sugars, modifications to phosphate groups, and modifications to bases.
  • chemical modification includes both modifications that occur in vivo, such as post-transcriptional modifications, and modifications that are artificially introduced.
  • modifications to sugars include 2'-O-methoxyethylation (2'-MOE), 2'-O-Methylation (2'-OMe), and 2'-Fluoro modification at the 2' position of the sugar moiety.
  • Modifications to phosphate groups include, for example, sulfation (S-substitution), conversion of PS to PO (replacement of the sulfur atom bonded to the phosphorus atom with an oxygen atom), trichloroacetaldehyde reactant, and conversion to C-phosphonate. conversion, ethylene phosphodiesterization, and phosphorodithioation.
  • Modifications to bases include, for example, pseudouridine, deamination, cyanoethyl addition to thymine, methylamine addition to cytosine, isobutyl addition to guanine, and cytosine converters, adenine converters, guanine converters, and pyrimidine. Examples include converters, thymine converters, and the like.
  • the base also has a molecular weight of about 150 and is a chemical modification group for sugars. Therefore, among the above-mentioned "modifications to sugars", it is predicted that when the modifying group has a molecular weight comparable to a base (or a molecular weight smaller than that), its elimination can be suppressed. Furthermore, regarding the above-mentioned "modification to the base", it is considered that the elimination of the modifying group can be suppressed as long as the molecular weight of the base does not increase significantly due to the modification.
  • the ion trap mass spectrometer of the above embodiment has a three-dimensional quadrupole configuration, but it may also be a linear ion trap.
  • the mass spectrometer is not limited to one equipped with an ion trap, but may be one capable of MS n analysis. A polar mass spectrometer can also be used.
  • the nucleic acid database 96 or the modification database is stored in the data processing unit 9, but the present invention is not limited to this. (not shown) may be stored in an external device connected via a cable (not shown). Alternatively, the nucleic acid database 96 or the modification database may be stored in a server on the Internet, and the computer constituting the data processing unit 9 may be connected to the Internet via the interface to utilize these databases. .
  • a database prepared in advance by a public institution or a mass spectrometer manufacturer may be used, or, for example, a database independently constructed by the user may be used.
  • the nucleic acid structure analysis apparatus may promote the dissociation of precursor ions by collisional activation in order to improve the dissociation efficiency of precursor ions by the HAD method.
  • Collisional activation is a method of applying supplemental energy from the outside by performing the same operation as the CID method with low energy that does not cause ions to dissociate (for example, see Patent Document 2).
  • hydrogen radicals are introduced into the ion trap 2 in which precursor ions derived from the test nucleic acid are captured, or during a predetermined period after the introduction (or both).
  • an inert gas is introduced into the ion trap 2.
  • the captured precursor ions are excited to collide with the gas.
  • the nucleic acid structure analysis apparatus and the nucleic acid structure analysis method according to the present embodiment perform mass spectrometry (HAD-MS n analysis) involving ion dissociation by the HAD method on a test nucleic acid as described above. (or before performing HAD-MS n analysis), perform mass spectrometry with ion dissociation using CID method (CID-MS n analysis) on the test nucleic acid, and complement the mass spectra obtained in both analyses. It may also be used to estimate the structure of a test nucleic acid.
  • HAD-MS n analysis mass spectrometry with ion dissociation by the HAD method on a test nucleic acid as described above.
  • CID-MS n analysis CID method
  • the ion source 1, ion trap 2, time-of-flight mass separation unit 3, ion detector 4, gas supply unit 6, trap voltage generation unit 7, and control unit in the nucleic acid structure analysis apparatus according to the present embodiment 8 corresponds to the "CID-MS n analysis execution unit" in the present invention.
  • a precursor ion having a specific m/z (having the same m/z as the precursor ion to be dissociated in the HAD-MS n analysis) is captured in the ion trap 2, and the gas
  • the valve 62 of the supply section 6 is opened to introduce an inert gas as a cooling gas into the ion trap 2 to cool the precursor ions.
  • a predetermined AC voltage is applied from the trap voltage generating section 7 to the end cap electrodes 22 and 24 to cause the precursor ions to resonate and collide with the inert gas (at this time, the inert gas functions as a CID gas).
  • the precursor ion undergoes energy accumulation type dissociation, and fragment ions derived from the test nucleic acid are generated. Thereafter, fragment ions in the ion trap are introduced into the flight space of the time-of-flight mass separator 3 at a predetermined timing, separated according to m/z, and detected by the ion detector 4.
  • the peak extraction unit 92 creates a peak list from each of the mass spectrum (HAD spectrum) obtained in step 201 and the mass spectrum (CID spectrum) obtained in step 202 (step 203), and the structure estimation unit 93 Then, the structure of the test nucleic acid is estimated by database search or de novo sequencing using both peak lists (step 204). Then, the display processing unit 94 displays the result of the structure estimation on the display unit 98 (step 205).
  • fragment ion information is obtained by applying the HAD method, which is an unpaired electron-induced dissociation method, and the CID method, which is an energy accumulation-type dissociation method, to the precursor ion derived from the test nucleic acid.
  • sequence coverage that is, the proportion of the identified sequence in the entire base sequence of the test nucleic acid
  • a nucleic acid structural analysis method includes: By introducing hydrogen radicals into the space where ions derived from the test nucleic acid exist, the ions are dissociated, and the m/z of the plurality of fragment ions is determined by mass spectrometry of the plurality of fragment ions generated thereby.
  • a HAD-MS n analysis step for collecting information on a structure estimation step of estimating the structure of the test nucleic acid based on m/z information of the plurality of fragment ions obtained in the HAD-MS n analysis step; It has the following.
  • the method for structural analysis of nucleic acids described in Section 1 includes: In the structure estimation step, the base sequence of the test nucleic acid is estimated by de novo sequencing, with the condition that each of the plurality of fragment ions holds a chemical modification group for a nucleic acid base or a nucleotide.
  • the de novo sequencing may be performed based on the above.
  • the method for structural analysis of nucleic acids described in Section 1 includes: In the structure estimation step, the base sequence of the test nucleic acid is estimated by searching a nucleic acid database containing base sequences of a plurality of known nucleic acids, wherein each of the plurality of fragment ions corresponds to a nucleic acid base or a nucleotide.
  • the database search may be performed with the condition that a chemical modification group is retained.
  • the nucleic acid structural analysis method described in Section 2 or 3 includes:
  • the chemical modification group for the nucleotide may be a chemical modification group for a sugar contained in the nucleotide.
  • the nucleic acid structure analysis device includes: By introducing hydrogen radicals into the space where ions derived from the test nucleic acid exist, the ions are dissociated, and the m/z of the plurality of fragment ions is determined by mass spectrometry of the plurality of fragment ions generated thereby.
  • a HAD-MS n analysis execution unit that collects information on a structure estimation unit that estimates the structure of the test nucleic acid based on m/z information of the plurality of fragment ions obtained by the HAD-MS n analysis execution unit; It has the following.
  • the nucleic acid structure analysis device estimates the base sequence of the test nucleic acid by de novo sequencing, and each of the plurality of fragment ions holds a chemical modification group for a nucleic acid base or a nucleotide.
  • the de novo sequencing may be performed based on the above.
  • the nucleic acid structure analysis device estimates the base sequence of the test nucleic acid by searching a nucleic acid database containing base sequences of a plurality of known nucleic acids, and each of the plurality of fragment ions corresponds to a nucleic acid base or a nucleotide.
  • the database search may be performed with the condition that a chemical modification group is retained.
  • the nucleic acid structure analysis apparatus according to any one of Items 7 to 9,
  • the HAD-MS n analysis unit further introduces neutral particles into the space at least one of the periods before or after introducing the hydrogen radicals into the space, and the analyte that is present in the space.
  • the dissociation of the ions may be promoted by exciting the ions derived from the nucleic acid and causing them to collide with the neutral particles.
  • the nucleic acid structure analysis device according to any one of Items 7 to 9, A neutral molecule is introduced into the space where the ions derived from the test nucleic acid exist, the ions are dissociated by colliding with the neutral molecules, and the multiple fragment ions thus generated are a CID-MS n analysis unit that collects m/z information of the plurality of fragment ions by analyzing; It further has The structure analysis unit may use m/z information of the plurality of fragment ions collected by the HAD-MS n analysis unit and m/z information of the plurality of fragment ions collected by the CID-MS n analysis unit.
  • the structure of the test nucleic acid may be estimated based on the information.
  • the nucleic acid structure analysis device according to Section 8 or 9,
  • the chemical modification group for the nucleotide may be a chemical modification group for a sugar contained in the nucleotide.
  • nucleic acid structural analysis method described in item 1 or the nucleic acid structural analysis apparatus described in item 7 it is possible to deal with precursor ions of various charges and to easily estimate the structure of nucleic acids based on mass spectra. becomes possible.
  • each of the plurality of fragment ions is a base-eliminating ion or an ion from which a chemical modification group has been removed. Since the structure of the test nucleic acid can be estimated by searching the database without considering the case, the amount of calculation in the structure estimation can be suppressed.
  • each of the plurality of fragment ions is a base-eliminating ion or an ion from which a chemical modification group has been removed. Since the structure of the test nucleic acid can be estimated by the de novo sequencing without considering the case, the amount of calculation in the structure estimation can be suppressed.
  • nucleic acid structural analysis method described in item 4 or the nucleic acid structural analysis apparatus described in item 10 dissociation of precursor ions in HAD-MS n analysis can be promoted, so that the SN ratio of the analysis can be improved to increase the accuracy of structure estimation.
  • nucleic acid structure analysis method described in Section 5 According to the nucleic acid structure analysis method described in Section 5 or the nucleic acid structure analysis apparatus described in Section 11, sequence coverage in structure estimation can be improved.

Abstract

被検核酸由来のイオンが存在する空間に対して水素ラジカルを導入することによって該イオンを解離させ、それにより生成された複数のフラグメントイオンを質量分析することで前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報を収集するＨＡＤ－ＭＳｎ分析ステップ（１０１）と、前記ＨＡＤ－ＭＳｎ分析ステップで得られた前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報に基づいて、前記被検核酸の構造を推定する構造推定ステップ（１０３）と、を有する核酸の構造解析方法。これにより、様々な電荷のプリカーサイオンに対応可能となり、且つマススペクトルに基づく核酸の構造推定が容易となる。

Description

核酸の構造解析方法及び核酸の構造解析装置
　本発明は、核酸の構造解析方法及び核酸の構造解析装置に関する。
　核酸の構造解析方法、すなわち、ＤＮＡ又はＲＮＡの塩基配列を決定したり、化学修飾の種類又は該化学修飾が施された部位を特定したりする方法の一つとして、近年、質量分析を用いた方法が広く利用されている。このような解析では、ｎ－１回のイオンの開裂を伴う質量分析であるＭＳｎ分析（ｎは２以上の整数）を実行可能な質量分析装置を使用して、解析対象とする核酸に対してＭＳｎ分析を実施する。即ち、目的の核酸（被検核酸）から生成したイオンを適宜の解離手法で解離させ、元のイオン（これをプリカーサイオンという）が断片化した各種のフラグメントイオン（プロダクトイオンともよばれる）を生成させる。このフラグメントイオンをｍ／ｚ（質量電荷比）に応じて分離して検出し、各フラグメントイオンのｍ／ｚと検出強度を表したマススペクトルを作成する。
　上記のような核酸のＭＳｎ分析におけるプリカーサイオンの解離手法としては、プリカーサイオンをガス（通常は不活性ガス）と衝突させて解離を促す衝突誘起解離（ＣＩＤ：Collision Induced Dissociation）法、赤外線レーザで内部エネルギを上昇させてプリカーサイオンの解離を促す赤外多光子解離（ＩＲＭＰＤ：Infrared Multiphoton Dissociation）法、プリカーサイオンに負イオンを衝突させる電子移動解離（ＥＴＤ：Electron Transfer Dissociation）法、プリカーサイオンに電子を照射する電子捕獲解離（ＥＣＤ：Electron Capture Dissociation）法などが知られている。
特開2016-223777号公報 国際公開第2015/133259号
Stefan Schurch, Mass Spectrometry Reviews, 2016, Volume35, Issue 4, pp.483-523
　核酸由来のプリカーサイオンをＣＩＤ法又はＩＲＭＰＤ法によって解離させた場合には、核酸塩基（以下、単に塩基とよぶことがある）が脱離したフラグメントイオン（塩基脱離イオン）が生じたり（例えば、非特許文献１を参照）、プリカーサイオンの糖－リン酸骨格が複数箇所で解離して生じる内部フラグメントイオンや、プリカーサイオンから電荷をもたない化学種が取り去られて生じるニュートラルロスイオンが発生したりしやすいという問題がある。これらの塩基脱離イオン、内部フラグメントイオン、又はニュートラルロスイオンは、塩基配列の推定に寄与しないため、ＣＩＤ法又はＩＲＭＰＤ法を用いた場合には、マススペクトルを解析して核酸の塩基配列を推定する難度が高くなるという問題がある。
　一方、ＥＴＤ法又はＥＣＤ法では、上記のような塩基脱離イオン、内部フラグメントイオン、又はニュートラルロスイオンは生じにくい。しかし、ＥＴＤ法及びＥＣＤ法は、一般的に正イオンに対してのみ有効であって、負イオンを解離させることは難しい。なお、負イオンを解離可能なネガティブＥＴＤ（ＮＥＴＤ）とよばれる手法も存在するが、この手法でも１価の負イオンを解離させることはできないという制約がある。また、ＥＴＤ法及びＥＣＤ法は、その原理上、多価イオンの解離しか行うことができない。よく知られているように、マトリクス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法などのイオン化法により生成されるイオンは、主に、１価の正イオンであるため、１価の正イオンの解離が行えないと、分析手法としては大きな制約となる。
　本発明はこのような点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、様々な電荷のプリカーサイオンに対応でき、且つマススペクトルに基づく核酸の構造推定が容易である、核酸の構造解析方法及び核酸の構造解析装置を提供することである。
　上記課題を解決するために成された本発明に係る核酸の構造解析方法は、
　被検核酸由来のイオンが存在する空間に対して水素ラジカルを導入することによって該イオンを解離させ、それにより生成された複数のフラグメントイオンを質量分析することで前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報を収集するＨＡＤ－ＭＳｎ分析ステップと、
　前記ＨＡＤ－ＭＳｎ分析ステップで得られた前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報に基づいて、前記被検核酸の構造を推定する構造推定ステップと、
　を有するものである。
　また、上記課題を解決するために成された本発明に係る核酸の構造解析装置は、
　被検核酸由来のイオンが存在する空間に対して水素ラジカルを導入することによって該イオンを解離させ、それにより生成された複数のフラグメントイオンを質量分析することで前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報を収集するＨＡＤ－ＭＳｎ分析実行部と、
　前記ＨＡＤ－ＭＳｎ分析実行部で得られた前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報に基づいて、前記被検核酸の構造を推定する構造推定部と、
　を有するものである。
　上記本発明に係る核酸の構造解析方法又は核酸の構造解析装置によれば、様々な電荷のプリカーサイオンに対応できると共に、マススペクトルに基づく核酸の構造推定を容易に行うことが可能となる。
本発明の一実施形態に係る核酸の構造解析装置の概略構成図。 前記装置による核酸の構造解析手順の一例を示すフローチャート。 核酸標品のＣＩＤ－ＭＳ２分析によって得られたフラグメントイオンのマススペクトル、並びに前記核酸標品の塩基配列及び帰属された各系列イオンを示す図。 核酸標品のＨＡＤ－ＭＳ２分析によって得られたフラグメントイオンのマススペクトル、並びに前記核酸標品の塩基配列及び帰属された各系列イオンを示す図。 前記装置による核酸の構造解析手順の別の例を示すフローチャート。
　本発明者らは、非荷電粒子を用いた不対電子誘導型解離の一方法として水素ラジカルをイオンに付着させることでイオンを解離させる方法の研究を鋭意行っており、水素ラジカルを用いてペプチド由来のイオンを良好に解離する手法を既に提案している（特許文献１を参照）。この解離手法によれば、ＥＴＤ法やＥＣＤ法等の荷電粒子を利用した不対電子誘導型解離法では解離が行えなかった１価のイオンや負イオンも高い効率で解離することができる。
　本発明者らは上記のような水素ラジカル粒子の付着によるイオン解離法（Hydrogen Attachment Dissociation、以下「ＨＡＤ」という）に関する各種実験を繰り返す過程で、核酸由来のイオンをＨＡＤによって解離した場合には、上述のような塩基脱離イオン、ニュートラルロスイオン、及び内部フラグメントイオンなどの、核酸の構造決定に寄与しないフラグメントイオンが発生しにくいという特徴を見出し、この知見に基づいて本発明に想到した。
　以下、本発明に係る核酸の構造解析装置及び構造解析方法の一実施形態について、図面を参照して説明する。図１は本実施形態に係る核酸の構造解析装置を示す概略構成図である。
　この核酸の構造解析装置は質量分析装置を含み、質量分析装置は、目的試料成分（すなわち被検核酸）をイオン化するイオン源１と、イオン源１で生成されたイオンを高周波電場の作用により捕捉するイオントラップ２と、イオントラップ２から射出されたイオンをｍ／ｚに応じて分離する飛行時間型質量分離部３と、分離されたイオンを検出するイオン検出器４とを備える。また、質量分析装置は、イオントラップ２内に捕捉されているイオンを解離させるべく該イオントラップ２内に水素ラジカルを供給するための水素ラジカル供給部５と、イオントラップ２内に所定のガスを供給するガス供給部６と、トラップ電圧発生部７と、制御部８と、を有する。イオン検出器４による検出信号はデータ処理部９に入力される。なお、これらのイオン源１、イオントラップ２、飛行時間型質量分離部３、イオン検出器４、水素ラジカル供給部５、ガス供給部６、トラップ電圧発生部７、及び制御部８が、本発明における「ＨＡＤ－ＭＳｎ分析実行部」に相当する。
　制御部８及びデータ処理部９の実態は、パーソナルコンピュータ等のコンピュータである。データ処理部９は、本実施形態に係る核酸の構造解析装置に特徴的な解析処理を行うものであり、マススペクトル作成部９１、ピーク抽出部９２、構造推定部９３、及び表示処理部９４を機能ブロックとして含む。これらの機能ブロックは、前記コンピュータに予めインストールされた所定のプログラムを実行することにより具現化される。また、データ処理部９を構成するコンピュータに設けられた記憶部９５には、天然又は人工の多数の既知核酸の塩基配列等の情報が収録された核酸データベース（核酸ＤＢ）９６が保存されている。さらに、データ処理部９には、キーボード及びマウス等のポインティングデバイスから成る入力部９７と、液晶ディスプレイ等から成る表示部９８が接続されている。
　イオン源１は例えば、ＭＡＬＤＩ法などのイオン化法を用いたイオン源である。イオントラップ２は、円環状のリング電極２１と、該リング電極２１を挟んで対向配置された一対のエンドキャップ電極２２、２４と、を含む３次元四重極型のイオントラップである。制御部８による指示に応じてトラップ電圧発生部７は、上記電極２１、２２、２４のそれぞれに対し、所定のタイミングで高周波電圧と直流電圧のいずれか一方又はそれらを合成した電圧を印加する。飛行時間型質量分離部３はこの例ではリニア型であるが、リフレクトロン型やマルチターン型等でもよく、また飛行時間型の質量分離器ではなく、例えばイオントラップ２自体のイオン分離機能を利用して質量分離を行うものやオービトラップなどでもよい。
　水素ラジカル供給部５は、水素ラジカルを貯留した又は水素ラジカルを生成する水素ラジカル供給源５１と、流量を調節可能であるバルブ５２と、水素ラジカルを噴出するノズル５３と、ノズル５３からの噴出流の中心軸上に開口を有し、拡散する水素分子等のガスを分離して細径の水素ラジカル流を取り出すスキマー５４と、を含む。
　ガス供給部６は、ヘリウムガス又はアルゴンガス等の不活性ガスを貯留したガス供給源６１と、流量を調節可能であるバルブ６２と、を含む。
　本実施形態の核酸の構造解析装置における構造解析の手順について図２のフローチャートを参照しつつ説明する。
［ステップ１０１：被検核酸のＨＡＤ－ＭＳｎ分析］
　まず、被検核酸を含む試料についてＨＡＤ法によるイオンの解離を伴う質量分析（以下、ＨＡＤ－ＭＳｎ分析とよぶ）を行う。このとき、イオン源１において被検核酸を含む試料から生成された各種イオンは、パケット状にイオン源１から射出され、入口側エンドキャップ電極２２に形成されているイオン導入孔２３を経てイオントラップ２の内部に導入される。イオントラップ２内に導入された被検核酸由来のイオンは、トラップ電圧発生部７からリング電極２１に印加される電圧によってイオントラップ２内に形成される高周波電場に捕捉される。そのあと、トラップ電圧発生部７からリング電極２１等に所定の電圧が印加され、それによって目的とする特定のｍ／ｚを有するイオン以外のイオンは励振され、イオントラップ２から排除される。これにより、イオントラップ２内に、特定のｍ／ｚを有するプリカーサイオンが選択的に捕捉される。
　それに続き、ガス供給部６においてバルブ６２が開放され、イオントラップ２内にクーリングガスとして不活性ガスが導入されることで、プリカーサイオンのクーリングが行われる。これにより、プリカーサイオンはイオントラップ２の中心付近に収束される。
　その状態で、水素ラジカル供給部５のバルブ５２が開放され、水素ラジカルを含んだガスがノズル５３から噴出する。その噴出流の前方に位置するスキマー５４により、水素ガスなどのガスは除去され、スキマー５４の開口を通過した水素ラジカルは細径のビーム状となって、リング電極２１に穿設されているラジカル粒子導入口２６を通過する。そして、この水素ラジカルはイオントラップ２内に導入され、イオントラップ２内に捕捉されているプリカーサイオンと反応する。このときバルブ５２の開度は、イオントラップ２に導入される水素ラジカルの流量が所定流量（例えば4×1010 [atoms/s]）以上になるように調整される。また、水素ラジカルの導入時間も適宜に設定される。水素ラジカルとの反応によって、プリカーサイオンは不対電子誘導型の解離を生じ、該プリカーサイオン由来のフラグメントイオンが生成される。以上のような水素ラジカルとの反応によるイオンの解離（すなわちＨＡＤ）により生成された各種フラグメントイオンは、イオントラップ２内に捕捉され、クーリングが行われる。
　そのあと、所定のタイミングでトラップ電圧発生部７からエンドキャップ電極２２、２４に直流高電圧が印加され、これにより、イオントラップ２内に捕捉されていたフラグメントイオンは加速エネルギを受け、イオン射出孔２５を通して一斉に射出される。こうして一定の加速エネルギを持ったフラグメントイオンが飛行時間型質量分離部３の飛行空間に導入され、飛行空間を飛行する間にｍ／ｚに応じて分離される。イオン検出器４は分離されたフラグメントイオンを順次検出する。イオン検出器４からの検出信号を受けたデータ処理部９において、マススペクトル作成部９１はイオントラップ２からのフラグメントイオンの射出時点を時刻ゼロとする飛行時間スペクトルを作成する。そして、予め求めておいた質量校正情報を用いて飛行時間をｍ／ｚに換算することにより、フラグメントイオンによるマススペクトルを作成する。
　こうして得られたマススペクトルには、被検核酸に由来する各種のフラグメントイオンのピークが観測されるが、ＨＡＤ法によるイオン解離を行うことにより、核酸塩基が脱離したフラグメントイオン等の、被検核酸の構造推定に寄与しないフラグメントイオンの発生を抑えることができる。このことを、実測例を参照しつつ以下に説明する。
　実測には、一本鎖ＤＮＡである核酸標品（塩基配列：５’－ＧＣＡＣＡＴＴＧ－３’、分子量：2409.6）を使用し、該核酸標品に対して、ＣＩＤによるイオン解離を伴ったＭＳ２分析（すなわちＣＩＤ－ＭＳ２分析）と、ＨＡＤによるイオン解離を伴ったＭＳ２分析（すなわちＨＡＤ－ＭＳ２分析）を行った。測定に使用した質量分析装置は、図１に示したような、水素ラジカル粒子照射機構を具備したＭＡＬＤＩデジタルイオントラップ飛行時間型質量分析計（MALDI-DIT-TOF MS：島津製作所製）である。実測に際しては、前記核酸標品をイオン源１に導入し、３価の負イオン［Ｍ－３Ｈ］３－をプリカーサイオンとしてＭＳ２分析を行った。なお、ＣＩＤ－ＭＳ２分析においては、ガス供給部６からイオントラップ２へＣＩＤガスを供給することによってプリカーサイオンを解離させ、ＨＡＤ－ＭＳ２分析においては、水素ラジカル供給部５からイオントラップ２へ水素ラジカルを供給することによってプリカーサイオンを解離させた。
　前記ＣＩＤ－ＭＳ２分析の結果を図３に、ＨＡＤ－ＭＳ２分析の結果を図４に示す。なお、図３及び図４においてフラグメントイオンのマススペクトルの上部には、前記核酸標品の塩基配列と、該マススペクトル上のピークから帰属された各イオン種を示す識別子を示している。また、図３及び図４において、マススペクトル中の各ピークには、そのピークのｍ／ｚと、該ピークに対応するイオン種を表す識別子を付している。前記識別子は、各イオン種を核酸の解離パターン命名規則に従ったフラグメントイオン系列で表したものである。この命名規則では、５’末端を含むフラグメントイオンは、ａｎ －、ｂｎ －、ｃｎ －、ｄｎ －と表記され、反対方向の３’末端のフラグメントイオンはｗｍ －、ｘｍ －、ｙｍ －、ｚｍ －と表記される。なお、添え字のｎとｍは、対応する末端から解離部位までの構成単位数（すなわちヌクレオチドの数）を示す。
　図３に示すマススペクトル（ＣＩＤスペクトル）には、塩基配列に帰属可能な、核酸塩基が保持されたフラグメントイオンのピークに加えて、塩基配列に帰属できない、核酸塩基が脱離したフラグメントイオンのピーク［Ｘ－Ｂ（Ｙ）］がみられた。例えば、同図における［ａ５－Ｂ（Ａ）］２－は、ａ５ ２－イオンから核酸塩基のアデニン（Ａ）が１つ脱離したピークであるが、前記核酸標品に含まれる２つのＡのうちどちらが脱離したのかは特定できないため、このピークは塩基配列の推定に寄与しない。このような塩基脱離ピークは、塩基配列の推定に寄与しないだけでなく、マススペクトルを複雑にするため、該マススペクトルに基づいた塩基配列の解析が困難となる。
　これに対し、図４に示すマススペクトル（ＨＡＤスペクトル）には、上記のような塩基脱離ピークは観察されず、ＣＩＤスペクトルを用いた場合よりも、被検核酸の塩基配列をより広範囲に亘って特定できることがわかる。具体的には、該スペクトル上のフラグメントイオンピークから、５’側の３塩基分の配列（ＧＣＡ）と、３’側の２塩基分の配列（ＴＧ）を特定することができる。更に、フラグメントイオンｚ５とフラグメントイオンａ７のｍ／ｚ差から、５’側の３塩基と３’側の２塩基との間は、核酸塩基ＣとＡとＴの組み合わせであることも特定できる。なお、この実測例におけるＨＡＤスペクトルでは、前記核酸標品の塩基配列全体をカバーすることはできなかったが、質量分析条件を調整してプリカーサイオンのイオン量を増やしたり、ＨＡＤの反応効率を高めたりすることで、フラグメントイオンの種類を増やして塩基配列のカバー率（シーケンスカバレッジ）を向上させることができると考えられる。
［ステップ１０２：ピークリストの作成］
　本実施形態に係る核酸の構造解析装置では、マススペクトル作成部９１においてフラグメントイオンのマススペクトルが作成されると、ピーク抽出部９２が該マススペクトルから所定の条件（例えば信号強度が所定閾値以上など）を満たすピークを全て抽出し、各ピークのｍ／ｚ及び強度を記載したピークリストを作成する。さらに、ピーク抽出部９２は、前記ピークリストと共に、「該ピークリストに記載されている各ピークに対応するイオンは、核酸塩基を保持したフラグメントイオンである」との情報を構造推定部９３に入力する。
［ステップ１０３：被検核酸の構造推定］
　前記情報及びピークリストを受け取った構造推定部９３は、データベース検索又はデノボシーケンシング（De novo sequencing）によって、被検核酸の塩基配列を推定する。
　データベース検索によって塩基配列の推定を行う場合、構造推定部９３は、核酸データベース９６に収録されている多数の既知核酸の各々の塩基配列に基づいて、各既知核酸から生じ得る複数の断片（フラグメント）の塩基配列と、各断片に対応するイオン（フラグメントイオン）のｍ／ｚの理論値（理論ｍ／ｚ）とを記載したリストであるｍ／ｚリストを作成し、各既知核酸に関するｍ／ｚリストを、前記被検核酸のピークリストと照合する。
　従来のようにＣＩＤ－ＭＳｎ分析によって被検核酸を分析した場合、核酸塩基が脱離したフラグメントイオン（塩基脱離イオン）と、核酸塩基が脱離していないフラグメントイオン（塩基保持イオン）の両方が生じるため、上記データベース検索においてその両方を考慮した検索を行う必要があった。すなわち、前記既知核酸から生じ得る複数の断片の各々について、該断片に対応するイオンが塩基脱離イオンである場合と塩基保持イオンである場合の両方について理論ｍ／ｚを算出し、それら理論ｍ／ｚを記載したｍ／ｚリストと、前記被検核酸のピークリストとを照合する必要があるため、計算量が増えると共に、誤答率が上がる要因になり得るという問題があった。
　これに対し、本実施形態に係る核酸の構造解析装置では、被検核酸をＨＡＤ－ＭＳｎ分析によって分析するため、該被検核酸から生じるフラグメントイオンはいずれも塩基保持イオンであると仮定することができる。そこで、本実施形態に係る装置では、上記のようなデータベース検索を行う際に、被検核酸のピークリストに加えて、上述した「該ピークリストに記載されている各ピークに対応するイオンは、核酸塩基を保持したフラグメントイオンである」という情報も併せて利用する。すなわち、構造推定部９３は、核酸データベース９６に収録されている多数の既知核酸の各々について、当該既知核酸から生じ得る複数の断片（フラグメント）の各々に対応するイオンが塩基保持イオンである場合のｍ／ｚを算出するとともに、各断片の塩基配列とそれに対応するイオンの理論ｍ／ｚとを対応付けて記載したｍ／ｚリストを作成し、各既知核酸に関するｍ／ｚリストを、被検核酸のピークリストと照合する。そして、各既知核酸について、該既知核酸の塩基配列が被検核酸の塩基配列と同じである蓋然性を示すスコアを算出する。
　具体的には、例えば次のような処理を実行する。まず、被検核酸のピークリストに含まれる各ピークについて、該ピークのｍ／ｚが、前記既知配列から生じ得る断片の理論ｍ／ｚを中心とする所定のｍ／ｚ範囲に収まるか否かを調べることによって、該ピークが当該断片に帰属可能であるか否かを調べる。そして、前記ピークリスト中の全てのピークについて帰属の可否が判定されたならば、帰属できたピークの信号強度を全て合計した帰属済みピーク合算値を計算するとともに、該マススペクトルにおいて検出された全てのピークの信号強度を合算した全ピーク合算値を計算し、帰属済みピーク合算値と全ピーク合算値との比に基づいて前記スコアを算出する。このスコアは前記既知核酸の塩基配列と、被検核酸を実際に測定して得られたマススペクトルとの一致度を示しており、スコアが高いほど、該既知核酸の塩基配列は、実測で得られたマススペクトルに合致したものであるといえる。そして、核酸データベース９６に収録されている複数の既知核酸の各々について上記のようなスコアを算出し、該スコアが最も高かった既知核酸の塩基配列を、被検核酸の塩基配列の推定結果とする。
　また、構造推定部９３においてデノボシーケンシングによる塩基配列の推定を行う場合には、まず、被検核酸のプリカーサイオンのｍ／ｚから該被検核酸の組成を推定し、該組成から予測される複数の塩基配列（予測配列）を導出する。そして、各予測配列について、該予測配列を有する核酸から生じ得る複数の断片の塩基配列と、各断片に対応するイオン（フラグメントイオン）の理論ｍ／ｚとを算出し、該塩基配列と該理論ｍ／ｚとを対応付けて記載した質量リストを作成する。この場合も、本実施形態においては、前記理論ｍ／ｚとして塩基保持イオンのｍ／ｚのみを算出すればよいため、計算量を抑えることができる。その後、前記予測配列の各々について、前記断片の塩基配列とそれに対応するイオンの理論ｍ／ｚを対応付けて記載したｍ／ｚリストを作成し、これらのｍ／ｚリストと、被検核酸のピークリストとを照合する。この場合も、例えば、各予測配列について、上記同様のスコアを算出し、該スコアが最も高かった予測配列を、被検核酸の塩基配列の推定結果とする。
［ステップ１０４：結果の表示］
　以上により、被検核酸の構造推定が完了すると、表示処理部９４が、ステップ１０１で得られた被検核酸由来のフラグメントイオンのマススペクトルと共に、該被検核酸の塩基配列の推定結果を表示部９８の画面上に表示させる。
　なお、上記の例では被検核酸の構造として、その塩基配列を推定する例を示したが、本実施形態における構造推定装置は、更に、該被検核酸に転写後修飾等の化学修飾がある場合に、その種類等を推定するものとしてもよい。その場合、記憶部９５には、核酸データベース９６に加えて（又は代えて）、ヌクレオチドに対する化学修飾の種類及び各種の修飾によって生じるｍ／ｚの変化量、並びに当該修飾を受ける核酸内の部位が既知である場合には当該部位の情報、を登録した修飾データベースを記憶させておく。そして、ステップ１０１で得られたマススペクトルから作成された質量リストを用いてデータベース検索又はデノボシーケンシングによる構造推定を行う際に、前記修飾データベースを参照して、各種の化学修飾を考慮した構造推定を行う。これにより、被検核酸の塩基配列に加えて、該被検核酸に付与されている化学修飾の種類（又は化学修飾の種類と該修飾が施されている部位）を推定することができる。
　なお、ヌクレオチドは、糖、リン酸基、及び塩基で構成されているため、前記修飾データベースに記憶させる化学修飾の種類は、糖に対する修飾、リン酸基に対する修飾、及び塩基に対する修飾に大別される。ここで化学修飾とは、転写後修飾等の生体内で発生する修飾と、人工的に導入された修飾の両方を含むものとする。
　糖に対する修飾としては、例えば、糖部2’位の修飾である2′-O-methoxyethyl化（2′-MOE）、2'-O-Methyl化（2’-OMe）、及び2'-Fluoro化（2’-F）、並びに糖部2’位の酸素原子と4’位の炭素原子間が架橋された2’, 4’-BNA（LNA）修飾、糖部2’位のO-alkyl化又はO-alkoxyalkyl化、ピリミジン糖部2’位F体からのanhydro体又はarabino体への変換、Abasic体への変換、2’-5’ホスホジエステル結合体への変換、及び3’→3’(5’→5’)結合体への変換などが挙げられる。
　リン酸基に対する修飾としては、例えば、硫黄化（S化）、PSからPOへの変換（リン原子に結合した硫黄原子の酸素原子への置換）、トリクロロアセトアルデヒド反応物、C-ホスホネート体への変換、エチレンホスホジエステル化、及びホスホロジチオエート化などが挙げられる。
　塩基に対する修飾としては、例えば、シュードウリジン化、脱アミノ化、チミンへのシアノエチル付加、シトシンへのメチルアミン付加、及びグアニンへのイソブチル付加、並びにシトシン変換体、アデニン変換体、グアニン変換体、ピリミジン変換体、及びチミン変換体などが挙げられる。
　上述した通り、図３及び図４で示した実測例により、ＨＡＤ法によるイオンの解離によって塩基の脱離が抑制できることが確認できた。塩基は約１５０程度の分子量を有する、糖に対する化学修飾基でもある。したがって、上記の「糖に対する修飾」のうち、修飾基が塩基程度の分子量を有するもの（又はそれよりも小さい分子量を有するもの）については、その脱離が抑制できると予測される。また、上記の「塩基に対する修飾」についても、該修飾によって塩基の分子量が大きく増加しないのであれば、修飾基の脱離が抑制できると考えられる。更に、上記の「リン酸基に対する修飾」についても、修飾基の分子量が塩基と同程度（又はそれよりも小さいもの）であれば、その脱離が抑制できると予想される。このように、ＨＡＤ法によるイオンの解離では、上述のような塩基の脱離に加えて、修飾の脱離も抑制できると予測されることから、被検核酸由来のプリカーサイオンに対して、ＨＡＤ法による解離を施すことにより、こうした化学修飾の種類や部位の推定に有用なフラグメントイオンを生成できると考えられる。
　なお、上記実施形態は本発明の一例に過ぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜、変形、追加、修正を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。例えば、上記実施形態のイオントラップ質量分析装置では、イオントラップは三次元四重極型の構成であるが、リニア型イオントラップとしてもよい。また、質量分析装置は、イオントラップを備えたものに限らず、ＭＳｎ分析が可能なものであればよく、例えば、コリジョンセルを挟んで前後に四重極マスフィルタを備えた三連四重極型質量分析装置を用いることもできる。
　また、上記では、核酸データベース９６又は前記修飾データベースを、データ処理部９内に格納するものとしたが、これに限らず、これらのデータベースを、データ処理部９を構成するコンピュータに設けられたインターフェース（図示略）を介して接続された外部装置に格納してもよい。また、核酸データベース９６又は前記修飾データベースをインターネット上のサーバ等に格納し、前記インターフェースを介してデータ処理部９を構成するコンピュータをインターネットに接続することによって、これらのデータベースを利用する構成としてもよい。こうしたデータベースとしては、公共の機関又は質量分析装置のメーカーが予め用意したデータベースを用いるほか、例えば、ユーザが独自に構築したデータベースを用いるようにしてもよい。
　なお、本実施形態に係る核酸の構造解析装置は、ＨＡＤ法によるプリカーサイオンの解離効率を向上させるため、コリジョナル・アクティベーションによるプリカーサイオンの解離促進を行うものとしてもよい。コリジョナル・アクティベーションは、ＣＩＤ法と同様の操作を、イオンが解離しない程度の低いエネルギで以て行うことにより、外部から補助的にエネルギを与える手法である（例えば、特許文献２を参照）。
　コリジョナル・アクティベーションによる解離促進を行う場合、水素ラジカルを、被検核酸由来のプリカーサイオンが捕捉されているイオントラップ２の内部に導入する前又は導入した後（又はその両方）の所定の期間に亘って、ガス供給部６からイオントラップ２内に不活性ガスを導入すると共に、トラップ電圧発生部７からエンドキャップ電極２２、２４に所定の共鳴励起電圧を印加することによって、イオントラップ２内に捕捉されているプリカーサイオンを励振させて前記ガスと衝突させる。これにより、水素ラジカルと反応する前のプリカーサイオン、又は水素ラジカルと反応したものの解離されずにイオントラップ２内に存在しているプリカーサイオンにエネルギを与えて、該イオンの解離を促進することができる。
　また、本実施形態に係る核酸の構造解析装置及び核酸の構造解析方法は、被検核酸に対して上記のようなＨＡＤ法によるイオン解離を伴う質量分析（ＨＡＤ－ＭＳｎ分析）を行った後（又はＨＡＤ－ＭＳｎ分析を行う前）に、該被検核酸に対してＣＩＤ法によるイオン解離を伴う質量分析（ＣＩＤ－ＭＳｎ分析）を行って、両分析で得られたマススペクトルを相補的に用いて被検核酸の構造を推定するものとしてもよい。この場合、本実施形態に係る核酸の構造解析装置における、イオン源１、イオントラップ２、飛行時間型質量分離部３、イオン検出器４、ガス供給部６、トラップ電圧発生部７、及び制御部８が、本発明における「ＣＩＤ－ＭＳｎ分析実行部」に相当する。
　この場合における、核酸の構造解析手順の一例を図５に示す。なお、同図では、被検核酸のＨＡＤ－ＭＳｎ分析（ステップ２０１）を行った後に、該被検核酸のＣＩＤ－ＭＳｎ分析（ステップ２０２）を行うものとしているが、ＨＡＤ－ＭＳｎ分析とＣＩＤ－ＭＳｎは逆の順序で実行してもよい。また、ＨＡＤ－ＭＳｎ分析においては、上述のようなコリジョナル・アクティベーションによるプリカーサイオンの解離促進を行ってもよい。
　前記ＣＩＤ－ＭＳｎ分析においては、イオントラップ２内に特定のｍ／ｚを有するプリカーサイオン（ＨＡＤ－ＭＳｎ分析で解離対象とするプリカーサイオンと同じｍ／ｚを有するもの）を捕捉し、ガス供給部６のバルブ６２を開いてイオントラップ２内にクーリングガスとして不活性ガスを導入して前記プリカーサイオンのクーリングを行う。そして、その後に、トラップ電圧発生部７からエンドキャップ電極２２、２４に所定の交流電圧を印加し、前記プリカーサイオンを共鳴励振させて前記不活性ガスと衝突させる（このとき、該不活性ガスはＣＩＤガスとして機能する）。これにより、プリカーサイオンはエネルギ蓄積型の解離を生じ、被検核酸由来のフラグメントイオンが生成される。その後、所定のタイミングでイオントラップ内のフラグメントイオンを飛行時間型質量分離部３の飛行空間に導入し、ｍ／ｚに応じて分離し、イオン検出器４で検出する。
　その後は、ピーク抽出部９２がステップ２０１で得られたマススペクトル（ＨＡＤスペクトル）とステップ２０２で得られたマススペクトル（ＣＩＤスペクトル）の各々からピークリストを作成し（ステップ２０３）、構造推定部９３が、両ピークリストを用いたデータベース検索又はデノボシーケンシングによって被検核酸の構造推定を行う（ステップ２０４）。そして、表示処理部９４が、前記構造推定の結果を表示部９８に表示させる（ステップ２０５）。
　このように、被検核酸由来のプリカーサイオンに対して、不対電子誘導型の解離手法であるＨＡＤ法と、エネルギ蓄積型の解離手法であるＣＩＤ法とをそれぞれ適用してフラグメントイオンの情報を収集することにより、シーケンスカバレッジ（すなわち、被検核酸の塩基配列全体における配列が特定された部分の割合）の向上が期待できる。
　[態様]
　上述した複数の例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
（第１項）本発明の一態様に係る核酸の構造解析方法は、
　被検核酸由来のイオンが存在する空間に対して水素ラジカルを導入することによって該イオンを解離させ、それにより生成された複数のフラグメントイオンを質量分析することで前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報を収集するＨＡＤ－ＭＳｎ分析ステップと、
　前記ＨＡＤ－ＭＳｎ分析ステップで得られた前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報に基づいて、前記被検核酸の構造を推定する構造推定ステップと、
　を有するものである。
（第２項）第１項に記載の核酸の構造解析方法は、
　前記構造推定ステップにおいて、デノボシーケンシングによって前記被検核酸の塩基配列を推定するものであって、前記複数のフラグメントイオンの各々が核酸塩基又はヌクレオチドに対する化学修飾基を保持しているとの条件に基づいて前記デノボシーケンシングを行うものであってもよい。
（第３項）第１項に記載の核酸の構造解析方法は、
　前記構造推定ステップにおいて、複数の既知核酸の塩基配列を収録した核酸データベースに対するデータベース検索によって前記被検核酸の塩基配列を推定するものであって、前記複数のフラグメントイオンの各々が核酸塩基又はヌクレオチドに対する化学修飾基を保持しているとの条件を付して前記データベース検索を行うものであってもよい。
（第４項）第１項～第３項のいずれかに記載の核酸の構造解析方法は、
　前記ＨＡＤ－ＭＳｎ分析ステップにおいて、前記空間に水素ラジカルを導入する前又は導入した後の少なくとも一方の期間に、該空間に中性粒子を導入すると共に、該空間に存在する前記被検核酸由来のイオンを励振させて前記中性粒子に衝突させることによって、該イオンの解離を促進させるものであってもよい。
（第５項）第１項～第３項のいずれかに記載の核酸の構造解析方法は、
　前記被検核酸由来のイオンが存在する空間に対して中性分子を導入し、前記イオンを該中性分子と衝突させることによって該イオンを解離させ、それにより生成された複数のフラグメントイオンを質量分析することで前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報を収集するＣＩＤ－ＭＳｎ分析ステップ、
　を更に有し、
　前記構造解析ステップにおいて、前記ＨＡＤ－ＭＳｎ分析ステップで得られた前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報と、前記ＣＩＤ－ＭＳｎ分析ステップで得られた前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報と、に基づいて前記被検核酸の構造を推定するものであってもよい。
（第６項）第２項又は第３項に記載の核酸の構造解析方法は、
　前記ヌクレオチドに対する化学修飾基が、前記ヌクレオチドに含まれる糖に対する化学修飾基であるものとしてもよい。
（第７項）本発明の一態様に係る核酸の構造解析装置は、
　被検核酸由来のイオンが存在する空間に対して水素ラジカルを導入することによって該イオンを解離させ、それにより生成された複数のフラグメントイオンを質量分析することで前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報を収集するＨＡＤ－ＭＳｎ分析実行部と、
　前記ＨＡＤ－ＭＳｎ分析実行部で得られた前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報に基づいて、前記被検核酸の構造を推定する構造推定部と、
　を有するものである。
（第８項）第７項に記載の核酸の構造解析装置は、
　前記構造推定部が、デノボシーケンシングによって前記被検核酸の塩基配列を推定するものであって、前記複数のフラグメントイオンの各々が核酸塩基又はヌクレオチドに対する化学修飾基を保持しているとの条件に基づいて前記デノボシーケンシングを行うものであってもよい。
（第９項）第７項に記載の核酸の構造解析装置は、
　前記構造推定部が、複数の既知核酸の塩基配列を収録した核酸データベースに対するデータベース検索によって前記被検核酸の塩基配列を推定するものであって、前記複数のフラグメントイオンの各々が核酸塩基又はヌクレオチドに対する化学修飾基を保持しているとの条件を付して前記データベース検索を行うものであってもよい。
（第１０項）第７項～第９項のいずれかに記載の核酸の構造解析装置は、
　前記ＨＡＤ－ＭＳｎ分析部が、更に、前記空間に水素ラジカルを導入する前又は導入した後の少なくとも一方の期間に、該空間に中性粒子を導入すると共に、該空間に存在する前記被検核酸由来のイオンを励振させて前記中性粒子に衝突させることによって、該イオンの解離を促進させるものであってもよい。
（第１１項）第７項～第９項のいずれかに記載の核酸の構造解析装置は、
　前記被検核酸由来のイオンが存在する空間に対して中性分子を導入し、前記イオンを該中性分子と衝突させることによって該イオンを解離させ、それにより生成された複数のフラグメントイオンを質量分析することで前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報を収集するＣＩＤ－ＭＳｎ分析部、
　を更に有し、
　前記構造解析部が、前記ＨＡＤ－ＭＳｎ分析部によって収集された前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報と、前記ＣＩＤ－ＭＳｎ分析部によって収集された前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報と、に基づいて前記被検核酸の構造を推定するものであってもよい。
（第１２項）第８項又は第９項に記載の核酸の構造解析装置は、
　前記ヌクレオチドに対する化学修飾基が、前記ヌクレオチドに含まれる糖に対する化学修飾基であるものとしてもよい。
　第１項に記載の核酸の構造解析方法又は第７項に記載の核酸の構造解析装置によれば、様々な電荷のプリカーサイオンに対応できると共に、マススペクトルに基づく核酸の構造推定を容易に行うことが可能となる。
　第２項に記載の核酸の構造解析方法又は第８項に記載の核酸の構造解析装置によれば、前記複数のフラグメントイオンの各々が塩基脱離イオン又は化学修飾基が脱離したイオンである場合を考慮することなく前記データベース検索による被検核酸の構造推定を行うことができるため、該構造推定における計算量を抑えることができる。
　第３項に記載の核酸の構造解析方法又は第９項に記載の核酸の構造解析装置によれば、前記複数のフラグメントイオンの各々が塩基脱離イオン又は化学修飾基が脱離したイオンである場合を考慮することなく前記デノボシーケンシングによる被検核酸の構造推定を行うことができるため、該構造推定における計算量を抑えることができる。
　第４項に記載の核酸の構造解析方法又は第１０項に記載の核酸の構造解析装置によれば、ＨＡＤ－ＭＳｎ分析におけるプリカーサイオンの解離を促進することができるため、該分析のＳＮ比を向上して、構造推定の精度を高めることができる。
　第５項に記載の核酸の構造解析方法又は第１１項に記載の核酸の構造解析装置によれば、構造推定おけるシーケンスカバレッジを向上することができる。
１…イオン源
２…イオントラップ
３…飛行時間型質量分離部
４…イオン検出器
５…水素ラジカル供給部
６…ガス供給部
７…トラップ電圧発生部
８…制御部
９…データ処理部
９１…マススペクトル作成部
９２…ピーク抽出部
９３…構造推定部
９６…核酸データベース

Claims (12)

  1. 　被検核酸由来のイオンが存在する空間に対して水素ラジカルを導入することによって該イオンを解離させ、それにより生成された複数のフラグメントイオンを質量分析することで前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報を収集するＨＡＤ－ＭＳｎ分析ステップと、
    　前記ＨＡＤ－ＭＳｎ分析ステップで得られた前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報に基づいて、前記被検核酸の構造を推定する構造推定ステップと、
    　を有する核酸の構造解析方法。
  2. 　前記構造推定ステップにおいて、デノボシーケンシングによって前記被検核酸の塩基配列を推定するものであって、前記複数のフラグメントイオンの各々が核酸塩基又はヌクレオチドに対する化学修飾基を保持しているとの条件に基づいて前記デノボシーケンシングを行う請求項１に記載の核酸の構造解析方法。
  3. 　前記構造推定ステップにおいて、複数の既知核酸の塩基配列を収録した核酸データベースに対するデータベース検索によって前記被検核酸の塩基配列を推定するものであって、前記複数のフラグメントイオンの各々が核酸塩基又はヌクレオチドに対する化学修飾基を保持しているとの条件を付して前記データベース検索を行う請求項１に記載の核酸の構造解析方法。
  4. 　前記ＨＡＤ－ＭＳｎ分析ステップにおいて、前記空間に水素ラジカルを導入する前又は導入した後の少なくとも一方の期間に、該空間に中性粒子を導入すると共に、該空間に存在する前記被検核酸由来のイオンを励振させて前記中性粒子に衝突させることによって、該イオンの解離を促進させる、請求項１に記載の核酸の構造解析方法。
  5. 　前記被検核酸由来のイオンが存在する空間に対して中性分子を導入し、前記イオンを該中性分子と衝突させることによって該イオンを解離させ、それにより生成された複数のフラグメントイオンを質量分析することで前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報を収集するＣＩＤ－ＭＳｎ分析ステップ、
    　を更に有し、
    　前記構造解析ステップにおいて、前記ＨＡＤ－ＭＳｎ分析ステップで得られた前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報と、前記ＣＩＤ－ＭＳｎ分析ステップで得られた前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報と、に基づいて前記被検核酸の構造を推定する、請求項１に記載の核酸の構造解析方法。
  6. 　前記ヌクレオチドに対する化学修飾基が、前記ヌクレオチドに含まれる糖に対する化学修飾基である請求項２に記載の核酸の構造解析方法。
  7. 　被検核酸由来のイオンが存在する空間に対して水素ラジカルを導入することによって該イオンを解離させ、それにより生成された複数のフラグメントイオンを質量分析することで前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報を収集するＨＡＤ－ＭＳｎ分析実行部と、
    　前記ＨＡＤ－ＭＳｎ分析実行部で得られた前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報に基づいて、前記被検核酸の構造を推定する構造推定部と、
    　を有する核酸の構造解析装置。
  8. 　前記構造推定部が、デノボシーケンシングによって前記被検核酸の塩基配列を推定するものであって、前記複数のフラグメントイオンの各々が核酸塩基又はヌクレオチドに対する化学修飾基を保持しているとの条件に基づいて前記デノボシーケンシングを行う、請求項７に記載の核酸の構造解析装置。
  9. 　前記構造推定部が、複数の既知核酸の塩基配列を収録した核酸データベースに対するデータベース検索によって前記被検核酸の塩基配列を推定するものであって、前記複数のフラグメントイオンの各々が核酸塩基又はヌクレオチドに対する化学修飾基を保持しているとの条件を付して前記データベース検索を行う、請求項７に記載の核酸の構造解析装置。
  10. 　前記ＨＡＤ－ＭＳｎ分析部が、更に、前記空間に水素ラジカルを導入する前又は導入した後の少なくとも一方の期間に、該空間に中性粒子を導入すると共に、該空間に存在する前記被検核酸由来のイオンを励振させて前記中性粒子に衝突させることによって、該イオンの解離を促進させる、請求項７に記載の核酸の構造解析装置。
  11. 　前記被検核酸由来のイオンが存在する空間に対して中性分子を導入し、前記イオンを該中性分子と衝突させることによって該イオンを解離させ、それにより生成された複数のフラグメントイオンを質量分析することで前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報を収集するＣＩＤ－ＭＳｎ分析部、
    　を更に有し、
    　前記構造解析部が、前記ＨＡＤ－ＭＳｎ分析部によって収集された前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報と、前記ＣＩＤ－ＭＳｎ分析部によって収集された前記複数のフラグメントイオンのｍ／ｚの情報と、に基づいて前記被検核酸の構造を推定する、請求項７に記載の核酸の構造解析装置。
  12. 　前記ヌクレオチドに対する化学修飾基が、前記ヌクレオチドに含まれる糖に対する化学修飾基である請求項８に記載の核酸の構造解析装置。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015133259A1 (ja) * 2014-03-04 2015-09-11 株式会社島津製作所 イオン分析装置
JP2016223777A (ja) * 2015-05-27 2016-12-28 株式会社島津製作所 タンパク質又はペプチドの解析方法及び解析装置

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015133259A1 (ja) * 2014-03-04 2015-09-11 株式会社島津製作所 イオン分析装置
JP2016223777A (ja) * 2015-05-27 2016-12-28 株式会社島津製作所 タンパク質又はペプチドの解析方法及び解析装置

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TAKAYAMA MITSUO: "The Characteristics of In-source Decay in Mass Spectrometric Degradation Methods ῍Hydrogen-Attachment Dissociation (HAD)῍", JOURNAL OF THE MASS SPECTROMETRY SOCIETY OF JAPAN, vol. 50, no. 6, 1 January 2002 (2002-01-01), pages 337 - 349, XP093090866 *

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